付畅[1]2003年在《酵母盐胁迫应答基因的克隆及表达分析》文中研究表明日益严重的土壤盐渍化使通过遗传工程手段提高植物的耐盐性成为未来环境和农业发展需要迫切优先解决的问题。过去的研究工作在鉴定和分离一些在植物耐盐过程中有潜力的基因方面取得了显着的进展。为了了解盐胁迫应答反应的分子基础，分离到关键的耐盐基因，本研究克隆了盐诱导酵母ESTs和酵母耐盐基因HAL1，并对其表达进行了分析。 以鲁氏酵母菌(Zgoccharomyces.rouxii)菌株AS2.181为实验材料，以盐胁迫处理的鲁氏酵母细胞和未经胁迫处理的酵母细胞构建了抑制性消减杂交文库。运用一种高效的以PCR技术为基础的cDNA消减杂交方法构建了鲁氏酵母的盐胁迫应答差异表达ESTs文库。随机挑取cDNA克隆进行了测序分析和序列同源性比较。在所分析的序列中找到部分序列与数据库中已知的序列有同源性，其中部分序列与已知序列同源性较高，相应的已知序列与耐盐有关。其余同源性较低的序列以及和数据库中的已知序列没有任何同源性的序列可能是与耐盐相关的新序列 本研究还从酿酒酵母菌菌株AS2.375中克隆了酿酒酵母HAL1基因。HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以农杆菌介导的叶圆盘法将HAL1基因转化烟草植株。筛选到的转HAL1基因转化烟草植株的耐盐性明显高于对照。通过比较转HAL1基因烟草植株与转其它耐盐基因烟草植株的耐盐性，发现转HAL1基因烟草植株的耐盐性虽然明显高于对照，但却低于表达渗透调节剂合成酶基因的转基因植株。结果表明，单独转化HAL1基因对烟草植株耐盐性的提高是有限的。HAL1基因可被渗透胁迫诱导表达对Na~+离子外排起重要作用，但对渗透胁迫却无耐性，因而转化HAL1基因的烟草植株对盐性的提高是有限的。渗透胁迫和离子胁迫是盐胁迫是不可忽视的两个重要方面，以HAL1基因和耐渗透胁迫基因的复合基因转化策略极有希望使转基因植物的耐盐性得到大幅度提高。
黄骥[2]2005年在《水稻非生物胁迫相关锌指蛋白基因的克隆与功能分析》文中进行了进一步梳理高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长发育和作物高产的重要限制因素。很多研究集中于分离和鉴定在各种非生物胁迫下增强表达的基因，并期望通过了解这些基因运作的分子机制进而利用这些基因进行基因工程改良，帮助植物抵御各类非生物胁迫，而转录因子在植物的胁迫应答中发挥了至关重要的作用，在植物的基因工程改良中也得到了人们的重视。迄今为止，人们已经在多种植物中分离了大量的非生物胁迫相关转录因子基因，其编码产物几乎囊括了转录因子的各种类型。其中AP2／EREBP转录因子中的DREB亚家族在植物胁迫应答反应中占据着核心地位。 锌指蛋白是一类具有指状结构域的转录因子，主要通过与DNA、RNA的结合或与其它蛋白质的相互作用调控目的基因的表达。锌指蛋白广泛的分布于人类和动植物中。根据锌指蛋白的结构特征和功能差异又可将锌指蛋白分为TFⅢA家族、WRKY家族、GATA家族、DOF家族、PHD家族等。随着基因组测序计划的不断完成，也有越来越多的具有锌指结构的锌指蛋白基因被发现。本文主要是针对锌指蛋白在植物非生物胁迫反应的作用为研究方向，分离了3类胁迫相关的锌指蛋白基因，取得了以下一些研究进展。 首次从单子叶植物水稻中分离了TFⅢA型胁迫相关锌指蛋白基因ZFP18、ZFP245。表达分析表明ZFP18受低温、干旱、高盐和ABA的诱导，而ZFP245仅受低温和干旱的诱导。将ZFP18的启动子融合GUS报告基因转化烟草植株，组织化学检测表明正常生长条件下ZFP18的启动子在烟草幼苗的根、茎以及叶片中都无法检测到GUS报告基因的表达，在NaCl和KCl处理条件下转基因烟草叶盘中GUS高度表达，此外在NaCl处理的根的维管束中也检测到了报告基因的表达，但在其它处理条件下(4℃、20％PEG6000)以及二价阳离子胁迫(Mg~(2+)，Zn~(2+)，Cd~(2+))下没有检测到GUS的活性，推测单双子叶中以ZFP18参与的植物对单价阳离子胁迫的响应途径可能类似，但对渗透胁迫的响应可能有所不同。获得了ZFP245过量表达的烟草转基因植株，取转基因植株的叶盘进行耐逆性检测，结果表明转基因植株叶盘提高了对400mM NaCl以及20％PEF6000的耐受性。综合研究结果表明ZFP18和ZFP245在植物的非生物胁迫应答反应中发挥重要的调控作用，说明单子叶植物中也存在TFⅢA型锌指蛋白参与的环境胁迫信号传导途径。 从水稻中分离了受多种胁迫负调节的锌指蛋白基因SRZ1。SRZ1的表达受低温、干旱、高盐以及ABA的负调控。序列分析和同源建模表明SRZ1可能是RNA结合蛋白。组织表达分析表明SRZ1在检测的根、茎、叶片中组成型表达，而SRZ2在叶片中高丰度表达，在根和穗中的表达量较低。表达分析表明，SRZ1、SRZ2受低温、干
