段连宁[1]2000年在《优势化Ⅱ型同种异体T细胞对移植物抗宿主病和移植物抗白血病的作用》文中进行了进一步梳理移植物抗宿主病（GVHD）是同种异基因移植物中的免疫活性细胞（主要为T细胞），识别宿主抗原并对宿主产生的病理损伤状态。去除或灭活移植物中的T细胞可以将重症GVHD发生率从80％降至30％，但是移植失败率增加了20％，白血病的复发率提高了30％、感染率增加30％。显示了，移植物中的免疫活性细胞在移植后免疫和造血重建方面具有重要作用。新的发展方向是通过调节T淋巴细胞功能降低移植相关并发症和提高移植效果。 目的 通过体外训导的Ⅱ型T细胞（Th2、Tc2）移植，建立一种既降低急性GVHD又保留移植物抗白血病（GVL）效应的骨髓移植模式，并从杀伤细胞抑制性受体（KIR）/MHCⅠ识别角度探讨其分子机制，为GVHD的研究提供理论和实验依据。 方法 1.优势化Ⅱ型T细胞群的制备及其鉴定：体外在mIL-4（1000u/ml）、Ionomycin（5ug/ml）和ConA（5ug/ml）环境下，把C57BL/6~(11-26)鼠T淋巴细胞（CD_4~+、CD_8~+）训导为可产生Ⅱ类细胞因子IL-4的Th2和Tc2细胞群。分别采用夹心酶联免疫法（ELISA）和流式细胞仪（FCM）检测该细胞群产生IL-4的能力。 2.优势化Ⅱ型T细胞表达KIR（Ly49C、Ly49A）及其功能研究：用抗亲和素－生物素－过氧化物酶复合物法（ABC）和原位分子杂交组织化学OSHH）检测 Ly49A和 Ly49C的表达；用混合淋巴细胞反应（MLR）和 MTT方法分析调节 Ly49C对优势化的 T淋巴细胞增殖和对白血病杀伤活性的影响。 3．建立半相合同种异体骨髓移植的急性GVHD模型：以亲代C57BL／6”Ib鼠为供者，以 BALB／c X B6，F；”‘“（CB6F卜为受者，预处理条件为全身照射（TBI，60C。照射 9刀Gy人进行 T淋巴细胞混合骨髓细胞移植，建立急性GVHD模型。 4．建立半相合红白血病模型：把可移植的 H＜遗传背景的 EL96红白血病细胞静脉接种给CB6F；付川“鼠，建立F；汁’“红白血病模型，以观察GVL效应。 5．优势化＊型T细胞混合骨髓细胞移植对GVHD和GVL的影响：把体外训导的 C57BL伍卜比来源的 ThZ、To2细胞与其骨髓细胞按 10：ILb例K 10’11型 T细胞：SX 106骨髓细胞）混合后，移植给经过 TBI预处理的半相合的正常和荷红白血病CB6F；卜ZWh受鼠，以生存期、病理学改变等指标评价移植效果。同时，观察 Ly49A、Ly49C在 GVHD发生鼠表达状态，探讨KIR表达与GVHD或GVL的关系。 结果 1．在mIL叶、ConA和Ionomycin环境下体外培养4天即可使静息淋巴细胞mIL－4的分泌水平由低于20ug／ml提高到833．33土28．73u旮ml。优势化＊型 T细胞膜 mIL＊表达由 6．8土 1．2％提高到 29．3士 5．4％…wt0．of）。 2．优势化的＊型 T淋巴细胞的 Ly49CmRNA表达阳性率为 25．6士6．2％（静息T细胞＜3％卜 Ly49A的膜表达为22．5士4．9％（静息T细胞＜5％卜 FCM检测结果显示：Ly49C在＊型 T细胞表达阳性率 29．8 ．4－土4．3％，其中 CD／细胞表达阳性率为 10二土0．9％、CDS”细胞阳性表达率为 17．8土 l．3o。抗 Ly49C 单克隆抗体（5E6）可以使C57BL／6H二b．BALB／C””’‘之阳单向MLR和双向MLR的增衍活性分别提高ZI．5土3．4％和 13．8土1石％。5E6抗体使C57BL／6鼠＊型T细胞对EL9611细胞的杀伤活性提高 47．2土 8．5o。 3·所建立的半相合急性GVHD模刑（C57BL旧”二‘一CB6FI”2＼具有 100O发生 GVHD、死于 GVHD的时间集中在 17．2土 3．4天、病理表现典型等。 4CB6F；H“Zdlb红白血病模型己传 4代，静脉接种＊即可发病。发病时白血病细胞主要浸润肝、脾和骨髓。在每只鼠接种 10‘1’EL96ll细胞间，生存时间与接种细胞数成线性负相关（，－0．972）。 5．在半相合的GVHD模型（C57BL沁“工‘－CB6FI”屯d／、中 GVHD发生组的平均生存时间为 17刀 f 5＊ 5天，优势化＊型T细胞移植组GVHD发生时间延迟、程度减低，生存时间为 50刀土门二7天（Pwto刀5）。 6．在亢全异基因移植中（C57BL／6卜2‘一BLAB儿卜Zd），未进行移植的白血病对照组生存期10石土1．3天、环磷酚胺治疗组生存期18．7土4．2天、11型 T细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 36．