MRI可视性MG7抗体紫杉醇纳米药物对论文_刘圣活1帅心涛2周建华3胡凤霞3杨兵1

刘圣活1帅心涛2周建华3胡凤霞3杨兵1

1深圳市第九人民医院广东深圳518116；

2中山大学化学与化学工程学院广州510000;

3深圳市龙岗区人民医院广东省深圳518172

基金项目：本研究为广东省医学科学技术研究基金资助项目（编号A2011577），【摘要】目的：合成负载MRI可视性MG7抗体紫杉醇纳米粒对胃癌的诊断与治疗。方法：采用开环聚合法制备PCL-PEG二嵌段元共聚物，通过共沉淀法制备负载MG7抗体及紫杉醇的PCL-PEG纳米粒，构建MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇并测定其形态粒径、zeta电位、体外细胞毒性、对人低分化胃腺癌BGC--823细胞株靶向效应、MRI超顺磁性。结果：透视电镜结果表明得到了具有核壳结构的球形粒子，纳米的平均粒径为（146±35)nm，zeta电位为（274mv),空白载体材料毒性减低，具有超顺磁性，对人胃癌BGC--823细胞有明显靶向性。结论：本实验研制的MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米粒粒径可控、对胃腺癌BGC-823细胞明显靶向性、超顺磁性的特点，为有效的胃腺癌早期诊断及治疗提供了理论基础。

【关键词】胃癌；MG7Ab；紫杉醇；超顺磁性氧化铁（SPIO）；磁共振成像（MRI）诊断

【中图分类号】R1224【文献标识码】B【文章编号】1674-8999(2013)08-0038-02

紫杉醇是国际上公认为首选的抗癌药物，但因明显的剂量相关的骨髓抑制神经毒性和引发严重过敏反应等副作用制约着它的大量应用。近年来，纳米生物材料作为一种新型药物载体受到广泛关注，不但可以改变药物在生物体内的分布，还使药物能够在病灶部位有效聚集，从而显著提高药物疗效，降低其不良反应［1］。

目前，常用的成像方法包括光学、磁共振、超声和核医学成像等，而纳米材料作为成像对比剂，在现代医学成像技术中发挥着越来越重要的作用，与传统的分子对比剂相比，纳米粒子具有可控的小尺寸、独特的磁学和光学性能、良好的可修饰性、对其它分子的高效负载率等诸多优势。因此，将纳米粒子与生物分子探针相结合所构建的新型纳米探针，有望成为具有探针功能的对比剂［2］。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)已经成功应用于临床作为成像对比剂），在诊断早期肿瘤等方面有着良好的应用前景.

胃腺癌相关抗原MG7-Ag是主要分布在癌细胞的胞浆内或胞膜上,具有很高的特异性，在良性疾病几乎不表达，在胃腺癌组织中高表达，有很高的诊断与治疗价值,是目前研究中最有前景的胃腺癌靶向诊断和治疗的肿瘤标记物，这就意味着可以以胃腺癌细胞MG7-Ag受体为靶向因子来进行靶向基因治疗。

目前使用的作为基因转移载体的纳米粒子主要有聚乙二醇(PEG)和聚已内酯（PCL)等亲脂性材料共价结合组成嵌段共聚物而用于构建递药系统［3］。因此，本文选择PCL-PEG嵌段聚合物负载MG7抗体、紫杉醇及SPIO的纳米粒,研究复合物的粒径、zeta-电位，并在体外检测其细胞毒性，为可视性肿瘤的基因靶向治疗实验奠定基础。

1材料

11试剂和药品：紫杉醇（北京协和药厂），聚已内酯（PCL分析纯，美国Alderich公司）聚乙二醇(PEG分析纯，金陵石化公司）MG7抗体第四军医大学消化疾病研究所）人低分化胃腺癌BGC-823细胞株由中大附属一院实验中心提供，小牛血清（杭州四季青生物技术公司），乙酰丙酮铁（美国Sigma公司）