史仁玖[3]2005年在《多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析》文中研究指明多枝赖草(Leymus mul ticaulis＜Kar1 & Kir1＞Tzvel 1，2n=4X=28，XmXmNsNs)属于小麦近缘属赖草属，分布于欧亚地区不同的生态环境下，我国主要分布于新疆地区，生长于平原绿洲和盐渍化荒漠草甸，具有突出的耐瘠薄、耐盐碱性、耐寒性等特性。开展多枝赖草抗逆分子生物学研究，分离耐盐相关基因，对于农作物的耐盐育种具有重要意义。本研究以盐胁迫下的多枝赖草叶片为材料，改良了多枝赖草叶片总RNA提取方法，建立了适合多枝赖草的mRNA差异显示体系，分离与分析耐盐相关基因cDNA序列，克隆谷胱甘肽还原酶基因。结果如下： 采用四种方法提取多枝赖草叶片总RNA(异硫氰酸胍法、SDS法、CTAB法和TRIZOL试剂快速提取法)，结果表明：TRIZOL提取法提取的RNA产量较低，电泳呈现出28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA叁条清晰的条带，A_(260)／A_(280)为1.845，A_(260)／A_(230)为2.091，表明RNA的纯度很高。而另外叁种方法获得的RNA纯度低，有降解现象。用TRIZOL法提取的RNA作为模板，可以扩增出组成型Actin基因片段，表明提取的多枝赖草叶片总RNA能够满足分子生物学研究需要。 通过对退火温度、模板用量、Taq酶和Mg~(2+)浓度的优化，建立了适合多枝赖草基因差异显示的DDRT-PCR体系。选用26个随机引物，分别与3个锚定引物组合成引物对，进行盐胁迫下多枝赖草mRNA差异显示，获得17个长度在300～600bp的差异cDNA条带，进行序列测定及分析。反Northern杂交分析筛选出11个阳性片段。 GenBank／BLAST分析，DNA片段1编码的蛋白与腺苷酸结合蛋白有29％的相似，这与DNA的表达调节有关；cDNA片段2编码的蛋白质与与UMP／CMP kinase 42％相似，UMP／CMP kinase与核苷酸的磷酸化有关，在信号传导方面起作用cDNA片段4编码的蛋白质与S9蛋白有49％的相似性，S9蛋白具有清除活性氧的功能，而活性氧是各种水分胁迫的主要伤害
陈良[4]2011年在《油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究》文中进行了进一步梳理油菜是重要的油料作物,种子的含油量占其干重的35%-45%。菜油也是非常好的食用油,含有丰富的脂肪酸。菜油也是重要的工业原料,是我国发展生物柴油的理想的原料来源之一。因此大力发展油菜,提高油菜含油量,不仅能为我国能源安全战略作出重要贡献,还将有助于保障我国的粮食安全,促进农民增收,具有十分重要的战略意义。然而,油菜经常受到高盐、干旱、低温和营养缺乏(如低磷、低钾)等不良非生物胁迫的严重破坏,造成油菜产量严重下降。通过基因工程手段将一些具有抗逆功能的基因导入植物基因组进而获得抗逆新品种,这为传统育种模式的改革带来了新的契机。与拟南芥、水稻等传统模式植物相比,油菜中抗逆基因的鉴定和抗逆机制的研究还比较少。因此,筛选和鉴定油菜中与抗逆相关的基因,分析揭示其抗逆分子机制,可以为通过基因工程手段来改良油菜抗逆性提供了新的科学依据。本研究采用Macroarray技术,从油菜cDNA文库中筛选了参与高盐、干旱胁迫应答的基因,并对一些感兴趣的目标基因进行了深入的研究。主要结果如下：1.通过Macroarray技术从油菜cDNA文库中筛选鉴定参与高盐、干旱胁迫应答的基因采用Macroarray技术,从油菜cDNA文库中共筛选得到313个参与盐胁迫应答的基因(172个受到高盐胁迫的诱导,141受到高盐胁迫的抑制表达)；477个参与干旱胁迫应答的基因(288个受到干旱胁迫的诱导,189个受到干旱胁迫的抑制表达)；154个基因受到高盐和干旱两种胁迫的双重诱导；104个基因受到高盐和干旱两种胁迫的抑制表达。这也说明高盐胁迫和干旱胁迫之间存在着共同的调控系统或信号交叉。2.高盐干旱胁迫应答基因的表达模式分析从上述胁迫诱导表达的候选基因中选取了13个基因做进一步的研究。