9士 10．8人（P＜0刀5）。在半相合异基因优势化11性细胞移植中（C57BL历”－Zb、CB6Flll－Zd／b），未进行移植的白血病对照组生存期为12．3士2．8大、环磷酚胺治f组生存期为 17＊土 2石天、11型 T细胞混合骨髓细胞移植组生存期为 45刀土27．7天（p＜0．05），其中6／10只生存大于60天。 7．GVHD发生鼠的脾 T细胞中 Ly49A阳性表达细胞占 3．4士 1．l％、Ly49CmRNA阳性表达细胞占9．6土1石％。无GVHD发生鼠的脾T细胞中 Ly4gA阳性表达细胞为 22．5土3．8％（p＜0．ofL Ly49CmRNA”细胞为32．8土6．3％（prto．of）。 ·5－ 小结 1本研究所建?
刘希民[2]2002年在《H-2半相合小鼠CD34～+细胞混合TK基因转染的TK～+T细胞移植模型中治疗GVHD及其GVL效应的实验研究》文中认为异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)取得了很大成就，但仍有许多患者因为无合适供者而失去移植机会。HLA半相合移植可使更多的患者得到移植的机会，但因为HLA半相合移植后GVHD的发生率和死亡率均很高，严重限制了其临床应用。HLA半相合CD34~+细胞移植扩大了供者来源，而且因为纯化的CD34~+细胞中T细胞减少4～5个数量级，移植物抗宿主病(GVHD)发生率和严重程度都大为降低；移植后免疫抑制剂的应用减少和对肝、肺等器官毒性减轻，使早期移植相关死亡率下降。但去除T细胞削弱了移植物抗白血病(GVL)效应导致移植后复发率增高、移植失败的可能性增加、患者细胞免疫功能严重低下易出现致命感染。结果患者生存率与非去T移植相比并无提高。因此，如何在HLA半相合CD34~+细胞移植中保留T细胞的治疗作用并消除其副作用，是目前迫切需要解决的问题。 将TK基因(自杀基因)体外转染供者T细胞成为TK~+T细胞，然后和CD34~+细胞混合移植，一旦发生GVHD，则给予特异性药物丙氧鸟苷治疗，选择性杀死引起GVHD的TK~+T细胞，使GVHD得到控制，同时又可保留T细胞的治疗作用。这样，HLA半相合CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植既能保留该移植方法的优点，又能克服其不足。根据这一设想，本文进行H-2半相合小鼠CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植的实验研究，为HLA半相合CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植的临床应用奠定基础。 目的 建立H-2半相合CD34~+细胞及TK~+T细胞混合移植GVHD模型和GCV治疗GVHD模型；观察H-2半相合CD34~+细胞及TK~+T细胞混合移植的GVL效应。为临床HLA半相合TK~+T细胞和CD34~+细胞混合移植提供实验依据。 解放军总医院军医进修学院 博士学位论文 方法 1．提高逆转录病毒载体滴度 包装细胞GP＋E86 经120urn加 的衣霉素 （tunicamycin）处理18小时后，再用预先收集的病毒上清转染、G418筛选 后，收集病毒上清测定滴度。 2．转染方法的选择 测定共培养法、离心法、脂质体一病毒混合法和标准法 等4种转染方法转染率，选择一种操作简便且转染率较高的转染方法。 3．建立混合移植 GVHD模型 以亲代 C57BL／6（H－2‘，8）为供鼠，Blab／c X C57BL／6 CB6FI（H一 2‘’‘，Y）为受鼠，移植前 4～6小时”CO 9．OGy全 身致死量照射。mIL－2和 ConA刺激供鼠脾脏T细胞增殖、转染 TK基因。 的18筛选及扩增：兔疫磁珠法从供鼠骨髓分离＊的细胞，两者混合后移 植受鼠。 4．建立“V治疗混合移植GVHD模型移植后0天或7天给予“V治疗，剂 量均为 50mg－‘．kg－‘．dX7，腹腔注射。GCV治疗组与对照组比较并比较 2种 GCV应用方法的疗效。 5．观察混合移植WL效应静脉接种CB6FI ／J’鼠EL96ll红白血病细胞，建 立“6n红白血病模型；以红白血病m6n（早）为受鼠，“mU6（8） 为供鼠，移植方法同上，移植后7天给予GCV治疗GVHD，观察GVL效应。 结果 1．包装细胞 GP＋E86 经衣霉素处理后，应用 NIH3T3 测定病毒滴度为 6 X 10’cfu／ml，衣霉素处理前病毒滴度是 3．SX 10’cfu／。l。 2．共培养法、离心法、脂质体一病毒混合法和标准法的转染率分别是 32．33％士2．