12仪器：Vector 22FT-IR244傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司）；激光衍射纳米粒度分析仪（美国Waters公司);Poplus激光衍射纳米粒度分析仪；Zeta电位仪（美国Brookhaven公司；JEM-100s透视电子显微镜（日本Jeol公司），500NB超导核磁共振（美国Varianw公司）激光共聚集显微镜(美国LSM),MPMS XL一7磁学性质测量系统美国。

2方法

21PCL—PEG二嵌段聚合物的合成：PCL—PEG二嵌段聚合物的合成参照文献［4］制备，取一定量的干燥PEG放置于封管20ml中，加入计算量的干燥PCL和001%的辛酸亚锡（催化剂），真空条件下封管后于130℃下反应48h,得到的产物经二氯甲烷溶解后，沉淀到10倍体积的冷甲醇中，得到的固体于40摄氏度下真空干燥48h,得到PCL—PEG高分子，无水条件保存。

22PCL-PEG-SPIO的合成:乙酰丙酮铁(2mmo1)、l，2一十六烷二醇(10mmo1)、油酸(6mmo1)、油胺(6mmo1)，加入到100ml三口反应瓶中，然后在氮气保护下加入20ml二苄醚搅拌溶解后，在沙浴中加热到200℃回流搅拌2h,冷却，沉淀在80ml乙醇中，在10000rpm转速下离心5min，彝去上层清夜，即得SPIO,称取450mgPCL-PEG和30mg SPIO(6rim)共溶解于5mL CHCl3中，通过配基交换法成功地合成PCL-PEG-SPIO。

23MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米粒的制备：将PCL-PEG-SPIO二嵌段聚合物40mg和紫杉醇10mg溶解于丙酮3ml中，将溶液逐渐滴加到Na2CO3水溶液（PH9)30ml中，滴加时连续快速搅拌，然后用06um微孔滤膜过滤以除去未包裹的药物及高分子聚合物，得到紫杉醇PCL-PEG-SPIO纳米粒分散液。取MG7胞内抗体2ug,加去离子水至25ul,与紫杉醇PCL-PEG-SPIO纳米粒分散液混合均匀，摇床振荡30min,即得MG7抗体PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米复合物溶液。

24MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米复合物的检测：激光衍射纳米粒度分析仪测量粒径，Zeta电位，取纳米复合物适量，用去离子水稀释至20ml，用Poplus仪及Brookhaven测定粒径及Zeta电位。

25电镜观察：取纳米溶液适当稀释后，滴加到覆盖有碳膜的专用铜网上，用2%磷钨酸溶液进行负染，在JEM-100s透视电镜下观察纳米的大小和形态。

26胃腺癌细胞（BGC-823）对非抗体靶向和MG7-Ag抗体靶向纳米显像探针铁吸收的普鲁氏蓝染色情况。

将一个适量的含相同Fe浓度的MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米颗粒、PCL-PEG-SPIO紫杉醇非抗体靶向聚合物纳米颗粒与胃腺癌细胞在无血清DMEM培养基中共孵育2h后，利用普鲁士蓝染色观察胃腺癌细胞内含铁的情况，检测和比较胃腺癌细胞对纳米颗粒的主动靶向与非主动吸收情况。

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27激光共聚集显微镜(CLSM)观察胃腺癌细胞吸收MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米探针MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇体外细胞MRI显像研究

通过体外MRI成像，利用SPIO的T2负性增强效应，反映细胞内含Fe量，间接反映胃腺癌细胞对磁性纳米颗粒的吸收情况。MRI检测胃腺癌细胞吸收MG7Ag抗体靶向纳米显像探针MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇，测量T2WI上MRI信号强度，观察信号强度变，探索利用临床型MRI评价MG7Ag抗体靶向纳米显像探针对胃腺癌细胞的靶向效应。

28空白载体材料PCL-PEG-SPIO体外毒性的安全性评价：采用WST-8法，检测负载SPIO前后的载体材料体外细胞毒性影响，评价其安全性。按公式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)=(As-Ab)／(Ac-Ab)×100％