这些基因编码的蛋白分属于六个蛋白家族：蛋白激酶家族(MAPKKK和CIPK)、金属硫蛋白家族、生长素应答或抑制蛋白家族、脂类转运蛋白、直接和胁迫相关的蛋白、代谢酶类。实时定量RT-PCR分析了这13个基因在盐胁迫、干旱胁迫的表达模式,同时也分析了6个基因在ABA处理下的表达模式。结果如下：13个基因中,有7个基因的表达受到盐胁迫的诱导；12个基因的表达受到甘露醇(模拟干旱胁迫)的诱导,其中包括6个受盐胁迫诱导的基因；进一步的研究揭示5个受干旱胁迫诱导的基因也受ABA的显着诱导。这些结果进一步表明干旱和高盐胁迫信号、干旱与ABA信号通路之间存在着交叉。组织表达分析结果显示,这13个基因可能在油菜的不同组织器官发育中也发挥着重要的作用。3.冷调节基因BnCOR25的表达分析及功能鉴定我们从候选的288个干旱诱导的基因中,鉴定了一个新型的编码冷调节蛋白的基因,该基因编码蛋白的分子量为25KD,因此我们将其命名为BnCOR25 (GeneBank号为HM187577)。实时定量RT-PCR结果显示BnCOR25基因主要在下胚轴、子叶、茎和花中表达,但是在根和叶子中表达量较低。Northern杂交证实BnCOR25基因的表达受到干旱和冷胁迫的显着诱导。研究结果还揭示BnCOR25基因的表达是受ABA信号通路调节的。BnCOR25蛋白主要定位于细胞膜上和细胞质中。过量表达BnCOR25基因增强了裂殖酵母细胞在冷胁迫下的存活率；过量表达BnCOR25的转基因拟南芥增强了对冷胁迫的耐受性。这些结果暗示该基因可能在赋予植物对冷胁迫耐受性中起一定的作用。4. BnCIPK6基因的表达鉴定和启动子活性分析在154个受干旱和高盐胁迫诱导的候选基因中,其中有一个基因编码的蛋白和拟南芥CIPK蛋白激酶家族的成员CIPK6有很高的同源性,因而被命名为BnCIPK6。BnCIPK6基因的表达受到高盐胁迫、渗透胁迫、低磷胁迫、ABA和BL的显着诱导。组织表达分析结果显示,BnCIPK6基因主要在花中表达,在子叶中适度表达,而在其它组织中表达水平较低。我们分离得到了约850bp长度的BnCIPK6启动子片段,组织化学染色分析揭示12天苗龄的拟南芥小苗,下胚轴和子叶中均有很强的GUS信号,而在其它组织中很弱或者检测不到GUS信号；胁迫处理分析揭示BnCIPK6基因的启动子是受高盐、渗透胁迫、ABA和BL诱导的。5. BnCIPK6互作蛋白的筛选及鉴定酵母双杂交结果显示BnCIPK6可以与拟南芥的CBL1,CBL2, CBL3和CBL9发生相互作用。将BnCIPK6蛋白作为诱饵蛋白筛选油菜cDNA文库,得到27种与其相互作用蛋白,这些互作蛋白涉及到植物生长发育、代谢及信号转导等多个方面。其中包括两个CBL蛋白,分别与AtCBL1和AtCBL3蛋白同源,我们将和AtCBL1同源性较高的油菜CBL蛋白,命名为BnCBL1, BiFC实验也证明了BnCIPK6和BnCBLl蛋白在体内的相互作用。6. BnCIPK6和BnCBL1蛋白的亚细胞定位及BnCIPK、BnCIPK6T182D蛋白的体外磷酸化分析亚细胞定位研究显示BnCIPK6蛋白在细胞膜、细胞质及细胞核中均有分布,而BnCBL1蛋白定位于细胞膜上。体外激酶磷酸化分析揭示点突变的BnCIPK6T182D蛋白-BnCIPK6(M),相对BnCIPK6蛋白自磷酸化能力更强,表明182位的苏氨酸残基是蛋白激活的关键位点。7. BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1过量表达转基因拟南芥均显着增强了对盐胁迫、低磷胁迫的耐受性为研究BnCIPK6及BnCBLl基因的功能,我们分别构建了BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBLl过量表达载体并转化了拟南芥,筛选获得转基因植株。分别选取这些外源基因在拟南芥中表达量较高的纯合株系做表型分析及功能研究。结果显示BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1转基因拟南芥均显着增强了对盐胁迫、低磷胁迫的耐受性。结果说明BnCBL1-BnCIPK6可能通过功能性的相互作用来参与植物对高盐、低磷胁迫的应答。8. BnCIPK6和BnCIPK6(M)的过量表达转基因拟南芥增强了对ABA的敏感性我们分析了转基因植株对ABA的应答,结果显示BnCIPK6和BnCIPK6(M)的过量表达转基因拟南芥均增强了对ABA的敏感性,尤其是后者显示出了对ABA的超敏性。ABA相关的Marker基因包括RD29A, ABF3, ABF4在ABA处理后的BnCIPK6(M)的转基因拟南芥中的表达量显着升高。