12％、18，72％士2．97％、9．43％士1．81％及6．64％士1．37％。离心法 转染率虽较共培养法低，但操作简便且无包装细胞污染，实验中采用这种 转染方法。 3．建立的混合移植模型经症状和病理检查100％发生急性GVHD。GVHD死亡 4 解放军总医院军医进修学院 搏士学位论文 时间集中在移植后 2～3周。TK“T细胞和 T细胞诱导 GVHD的能力无差别。 4．GCV治疗组小鼠生存时间较对照组明显延长，P＜0．of。移植后 7天和 0 天给予GCV，小鼠生存时间分别为40．5士8．4天及26．6士4．8天，P＜0．05， 表明移植后7天给予GCV疗效较好。 5．成功建立红白血病EL96ll CB6FI模型接种10’白血病细胞，CB6FI小鼠即 可发病。在白血病细胞 10’～10’之间，接种细胞数量和发病时间呈负相关 （r＝－0．91）。混合移植组和化疗组红白血病CB6FI／J’鼠平均生存时间分别为 45．6士7．5天和30．5士5．2天，P＜0．01，表明混合移植具有WL效应。 小结 1．应用衣霉素处理包装细胞GP十E86后，逆转录病毒载体滴度提高15倍。 2．建立了 H－2半相合 CD34”细胞和 TK”T细胞混合移植的急性 GVHD模型。 以往进行GCV泊疗H－2半相合小鼠急性GVHD的研究中，急性GVHD模型的 建立采用供鼠骨髓单个核细胞和 TK＼细胞移植。我们利用纯化的 CD34”细 胞代替骨髓单个核细胞混合TK＼细胞移植。这种移植模
师龙[3]2018年在《删除免疫检查点CTLA-4后CTL细胞抗结肠癌作用研究》文中认为世界范围内,结肠癌发病率和死亡率均位居前列,我国近年来发病率呈持续上升趋势,位居恶性肿瘤前十。结肠癌早期可以没有任何症状,而出现腹胀、消化不良及排便性状或习惯改变往往已进展到中晚期,因此大大增加大了其治疗难度。治疗仍以外科手术及术后辅助化疗为主。在生存期方面,临床IV期患者的生存率略大于10%。近年来,免疫治疗技术的突飞猛进为肿瘤治疗带来希望和曙光,本研究即希望使用细胞免疫疗法提高结肠癌的治疗效果。近年来,分子免疫学研究逐步揭示了肿瘤免疫微环境中调节细胞免疫应答的复杂机制。这些发现成功地通过抑制免疫检查点以启动抗肿瘤T细胞应答并引发持久的免疫反应。针对免疫检查点细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)的单克隆抗体已被FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤、肺癌等肿瘤。本研究旨在通过利用规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRSIPR)和CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Associated protein 9,Cas9)基因编辑技术删除细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)的免疫检查点CTLA-4,并对其体内外的抗肿瘤作用进行实验研究。本研究第一部分针对CTLA-4设计特异小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,质粒使用慢病毒载体转染至CTL,获得删除CTLA-4的CTL细胞(CTLA-4 KO CTL)并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。第二部分实验设计了CTLA-4 KO CTL细胞对靶细胞结肠癌HCT116细胞系的体外杀伤实验及对其凋亡的影响,同时检测了肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的分泌量。体外的实验结果为体内实验提供了良好的基础,但是体外和体内环境因素的差异可能对CTLA-4 KO CTL细胞发挥作用造成不同的影响,为此第三部分实验建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,模拟肿瘤患者的体内环境,建立结肠癌移植瘤小鼠模型后,给予CTLA-4 KO CTL细胞治疗,观察肿瘤的体积变化及小鼠的生存周期情况以评价其体内抗肿瘤的作用。第一部分构建慢病毒载体CRISPR/Cas9系统转染CTL细胞删除免疫检查点CTLA-4目的:使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL细胞的免疫检查点CTLA-4并验证其转染效率和删除效率。