吴艳涛[1]2000年在《新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因和表达该基因的重组鸡痘病毒》文中认为新城疫（ND）是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，而新城疫病毒（NDV）F_(48)E_8株则是中国的标准嗜内脏速发型强毒。为了明确NDV F_(48)E_8株的致病机理，同时也为了研制免疫保护率高、保护期长的ND基因工程疫苗，本研究对与F_(48)E_8株致病性和免疫原性密切相关的融合蛋白（F）基因进行了克隆、序列分析，构建了表达该基因的重组鸡瘟病毒（rFPV），并测定了rFPV的免疫效力。现从四个方面概述如下： 一、以酚－SDS法提纯的NDV F_(48)E_8株基因组RNA为模板，采用反转录聚合酶链反应（RT－PCR），分别扩增到长为926bP的糖蛋白基因片段和长为1710bP的F基因。以Digoxigenin标记的糖蛋白基因核酸探针能特异性地检测NDV基因组RNA，而与其它病毒RNA不发生反应。F基因RT－PCR产物则被插入到质粒载体的多克隆位点，经酶切分析和Southern分子杂交筛选到阳性重组质粒克隆pF37。 二、对NDV F_(48)E_8株F基因的序列进行全面分析。该基因编码由553个氨基酸组成的F_0前体。在第116－117位氨基酸处，F_0被切割成F1和F2多肽；切割位点的序列为RRQRR↓F，含两对碱性氨基酸，具有强毒株的特征。F_0中有3个主要由疏水性氨基酸组成的区域，其中F_2多肽N端起信号肽作用，介导蛋白质跨膜转位；F1多肽的N端是起融合作用的主要部位，亦称融合多肽；F1亚单位的C端为跨膜区。F蛋白中有两个七肽重复序列（HR1和HR2），HR1紧邻融合多肽的C端，HR2则靠近跨膜区的N端，它们能形成α螺旋结构和相互作用的疏水性界面。在F_0氨基酸序列中，发现6个可糖基化位点和12个半胱氨酸残基。F_(48)E_8株和Miyadera株、Texas GB株F_0的氨基酸同源性分别为93.64％和92.41％。根据F蛋白的酶切位点分布，F_(48)E_8株被归于基因Ⅲ型；在遗传发生上和AUS Victoria株、Miyadera株距离较近，是第一次ND世界范围内大流行的代表毒株。F_(48)E_8株和近年来国内流行的野外分离株之间，F蛋白表现出较高的同源性，主要功能区保守，因此F基因可以作为基因工程疫苗的目的基因。 三、经一系列步骤将NDV F_(48)E_8株F基因定向导入鸡痘病毒FPV插入载体pFG1175—1中痘苗病毒启动子P7.5的下游，得到转移载体pFGF1175—1。以转移载体和脂质体共转染FPV中国疫苗株282E4感染的鸡胚成纤维细胞，经多次蓝斑筛选和克隆纯化，得到稳定生长的重组鸡痘病毒rFPV－NDF。间接免疫荧光试验证实，rFPV－NDF感染的鸡胚成纤维细胞中表达了NDV的F基因。 四、评价了表达 NDV F。sEs株 FhN和 NP基因的 rFPV—NDF、rFPV一 NDHN和rFPV—NDNP的免疫效力。在用SPF鸡进行的免疫效力试验中，28日 龄的试验鸡接种rFPV—NDF和rFPV—NDHN后，能产生对大剂量NDV强毒 攻击的抵抗，保护率分别达 96．7％和 93．3％。将 rFPV—NDF和 rFPV—NDHN 结合使用并没有进一步提高保护率。从接种 rFPV—NDF和 rFPV—NDHN的试 验鸡血清样品中检测出中和抗体，效价达1：27。和Lasota疫苗一样，NDV强毒仍 能在rFPV免疫鸡体内复制。本试验还证实，rFPV—NDNP不能使接种鸡产生中 和抗体和对强毒攻击的保护作用。 在用含NDV母源抗体的商品肉鸡进行的免疫效力试验中，rFPV免疫鸡同样 显示了对NDV强毒攻击的抵抗力＊日龄雏鸡接种疫苗后／FpV—NDFJFpV一 NDHN、rFPV—NDF／rFPV—NDHN和Lasota分别产生80．0％、60．0％、64．0％ 和 72．0％的保护率，以 rFPV—NDF产生的保护率最高。rFPV免疫鸡的NDV HI 抗体消长规律和未注射疫苗的健康对照组相似，rFPV—NDHN免疫鸡也没有产 生高效价HI抗体，说明rFPV的免疫效力一部分是由于记忆性B细胞和细胞免 疫提供。 在用含NDV母源抗体的商品肉鸡进行的rFPV—NDF二次免疫效力试验 中，两次均以 rFPV—NDF免疫的鸡群和先后以 rFPV—NDF和 Lasota免疫的鸡 群能产生完全的保护率；而先接种Lasota，后接种rFPV—NDF及Lasota的鸡群 产生的保护率为95％。rFPV—NDF受NDV抗体的干扰较小，一次接种可产生 足够的免疫记忆，再次接种能激发强烈的免疫反应，展示了其作为侯选疫苗毒株 的可能性。