而我们并未观察到过量表达BnCBLl的转基因拟南芥对ABA应答的改变。上述结果表明BnCIPK6参与了对ABA的应答,而BnCBL1没有参与ABA的应答,暗示可能存在和BnCIPK6相互作用的其它CBL蛋白,参与并介导了对ABA的应答。9. BnCIPK6(M)的过量表达转基因拟南芥植株对BR应答改变,且提高了对BR合成抑制剂BRZ的敏感性BnCIPK6(M)过量表达转基因植株改变了对油菜素内酯(BR)的应答,提高了对BRZ的敏感性。而我们并未观察到BnCIPK6和BnCBLl过量表达转基因拟南芥对BR应答表型的改变。这说明激活形式的BnCIPK6可能参与了BR的信号,同样暗示可能存在和BnCIPK6相互作用的其它CBL蛋白,参与并介导了对BR的应答。10.拟南芥cipk6功能缺失突变体减弱了对ABA的应答、对盐胁迫和低磷胁迫更加敏感对拟南芥cipk6功能缺失突变体的研究发现,cipk6突变体对盐胁迫和低磷胁迫更加敏感,对ABA的敏感性下降,这也说明AtCIPK6基因参与了对盐、低磷胁迫及ABA的应答。
赵阳[5]2013年在《玉米HD-Zip转录因子家族抗旱相关基因的鉴定及Zmhdz10功能分析》文中研究说明玉米是世界上重要的粮食作物之一，干旱、盐渍、低温等非生物胁迫对玉米的生长造成了严重的影响，也是限制其产量的主要胁迫因素，抗逆育种一直是重要的育种目标。挖掘抗逆相关功能基因并利用这些基因培育抗逆新品种是应对逆境胁迫，提高玉米产量的最为有效途径。研究表明，转录因子在提高作物对胁迫的耐受性过程中起到了重要作用。过量表达特定的胁迫应答转录因子可以调控多个下游抗逆功能基因的同时表达，从而使作物获得良好的综合改良效果。目前，这种方法已经成为植物抗逆遗传改良育种中的研究热点。同源异型-亮氨酸拉链(HD-Zip)蛋白是高等植物特异的一类转录因子，参与了植物的胁迫应答和生长发育调控。因此，挖掘胁迫应答HD-Zip基因对开展玉米抗逆改良育种具有重要的意义。本研究运用生物信息学的方法对玉米全基因组HD-Zip基因进行鉴定，分析这些基因的结构特点、进化关系以及干旱诱导表达模式，并通过过量表达技术对玉米Zmhdz10基因在植物非生物胁迫应答过程中的功能及作用机制进行了研究，获得了如下主要结果：1.通过Blast同源搜索，共鉴定了55个非重复的玉米HD-Zip基因家族成员并从基因结构和进化等方面进行了分析。研究发现，玉米HD-Zip家族的大部分基因序列高度保守，与拟南芥和水稻HD-Zip基因在结构上不存在明显差异。根据进化关系，55个玉米HD-Zip基因被进一步分为4个亚族(I-IV)。染色体定位分析显示，55个基因在10条染色体上的分布是非随机的。对玉米HD-Zip基因复制事件进行分析，发现参与片段复制的基因占玉米HD-Zip基因总数的62%，表明片段复制对玉米HD-Zip基因数量的扩张起到了重要作用。2.对17个HD-Zip I基因上游2kb启动子序列的抗逆相关顺式作用元件(ABRE，LTRE和DRE)进行了分析，发现除Zmhdz16外，其余16个基因的启动子区域均含有1到多个抗逆相关顺式作用元件。对复制基因启动子区域内的3种顺式作用元件的分布进行比较，发现叁种顺式作用元件在复制基因启动子区域内的数量和位置有较大的差异。利用荧光定量PCR方法对HD-Zip I基因的干旱诱导表达模式进行了分析，发现有12个基因的表达显着上调，其它5个基因表达下调。对复制基因的干旱诱导表达模式进行比较，发现复制基因的表达模式总体较为相似，说明这些基因可能存在着基因功能的冗余现象。3.根据进化关系和干旱诱导表达模式，筛选了一个受干旱强烈诱导表达的候选基因Zmhdz10并从玉米自交系B73中克隆了该基因。序列分析显示，Zmhdz10基因cDNA全长为825bp，编码274个氨基酸，与玉米B73数据库中公布的序列完全一致。进一步的表达分析发现Zmhdz10的表达还受到盐和外源ABA的诱导。组织表达模式分析显示，Zmhdz10在根、茎、叶、果穗、雄花序、幼芽和花丝7个组织中均有表达，其中在叶中的表达量最高。通过基因枪轰击洋葱表皮细胞的瞬时表达分析显示，Zmhdz10-GFP融合表达蛋白定位在细胞核中。酵母杂交实验表明，Zmhdz10在酵母细胞中能够激活报告基因的表达，能够对反向重复序列CAAT(A/T)ATTG发生特异性的结合。4.过量表达Zmhdz10的转基因植株在生长表型上与对照植株没有明显差异。在干旱和盐胁迫处理后，Zmhdz10转基因水稻表现出对胁迫较强的耐受性。通过对相对电解质渗透率、丙二醛含量和脯氨酸含量等生理生化指标进行测定，发现转基因植株在胁迫条件下的相对电解质渗透率和丙二醛含量低于野生型植株，脯氨酸含量高于野生型植株。