3结果

31MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米粒粒径及电位:在JEM-100s透视电子显微镜上观察得其粒径为（146±35）nm，且粒径分布很均匀；根据报道，该尺寸的粒子较易于通过粘膜［5］，Zeta电位为274mv。x一射线衍射仪测定合成的纳米粒子是单晶；在MPMS XL-7磁学测量系统上检测其磁学性质，没有磁滞现象，表现出超顺磁性。

MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米粒在透视电镜下呈球形和椭圆形，大小相对均匀，有很好的分散性，表面因包裹了高分子PEG显得边缘模糊，中间白色圆形粒子为PCL内核，说明本实验所得纳米粒具有核—壳结构［6］。

32载药纳米粒的体外毒性研究发现经过PEG的修饰，减低了PEG的毒性，同时连接上SPIO也不会增加PEI的毒性，在试验范围内，转染PCL-PEG和PCL-PEG-SPIO的细胞存活率比PEG要高。

33MG7Ab-PCL-PEG-SPIO转染细胞后的普鲁氏蓝染色较无抗体靶向的PCL-PEG-SPIO显著加深，说明有MG7Ab的纳米颗粒MG7Ab-PCL-PEG-SPIO能有效地进入进入胃腺癌细胞，定位于细胞浆中，MG7Ab-PCL-PEG-SPIO转染的细胞MRIT2信号比无抗体靶向的PCL-PEG-SPIO明显减弱，达45．26％。4结论

PCL-PEG二嵌段聚合物纳米颗粒是一种多功能复合纳米粒子，当聚合物形成胶束时，PEG通过一个末端基团锚定胶束，PEG链伸向水相，形成像“刷状”的微粒表面结构，能在载体表面形成水化层，再经表面化学修饰结合单克隆单链抗体MG7片段，提供免疫靶向性，同时还能降低调理素作用，具有高度的亲水性，良好的生物相容性，并可显著减少纳米颗粒的蛋白粘附，网状内皮系统的吸收和吞噬，从而延长纳米颗粒在体内的循环时间（7），PCL构筑颗粒的内核，可以高效负载疏水性的紫杉醇，这种表面亲水，内部疏水的独特壳——核结构的胶束，载药量多而且更为稳定。

本实验成功地以PCL-PEG二嵌段共聚物为载体，采用共沉淀法制备了具有MRI可视性靶向功能的紫杉醇纳米粒，结果发现MG7Ab-PCL-PEG-SPIO纳米粒Zeta电位及粒径分析仪测定的结果表明纳米粒平均粒径为（146±35)nm，Zeta电位为274mv，由于肿瘤血管的异形性，淋巴回流受阻等原因，使得该大小的纳米粒能够借助高通透性和滞留效应（EPR）［7］富集在肿瘤组织中，从而提高肿瘤组织局部药物浓度，同时减少了对正常组织的毒副作用，扫描电镜图片显示纳米粒呈球形或近似球形，分散均匀，颗粒粒径可控、具有超顺磁性，可用作制备MRI对比剂。

疏水性的SPIO纳米颗粒能被高效负载于PCL-PEG聚合物胶束的疏水性内核，且所制备的聚合物胶束具有超顺磁性，有望成为一种新型、特异性MRl分子探针。由于聚合物胶束疏水段化学结构、两亲性比例调控的胶束的形状、尺寸、SPIO负载量等，因而更适合细胞转染。

构建好的磁性纳米材料MG7Ab-PCL-PEG-SPIO细胞毒性减低，具有纳米尺寸，并将抗体作为配体高效负载于聚合物胶束的亲水性外壳，使该聚合物胶束获得肿瘤的双重靶向效应。本实验研制的MG7Ab-PCL-PEG-SPIO紫杉醇纳米颗粒作为胃腺癌BGC--823抗体靶向纳米探针，能有效地进入靶细胞，提高转染率，还能明显改善胃腺癌细胞的MRI的T2信号，为寻找有效的胃腺癌早期诊断及治疗方法提供了理论基础。

参考文献

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论文作者:刘圣活1帅心涛2周建华3胡凤霞3杨兵1

论文发表刊物:《中医学报》2013年8月第23卷供稿

论文发表时间:2014-3-20

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