吴艳涛[2]2000年在《新城疫病毒F_（48）E_8株融合蛋白基因和表达该基因的重组鸡痘病毒》文中指出新城疫(ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一,而新城疫病毒(NDV)F_(48)E_8株则是中国的标准嗜内脏速发型强毒。为了明确NDV F_(48)E_8株的致病机理,同时也为了研制免疫保护率高、保护期长的ND基因工程疫苗,本研究对与F_(48)E_8株致病性和免疫原性密切相关的融合蛋白(F)基因进行了克隆、序列分析,构建了表达该基因的重组鸡痘病毒(rFPV),并测定了rFPV的免疫效力。现从四个方面概述如下: 一、以酚—SDS法提纯的NDV F_(48)E_8株基因组RNA为模板,采用反转录聚合酶链反应(RT—PCR),分别扩增到长为926bp的糖蛋白基因片段和长为1710bp的F基因。以Digoxigenin标记的糖蛋白基因核酸探针能特异性地检测NDV基因组RNA,而与其它病毒RNA不发生反应。F基因RT—PCR产物则被插入到质粒载体的多克隆位点,经酶切分析和Southern分子杂交筛选到阳性重组质粒克隆pF37。 二、对NDV F_(48)E_8株F基因的序列进行全面分析。该基因编码由553个氨基酸组成的F_0前体。在第116—117位氨基酸处,F_0被切割成F1和F2多肽;切割位点的序列为RRQRR↓F,含两对碱性氨基酸,具有强毒株的特征。F_0中有3个主要由疏水性氨基酸组成的区域,其中F_2多肽N端起信号肽作用,介导蛋白质跨膜转位;F1多肽的N端是起融合作用的主要部位,亦称融合多肽;F1亚单位的C端为跨膜区。F蛋白中有两个七肽重复序列(HR1和HR2),HR1紧邻融合多肽的C端,HR2则靠近跨膜区的N端,它们能形成α螺旋结构和相互作用的疏水性界面。在F_0氨基酸序列中,发现6个可糖基化位点和12个半胱氨酸残基。F_(48)E_8株和Miyadera株、Texas GB株F_0的氨基酸同源性分别为93.64%和92.41%。根据F蛋白的酶切位点分布,F_(48)E_8株被归于基因Ⅲ型;在遗传发生上和AUS Victoria株、Miyadera株距离较近,是第一次ND世界范围内大流行的代表毒株。F_(48)E_8株和近年来国内流行的野外分离株之间,F蛋白表现出较高的同源性,主要功能区保守,因此F基因可以作为基因工程疫苗的目的基因。 三、经一系列步骤将NDV F_(48)E_8株F基因定向导入鸡痘病毒FPV插入载体pFG1175—1中痘苗病毒启动子P7.5的下游,得到转移载体pFGF1175—1。以转移载体和脂质体共转染FPV中国疫苗株282E4感染的鸡胚成纤维细胞,经多次蓝斑筛选和克隆纯化,得到稳定生长的重组鸡痘病毒rFPV—NDF。间接免疫荧光试验证实,rFPV—NDF感染的鸡胚成纤维细胞中表达了NDV的F基因。
吴艳涛, 彭大新, 刘秀梵, 刘伟忠, 张如宽[3]2000年在《表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力》文中研究说明将新城疫病毒 (NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒 (FPV)插入载体 pFG1175 1的P7 5启动子下游 ,得到转移载体pFG1175 1重组质粒。采用脂质体转染技术 ,将该质粒转染FPV2 82E4株感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。经过多次蓝斑筛选纯化 ,获稳定的重组病毒rFPV NDF。间接免疫荧光试验表明 ,rFPV NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV NDF免疫的SPF试验鸡能产生对NDV强毒攻击的免疫力 ,保护率达96 3%。