另外，ABA敏感性实验显示Zmhdz10过量表达转基因植株显着提高了对外源ABA的敏感性。5. Zmhdz10过量表达的转基因拟南芥植株同样表现出对干旱和盐胁迫较强的适应性和忍耐力。通过对P5CS1、RD22、RD29B和ABI14个胁迫/ABA应答功能基因的表达分析发现，在干旱条件下，这些抗逆功能基因在转基因拟南芥中的表达量显着高于野生型植株，表达被激活。对参与非依赖ABA信号传导途径的ERD1表达分析显示，该基因在野生型和转基因植株中的表达没有显着差异。综上所述，本研究通过Blast同源搜索，在玉米全基因组水平上共鉴定了55个HD-Zip基因。根据基因结构、进化和干旱诱导表达模式等分析结果，克隆了Zmhdz10基因并对其分子生物学特性进行分析。过量表达该基因显着提高了转基因植株耐旱和耐盐性，为利用基因工程的方法改良作物的抗逆性提供了优良的基因资源。同时，转基因植株对ABA的敏感性的增加和胁迫/ABA应答功能基因的表达上调，表明该基因主要通过ABA信号传导途径调控抗逆功能基因的表达，从而提高转基因植株的耐旱和耐盐性。
刘丹[6]2014年在《小麦抗逆相关基因TaPP2AbB''-α/γ的克隆及功能分析》文中研究说明小麦(Triticum aestivum L.)是我国的主要粮食作物，其在世界范围内也被广泛种植。干旱、盐渍和极端温度等非生物逆境严重阻碍着小麦生产的进一步发展。挖掘利用抗逆基因，培育突破性品种是提升小麦产量的有效途径。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是异源叁聚体蛋白，能够使蛋白质去磷酸化，参与植物逆境胁迫信号转导过程中的蛋白质磷酸化与去磷酸化反应，对于提高植物抗逆性具有重要作用。为揭示小麦PP2A调节亚基B"亚家族与抗逆性的关系，本研究以小麦品种旱选10号为试验材料，结合小麦D基因组数据库，分离到2个B"亚家族基因TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ。通过分析其在非生物逆境下的表达模式，以及转基因拟南芥在胁迫条件下的表型，明确了TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ在植物抵御逆境胁迫中的功能。主要研究结果如下：1.克隆了2个小麦PP2A调节亚基B"亚家族基因TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ。2.小麦TaPP2AbB"-和TaPP2AbB"-均定位于细胞膜、细胞质和细胞核，与PP2A的结构亚基A和催化亚基C存在相互作用。3. TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ在小麦的根部和叶部均有表达，其根部表达量是叶片表达量的9倍以上。两者的表达水平受到PEG、NaCl、ABA及低温诱导，但表达模式不同。TaPP2AbB"-α在NaCl和PEG处理后首先呈现下调表达，随后上调，在ABA和冷胁迫1h内其表达量迅速上调；TaPP2AbB"-γ在ABA处理2h出现表达高峰，NaCl和冷处理3h出现第一个上调表达高峰，PEG胁迫6h才出现表达高峰。4.与野生型和转空载体的植株相比，TaPP2AbB"-α转基因拟南芥在无胁迫条件下的根系比较发达；在NaCl和甘露醇的胁迫下，其侧根密度显着高于对照株系；在不同浓度的NaCl、ABA以及甘露醇胁迫下，TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ转基因拟南芥的地上部分生长良好，表现出较强的抗逆性。5. TaPP2AbB"-α转基因拟南芥中胁迫应答基因DREB1A/CBF3、RD29A、RD29B、ABF3表达量显着高于野生型；TaPP2AbB"-γ转基因拟南芥的DREB1A/CBF3、RD29B和ABF3表达量也显着高于野生型。表明TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ参与了植物对逆境反应的调控网络，但是两者参与的逆境反应网络不完全相同。综合以上结果，小麦PP2A调节亚基TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ能够增强转基因拟南芥对渗透胁迫和冷害等非生物胁迫的耐受性，转基因株系中多种胁迫应答基因表达量提升，说明TaPP2AbB"-α和TaPP2AbB"-γ基因参与了植物应答逆境反应的网络调控。
