（徐州医学院病理教研室 江苏徐州 221000）
【摘要】目的：对四种分子亚型乳腺癌中PTEN基因启动子区甲基化状态进行分析及相关预后分析。方法：采用甲基化特异性pcr法检测各组乳腺癌PTEN基因启动子区甲基化状。结果：40例乳腺癌中淋巴结转移24例，无淋巴结转移16例，PTEN基因甲基化阳性率72.5％，HER2过表达型PTEN基因甲基化率高于其他亚型。结论：PTEN基因甲基化可能是导致乳腺癌发生、发展的重要机制之一，PTEN基因高甲基化与年龄无相关性，与乳腺癌淋巴结转移有相关性（P=0.006＜0.01）。PTEN基因可作为HER2过表达型乳腺癌的特异性治疗靶点。
【关键词】乳腺癌；PTEN；分子分型；甲基化特异性PCR法（MSP）
【中图分类号】R730.2 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）26-0061-03
长期以来，肿瘤形态学是乳腺癌病理诊断的金标准，并成为临床治疗的依据。但是临床与病理分期基本一致的乳腺癌患者，其预后可能完全不同，传统的病理形态学诊断已不能完全适应肿瘤学研究的发展需求[1-8]，本文采用甲基化特异性pcr法检测乳腺癌PTEN基因甲基化状态，比较乳腺癌各亚型之间PTEN基因甲基化状态的差异，并探讨乳腺癌PTEN基因甲基化状态和年龄、淋巴结转移的关系。
1.材料与方法
1.1 标本来源
收集2007—2010年徐州医学院附属医院手术治疗的乳腺浸润性导管癌病例共93例，患者年龄29岁～72岁，中位年龄49岁，有淋巴结转移的为26例，肿瘤分级Ⅱ级4例，Ⅲ级27例，Ⅳ级9例。所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA提取 40例石蜡标本经二甲苯脱蜡，无水乙醇漂洗后，加入消化液（180μl ATL、20μl蛋白酶k）56℃孵育10小时，加入DNA提取试剂AL、AW1、AW2（均购自美国Zymo公司）提取DNA，无水乙醇沉淀，TE溶解，紫外分光光度计检测DNA纯度。
1.2.2 DNA的甲基化修饰 将130μl CT转换剂、20μl DNA样本充分混合，进行热循环（98℃10min、64℃2.5h），修饰后的DNA使用Zymo clean-up system进行提纯。
1.2.3甲基化特异性PCR PTEN甲基化引物序列，上游引物:5‘TTCGTTCGTCGTCGT-CGTATTT3’，下游引物： 5‘GCCGCTTAACTCTAAACCGCAACCG3’；产物长度206bp。PTEN未甲基化引物序列：上游引物：5‘GTGTTGGTGGAGGTAGTTGTTT3’；下游引物：5‘ACCACTTAACTCTAA ACCACAACCA3’；产物长度162bp。引物均购自上海生工生物公司。Pcr反应体系40μl，含上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，Zymo热启动酶20μl，修饰后的DNA4μl，双蒸水11μl。甲基化引物的PCR反应条件：94℃3min；94℃30sec，58℃40sec，72℃40sec，40个循环；72℃7min。非甲基化引物的PCR反应条件：94℃3min；94℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，40个循环；72℃7min。PCR产物以DNA Marker DL500标准相对分子质量作为参照，PCR产物用4.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR产物的产量和特异性。甲基化特异性引物扩增出相应片段（206bp）为甲基化阳性，仅非甲基化引物扩增出相应片段（162bp）为甲基化阴性。
1.3 统计分析
采用STATA10.0统计软件进行统计分析。
2.结果
2.1 临床资料分析
连续性选取乳腺癌四种分子亚型病例各10例，性别均为女性，患者年龄范围29岁～72岁，中位年龄49岁，平均年龄48.3岁，有淋巴结转移者24例。肿瘤分级按照Bloom和Bichardson分级系统，肿瘤分级二级者4例，三级27例，四级9例，经病理形态学证实全部为浸润性导管癌（表1）。
2.2 PTEN基因甲基化扩增结果
我们分析了40例乳腺癌肿瘤组织的PTEN基因甲基化状态，部分电泳结果如图1，在所检测的40例乳腺癌患者中，共有29例发生甲基化，甲基化阳性率为72.5％；其中，HER2过表达型甲基化率最高（100％），腺腔B型甲基化率最低（30％），二者之间的差异具有统计学意义（P=0.003＜0.05）。（图1，表2）
2.3 PTEN甲基化状态与年龄、淋巴结转移的关系
受检的40例乳腺癌患者中，发生淋巴结转移的共有23例，其中18例发生甲基化，5例未发生甲基化。甲基化组和未甲基化组之间的差异具有统计学意义（P=0.006＜0.01）。二组之间的年龄差异不具有统计学意义。（表3）
3.讨论
长期以来，肿瘤的发生机制一直围绕基因突变、缺失导致DNA序列改变从而使癌基因激活，抑癌基因失活进行的，近年的研究表明，一些肿瘤的重要基因并没发生缺失或突变的异常，而只是存在基因表达的异常，主要通过DNA甲基化实现，这种改变具有可逆性、遗传性[9]。在正常组织中，广泛表达的基因启动子区CPG岛常处于非甲基化状态，肿瘤细胞中，这些CPG岛常变为甲基化状态，其相关基因的表达即被关闭。甲基化导致转录失活的部分机制已被阐明，主要包括以下几种：甲基化直接干扰序列特异的转录因子与DNA的结合；甲基化的CPG序列能恢复转录协同抑制因子的抑制转录功能；通过与组蛋白乙酰转移酶家族成员作用改变染色质结构而使一系列甲基化组织特异性基因和印迹基因失活影响转录[10]。
我们分析了40例乳腺癌肿瘤组织的PTEN基因甲基化状态，共有29例发生甲基化，甲基化阳性率为72.5％；其中HER2过表达型甲基化率最高（100％），腺腔B型甲基化率最低（30％），二者之间的差异具有统计学意义（P=0.003＜0.05）。HER2过表达型PTEN甲基化率比较高，如这一结果能在以后的试验中继续得到验证，那么PTEN基因将有可能成为HER2过表达型基因治疗的特异性靶点。
在本实验40例乳腺浸润性导管癌中，PTEN基因甲基化率为72.5%，结合临床及病理资料，发现PTEN基因甲基化的发生与病人年龄无关，而与肿瘤的转移有相关性，有淋巴结转移的甲基化率显著高于无转移病例，淋巴结转移或远处转移反映了乳腺癌的生物学特性，提示 PTEN基因高甲基化和乳腺癌的恶性程度有关，PTEN基因有望成为乳腺癌恶性进展的指标之一。
【参考文献】
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论文作者:马振洋,吴永平
论文发表刊物:《心理医生》2018年9月26期
论文发表时间:2018/10/9
标签：甲基化论文; 乳腺癌论文; 基因论文; 引物论文; 淋巴结论文; 特异性论文; 肿瘤论文; 《心理医生》2018年9月26期论文;