吴艳涛, 彭大新, 刘秀梵, 刘伟忠, 张如宽[4]2000年在《表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力》文中进行了进一步梳理将新城疫病毒(NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒(FPV)插入载体pFG1175-1的P7.5启动子下游,得到转移载体pFGF1175-1重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)。经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光试验表明,rFPV-NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV-NDF免疫的SPF试验鸡能产生对NDV强毒攻击的免疫力,保护率达96.3%。
徐志伟[5]2002年在《表达新城疫病毒F_（48）E_8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力检测》文中提出新城疫(ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，而新城疫病毒(NDV)F_(48)E_8株则是中国的标准强毒。为了研制有效的ND基因工程疫苗，本实验构建了表达NDV F_(48)E_8株融合蛋白(F蛋白)基因的重组鸡痘病毒(rFPV)，并测定了rFPV的免疫效力，为NDV基因工程苗今后的开发提供了试验基础。现将本实验所做的工作从两个方面概述如下： 1．从含有NDV F_(48)E_8 F基因的质粒PE1／E2-3，运用PCR法扩增的F基因，并将基因定向克隆到转移载体pEFgpt12S的Ecogpt基因下游，构建成转移载体pEF-2。以磷酸钙转染的方法转染含有F基因的重组鸡痘病毒rFPVNDF感染的鸡胚成纤维细胞，经有限稀释法挑取病毒蚀斑，；利用MXHAT培养基而进行负性筛选，得到了稳定生长新的重组鸡痘病毒rFPV-2。该重组毒具有两个F基因。间接免疫荧光试验表明，rFPV-2感染的鸡胚成纤维细胞中表达了NDV的F基因，与rFPVNDF相比，荧光数目更多，表明F蛋白的表达量更大。 2．评价了重组毒rFPV-2、rFPVNDF的免疫效力。在用SPF鸡进行的一次免疫效力试验中，9日龄的试验鸡接种rFPV-2和rFPVNDF后，能产生对大剂量NDV强毒的保护，保护率分别为50％和43％。将rFPV-2和Lasota结合使用保护率和疫苗对照组Lasota相同。从接种rFPV-2和rFPVNDF的试验鸡中检测出了中和抗体。在用用SPF鸡进行的二次免疫效力试验中rFPV-2和rFPVNDF产生的保护率为79％和64％，而rFPV-2和Lasota结合使用保护率超过了对照组Lasota，达到了100％。
参考文献：
[1]. 新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因和表达该基因的重组鸡痘病毒[D]. 吴艳涛. 扬州大学. 2000
[2]. 新城疫病毒F_（48）E_8株融合蛋白基因和表达该基因的重组鸡痘病毒[D]. 吴艳涛. 扬州大学. 2000
[3]. 表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[J]. 吴艳涛, 彭大新, 刘秀梵, 刘伟忠, 张如宽. 生物工程学报. 2000
[4]. 表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力[C]. 吴艳涛, 彭大新, 刘秀梵, 刘伟忠, 张如宽. 中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集. 2000
[5]. 表达新城疫病毒F_（48）E_8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力检测[D]. 徐志伟. 南京农业大学. 2002
标签：生物学论文; 畜牧与动物医学论文; 新城疫论文; 融合蛋白论文; 融合基因论文; 重组蛋白论文; 氨基酸论文; ndf论文;