王超[7]2012年在《NaHCO_3胁迫下柽柳根部组织基因的表达调控研究》文中研究表明柽柳(Tamarix spp.),灌木(或小乔木),广泛分布于中国西部和中亚地区,能够在干旱和盐渍化土地上生长,对干旱、盐渍、高温等非生物胁迫具有很强的耐受能力,是改造环境的理想树种,也是研究植物抗逆机理和克隆抗逆基因的理想材料。本研究以0.3M NaHCO3处理的柽柳根部组织为材料,利用Solexa技术建立胁迫0(对照),12,24和48h的柽柳转录组,共获得81344个Unigenes.通过转录组分析,与对照相比,胁迫12、24和48h显着差异表达的基因分别有3976、6057和3069个。为了鉴定差异表达基因与胁迫之间的关系,对基因表达模式的动态变化进行了聚类分析,差异基因可以分为10类显着共表达的基因表达模式。对共表达的差异表达基因进行GO功能富集分析,结果显示细胞防护、蛋白结构保护和修复、胁迫应答信号通路、细胞内离子平衡保持和重建等生物过程在柽柳抵抗逆境胁迫中具有重要作用。鉴定了15个转录因子家族的1605个基因,这些转录因子家族包括MYB,MYC,bZIP, ERF,WRKY,NAC,ABRE,DREB,bHLH和MADS Box等,这些家族基因的表达大部分都响应NaHCO3胁迫。此外,NaHCO3胁迫下,脯氨酸和海藻糖合成相关基因的表达量增加,提示胁迫下柽柳的脯氨酸和海藻糖含量提高。同时。15个编码热激蛋白的转录本的表达显着变化(占总数45%)。另外,分别有32.7%-50.5%的差异表达基因为未知功能的新基因,说明这些基因在柽柳的胁迫应答反应中也具有重要作用。总之,对这些胁迫应答的关键基因进行系统的分析对深入了解柽柳耐盐机理具有重要意义。从柽柳中克隆获得14个脂质转运蛋白基因(ThLTP1-14),利用实时荧光定量RT-PCR技术对这些基因在不同的非生物胁迫和外源激素ABA处理下柽柳根、茎、叶中的表达模式进行研究。结果表明,正常生长条件下,14个ThLTPs在根、茎、叶中均表达。但是,在相同组织中它们的基因表达量存在明显差异,在根、茎、叶中分别相差3700倍、540倍和9000倍,说明它们在柽柳组织器官中活性和生理功能可能不同。14个脂质转运蛋白基因和在NaCl,PEG,NaHCO3和CdCl2胁迫下至少在一个组织中表达发生明显改变(>2倍),并且所有基因的表达均受ABA高度诱导,说明这些基因的表达依赖于ABA信号转导途径,参与柽柳非生物胁迫应答。水通道基因在响应干旱和盐碱胁迫中其重要作用。本研究克隆了18个水通道蛋白基因(ThAQP1-18)。实时荧光定量RT-PCR结果表明,这些基因至少在一个组织中表达发生明显改变,且相对于茎和叶,在根组织中受诱导程度更高,表明这些基因可能主要在柽柳根部胁迫应答反应中发挥作用。其中ThAQP2.ThAQP11和TgAQP14在胁迫前后表达差异最明显,表明这些基因与柽柳非生物胁迫的耐受性密切相关,可作为候选的抗逆基因资源对其功能和调控机理进行深入研究。为了深入了解柽柳水通道蛋白的表达调控途径,我们选取了一个受非生物胁迫高度诱导表达的水通道蛋白基因(ThAQP11),利用TAIL-PCR技术克隆得到ThAQP11启动子序列,长度1605bp。序列分析发现,该启动子区域包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如MYB.MYC.WRKY.ABRE等。将其定向替换植物表达载体pCAMBIAl301中的35S启动子,构建了ThAQP11启动子驱动GUS的二元表达载体,浸花法转化拟南芥再通过GUS染色研究ThAQP11启动子活性和基因的特异性表达。结果显示ThAQP11基因启动子可以驱动GUS,而且其表达有一定的组织特异性,主要在子叶、主根和叶脉表达。利用酵母单杂交技术筛选与其启动子ABA应答顺式作用元件ABRE互作的上游调控因子,得到一个bZIP类转录因子,表明ThAQP11响应逆境胁迫可能是由于逆境胁迫会促使细胞内ABA含量增加,激活bZIP转录因子,调控bZIP转录因子与启动子上ABRE元件的相互作用,从而促进了ThAQP11的表达。