方法:针对CTLA-4设计sgRNA序列并构建sgRNA/Cas9质粒,质粒使用慢病毒包装后转染培养的CTL细胞并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。结果:1.设计sg RNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9系统。2.使用构建好的CRSIPR/Cas9系统转染CTL细胞,转染效率可达(28.80±0.62)%。3.转染后以Western blot及流式细胞术检测CTLA-4的删除效率,CTLA-4 KO CTL组的CTLA-4表达(0.91±0.25)%较CTL组(42.70±2.72)%显著降低(P<0.05)。4.慢病毒的转染方法对T细胞的增殖造成短暂的影响,经过后期细胞因子刺激培养后增殖活性恢复。小结:成功构建慢病毒载体的CRSIPR/Cas9系统,并成功转染CTL细胞,可有效删除CTLA-4基因,使CTLA-4表达显著降低。第二部分删除免疫检查点CTLA-4后CTL细胞的体外抗结肠癌作用研究目的:研究CTLA-4 KO CTL细胞体外抗肿瘤作用。方法:分别将实验组CTLA-4 KO CTL及对照组CTL与结肠癌细胞HCT116共培养后,WST-1法检测两组细胞的体外杀伤活性;流式细胞Annexin V/PI双染法检测肿瘤细胞凋亡;Western Blot检测肿瘤细胞凋亡蛋白表达;凋亡蛋白试剂盒检测肿瘤细胞凋亡蛋白活性;ELISA法检测细胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌量。结果:1.CTLA-4 KO CTL组相较于CTL组对结肠癌肿瘤细胞杀伤效率显著提高(P<0.05)。2.CTLA-4 KO CTL相较于CTL对结肠癌肿瘤细胞凋亡率显著提高(P<0.05)。3.CTLA-4 KO CTL相较于CTL可使结肠癌肿瘤细胞的凋亡蛋白表达和凋亡蛋白活性明显增加(P<0.05)。4.CTLA-4 KO CTL相较于CTL其TNF-α、IFN-γ分泌量显著提高(P<0.05)。小结:免疫检查点CTLA-4删除后可提高CTL在体外对结肠癌肿瘤细胞的杀伤和凋亡作用,并促进分泌TNF-α、IFN-γ。第三部分删除免疫检查点CTLA-4后CTL细胞的体内抗结肠癌作用研究目的:研究CTLA-4 KO CTL细胞对结肠癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法构建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达情况。人源化的NOD/SCID小鼠构建结肠癌移植瘤动物模型,成瘤后将动物随机分为2组进行实验,分别给予CTLA-4KO CTL(实验组)及CTL(对照组)鼠尾静脉回输细胞治疗,观察肿瘤的生长体积及小鼠的生存时间并检测移植瘤小鼠血清TNF-α及IFN-γ的分泌水平。结果:1.人源化的NOD/SCID小鼠外周血中检测到人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达,表达比率与正常人相似,表明人源化成功。2.CTLA-4 KO CTL组小鼠肿瘤体积较CTL组被显著抑制(P<0.05)。3.CTLA-4 KO CTL组小鼠相较于CTL组生存时间明显延长(P<0.05)。4.与CTL组相比,CTLA-4 KO CTL组移植瘤小鼠血清TNF-α及IFN-γ的分泌水平明显增高(P<0.05)。小结:采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并在此基础上制造结肠癌移植瘤模型。CTLA-4 KO CTL可使肿瘤体积明显缩小,明显延长移植瘤小鼠生存周期并显著提高其TNF-α及IFN-γ的分泌水平结论:慢病毒载体CRSIPR/Cas9系统是一种有效的基因编辑手段,成功的在CTL细胞中删除了免疫检查点CTLA-4,CTLA-4 KO CTL可以显著增强CTL对结肠癌的抗肿瘤作用。
参考文献：
[1]. 优势化Ⅱ型同种异体T细胞对移植物抗宿主病和移植物抗白血病的作用[D]. 段连宁. 第一军医大学. 2000
[2]. H-2半相合小鼠CD34～+细胞混合TK基因转染的TK～+T细胞移植模型中治疗GVHD及其GVL效应的实验研究[D]. 刘希民. 中国人民解放军军医进修学院. 2002
[3]. 删除免疫检查点CTLA-4后CTL细胞抗结肠癌作用研究[D]. 师龙. 河北医科大学. 2018
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