袁阳阳[8]2016年在《山葡萄GRAS家族基因VaPAT1在非生物胁迫应答中的功能研究》文中进行了进一步梳理葡萄(Vitis vinifera L.)是我国重要的栽培果树之一,葡萄基因组序列的发布为在分子水平上鉴定葡萄优良农艺性状、抗逆(病)相关基因奠定了重要基础。GRAS家族基因是一类广泛参与植物生长、发育及抗逆等过程的转录因子,其在葡萄逆境胁迫应答中的作用鲜有报道。本研究利用生物信息学手段,在全基因组水平上对葡萄GRAS基因家族进行了鉴定和分类。并利用分子生物学手段对山葡萄(V. amurensis)中一个GRAS基因,VaPAT1的功能进行了研究,初步揭示了VaPATl调控植物非生物胁迫应答的分子机制。主要研究结果如下：1、从12ב黑比诺’葡萄(V. vinifera cv. Pinot Noir)基因组数据库中共鉴定得到41个葡萄GRAS基因,分布于除3、5、10和16号染色体外的15条葡萄染色体上。与此同时,本研究还发现两个GRAS基因簇,一个位于6号染色体上另一个位于13号染色体上。葡萄GRAS家族分为PAT1、LS、SCL4/7、HAM、 SHR、SCL3、SCL9、SCR和DELLA 9个亚家族。2、系统进化关系分析表明、VaPAT1与同是PAT1亚家族的佛手CmsGRAS及水稻OsCIGR1蛋白关系最近。VaPAT1基因启动子区序列上包含ARE、GARE、 HSE、TC-rich repeats以及TCA等多个与激素信号传导和外界环境胁迫应答相关的顺式作用元件。3、VaPATl对外源施加ABA.GA和SA都能够响应。在GA处理下,VaPAT1表达量下调,表现出类似于GRAS家族DELLA基因的性质。低温、干旱、高盐处理下,VaPAT1表达量均显着上调。尤其是200 mM NaCl高盐处理下,VaPAT1表达量在48 h时上升为处理前22倍。这些结果表明,VaPAT1可能参与调控非生物胁迫应答过程,并且可能在其中发挥重要作用。4、酵母双杂交结果证明VaPAT1具有转录自激活活性。VaPAT1转基因拟南芥在低温、干旱、高盐非生物胁迫处理下其成活率都显着高于野生型,表明VaPAT1在调节植物抗逆的过程中起正向调控作用。VaPAT1转基因拟南芥中脯氨酸及可溶性糖含量显着高于野生型,这些可能是转基因拟南芥抗性增强的重要原因。5、通过qRT-PCR检测野生型及VaPAT1转基因拟南芥中抗逆相关基因的表达情况,发现VaPAT1转入不仅影响抗逆途径下游基因AtCOR15A、AtRD29A和AtRD29B的表达,还影响发挥重要作用的上游转录因子AtSIZ1、AtCBFl、 AtATR1/MYB34和AtMYC2的表达。此外,ABA合成及信号传导相关基因AtNCED3和AtCIPK20在VaPAT1转基因株系中表达显着上调,表明VaPAT1可能参与了ABA依赖型胁迫应答途径。
姚文静[9]2016年在《杨树转录因子ERF76基因耐盐功能研究》文中指出转录因子以反式作用因子的形式与基因启动子序列中的顺式作用元件特异性结合,通过与其他相关蛋白之间的互作来激活或者抑制转录,从而调控下游靶基因的表达。ERF家族基因是一类植物中特有的与植物生长发育和生物、非生物胁迫应答相关的转录因子基因。通过RNA-Seq方法筛选杨树中应答盐胁迫的ERF基因,结果显示在所有上调表达的ERF家族基因中,转录因子ERF76基因的相对表达量变化最显着。利用RT-qPCR对ERF76基因在3个不同组织和5个不同盐胁迫时间点的时空表达模式进行分析,结果显示ERF76基因在根茎叶中均有表达,在根中相对表达水平最高,依次是叶和茎,在胁迫3-36 h时间段内,该基因在根茎叶中相对表达水平达到峰值的时间点均在12 h。利用巢式PCR从小黑杨基因组中克隆出ERF76基因上游1.5 kb的DNA序列。元件预测显示,ERF76基因启动子序列中包含转录、植物胁迫应答和植物生长发育相关的顺式作用元件。利用酵母单杂交鉴定与ERF76基因启动子互作的蛋白包括转录、氧化还原酶活性、植物防御和应激反应、植物生长发育相关蛋白。利用RT-qPCR.GUS染色和GUS荧光定量检测转基因拟南芥中不同启动子片段驱动GUS基因表达情况,结果表明不同长度的ERF76启动子片段具有不同转录激活活性和应答盐胁迫功能。利用RT-PCR从小黑杨中克隆出1537 bp编码ERF76基因的cDNA片段。亚细胞定位结果显示ERF76蛋白定位在细胞核中。利用农杆菌介导的叶盘转化法获得CaMV35S启动子驱动下的ERF76基因过表达转基因烟草和转基因小黑杨。在盐胁迫条件下,转基因烟草和转基因小黑杨的株高、根长、鲜重、抗氧化酶活性、抗逆境保护分子含量和相对含水量均高于非转基因株系,植物体内活性氧的积累和相对电导率均低于非转基因植株。转基因杨树与野生型杨树相比具有明显的表型差异,转基因杨树中的ABA和GA相对含量明显高于野生型。转基因杨树中ERF76基因、一些胁迫相关基因及植物激素合成相关基因的mRNA丰度显着高于非转基因杨树。转基因杨树和野生型杨树转录组分析结果表明375个差异表达基因(DEGs)包括268个上调表达基因和107个下调表达基因,其中上调表达基因中包含16个转录因子基因和45个植物抗逆相关基因。综上表明杨树转录因子ERF76基因是一个盐胁迫诱导表达基因,在杨树生长发育和应答盐胁迫过程中具有重要作用。ERF76基因过量表达的转基因植物通过调控抗逆相关基因和植物激素合成相关基因的表达,促进了转基因植株生长发育,提高了转基因植株的耐盐胁迫能力。
熊金涛[10]2016年在《棉花盐胁迫应答基因GhSR13的克隆和功能分析》文中认为随着土地环境不断恶化,盐碱地面积不断扩大,如何有效利用这些盐碱地,成为摆在我们面前的现实问题。棉花具有很高的耐盐性和耐旱性,可是在实际的生产过程中,可利用的耐盐耐旱品种并不多见,这就需要通过基因工程手段或者分子生物学手段,寻找出一些耐盐基因,然后运用基因工程技术,培育出优良的棉花品种。前期利用基因芯片测序技术,得到一条EST序列信息,通过NCBI数据库比对分析,陆地棉数据库公布的基因信息,成功克隆了该基因的CDS全长序列,并命名为GhSR13。该基因CDS全长1476 bp,编码492个氨基酸。随后进行有关GhSR13序列生物信息学的分析。首先,对GhSR13的蛋白家族进行分析发现,该基因属于DDE_Tnp_1_6家族。随后结合NCBI数据库,以及最近公布的二倍体和四倍体棉花4数据库,做了棉花同源种属的同源性分析和不同种属的同源性分析,并对该EST序列的开放阅读框以及保守结构域进行了预测分析。通过同源性比对,在番茄以及拟南芥中都发现了与GhSR13同源的基因,同源性达到了50%以上,在番茄中该同源基因已经被证明参与盐胁迫反应途径,而在拟南芥中,该同源基因也被证明响应盐胁迫途径。在得到了该基因的CDS序列后,开展了以下实验。我们首先对该基因是否响应盐胁迫作了定量分析,在用200 mM NaCl处理后,在0h,1 h,4 h,6 h,12 h,24 h,分别提取棉花的真叶和根的RNA反转录为cDNA后进行定量分析。结果表明,在根中,GhSR13的表达量发生了明显的变化,我们推测测其可能参与了盐胁迫反应途径。随后,构建了GhSR13-GFP和GhSR13-GUS等一系列的载体,进一步研究该基因是否响应盐胁迫。GFP荧光亚细胞定位结果表明,GhSR13蛋白定位于细胞核。GUS染色结果表明,该基因主要在根成熟区表达。通过构建表达有GhSR13-PYES2的酵母菌株并进行盐处理发现,在200 mM Na Cl,10 m M Li Cl处理条件下,含有目的基因的酵母菌落生长状况均不如空白对照,进一步表明该基因是参与了盐胁迫反应途径。在随后的VIGS实验中发现,600 mM NaCl处理后的棉花叶片发生明显的萎蔫,而且被干涉掉的基因棉花植株萎蔫程度要比对照高,表明在基因干涉掉后,加剧植物对盐胁迫途径的调控反应,造成植株对盐的耐受性降低。通过将棉花基因转入拟南芥材料获得转基因植株,选取了3个株系(OE-2,OE-3,OE-4)进行盐处理的表型实验,结果表明,(OE-2,OE-3,OE-4)这叁个转基因种子在萌发上对盐的敏感性明显要比野生型高,根伸长也表现出对盐更高的敏感性。以上结果均表明GhSR13基因参与棉花盐胁迫响应调节。
参考文献：
[1]. 酵母盐胁迫应答基因的克隆及表达分析[D]. 付畅. 东北林业大学. 2003
[2]. 水稻非生物胁迫相关锌指蛋白基因的克隆与功能分析[D]. 黄骥. 南京农业大学. 2005
[3]. 多枝赖草（Leymus multicaulis）盐胁迫应答相关基因的克隆及表达分析[D]. 史仁玖. 南京农业大学. 2005
[4]. 油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究[D]. 陈良. 华中师范大学. 2011
[5]. 玉米HD-Zip转录因子家族抗旱相关基因的鉴定及Zmhdz10功能分析[D]. 赵阳. 安徽农业大学. 2013
[6]. 小麦抗逆相关基因TaPP2AbB''-α/γ的克隆及功能分析[D]. 刘丹. 中国农业科学院. 2014
[7]. NaHCO_3胁迫下柽柳根部组织基因的表达调控研究[D]. 王超. 东北林业大学. 2012
[8]. 山葡萄GRAS家族基因VaPAT1在非生物胁迫应答中的功能研究[D]. 袁阳阳. 中国科学院研究生院(武汉植物园). 2016
[9]. 杨树转录因子ERF76基因耐盐功能研究[D]. 姚文静. 东北林业大学. 2016
[10]. 棉花盐胁迫应答基因GhSR13的克隆和功能分析[D]. 熊金涛. 河南大学. 2016
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