杭州师范大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科 浙江 杭州 310015
基金项目：浙江省自然科学基金(Y2100578)；杭州市科技发展基金(20110833B09，20130733Q36)?；杭州市医药卫生科技计划项目（2009B009）；浙江省医药卫生科技计划项目（2009B129）
通信作者：李圆，主治医师，主要从事头颈肿瘤的综合治疗研究
[摘要] 目的 研究川芎嗪对喉鳞癌细胞株Hep-2增殖及侵袭转移的作用。方法 经不同浓度川芎嗪分别处理Hep-2细胞，细胞粘附实验、迁移实验及肿瘤体外侵袭实验检测细胞粘附、运动及侵袭能力，RT-PCR检测细胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表达。结果 0.15g/L、0.2g/L川芎嗪能有效抑制Hep-2细胞与FN的粘附能力（P<0.05），0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L川芎嗪能显著降低Hep-2细胞的运动能力和侵袭能力（P<0.01）。Hep-2细胞中MMP-2无明显表达，MMP-9高表达，0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L川芎嗪能明显下调MMP-9 mRNA的表达（P<0.01）。结论 川芎嗪是能抑制Hep-2细胞的粘附、运动和侵袭能力，其作用机制可能与下调MMP-9 mRNA的表达有关。
[关键词] 川芎嗪；喉鳞状细胞；基质金属蛋白酶-9
【中图分类号】R498.2【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0023-02
喉癌是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤，早期发生浸润转移是影响生存质量和导致复发的主要原因。临床上常采取的预防喉癌发生浸润转移的方法是加大放疗剂量以及延长化疗疗程[1]，同时增加了化疗药物的毒副作用及患者的痛苦和经济负担。近年来，抗肿瘤侵袭转移的研究已受到越来越多的关注和重视，传统中药在这方面具有独特的作用。本实验以喉鳞癌细胞株Hep-2为研究对象，观察川芎嗪对Hep-2细胞增殖、侵袭转移能力和MMPs的影响，进一步探讨川芎嗪的抗肿瘤作用及其机制。
1 材料和方法
1.1 细胞株和主要试剂
喉鳞癌细胞株Hep-2、小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3，川芎嗪（MW＝248.36，纯度99.6％），四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），人工重构基底膜胶（Matrigel），纤维粘连蛋白（FN），聚碳酸酯微孔滤膜（Millicell小室）。
1.2 细胞培养和分组
Hep-2细胞培养在含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和RPMI1640培养液中，加入川芎嗪，使其终浓度分别为0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L，为处理组1、2、3，以0g/L为对照组。各组Hep-2细胞密度为1×108/L，接种于96孔培养板。
1.3 细胞粘附、迁移及体外侵袭实验[2]
调整Hep-2细胞密度为5×108/L，接种于包被FN 的96孔培养板。培养1h后，弃上清，PBS冲洗除去未粘附细胞，弃PBS后加MTT液，培养4h，离心5min，弃上清，加入DMSO 150μl/孔，振荡2min，酶标仪测各孔细胞490nm处光吸收值（A值），计数粘附细胞数。NIH3T3细胞用无血清RPMI1640培养24h，调整Hep-2细胞密度为1×109/L，将Millicell小室放入24孔培养板，上室加入细胞悬液。培养8h后，取出Millicell小室，收集运动至下室的细胞，MTT法测A值间接计数运动穿膜细胞数。将包被Matrigel和FN的Millicell小室放入24孔培养板，将200μl Hep-2细胞密度为1×108/L，接种到上室。培养48h后，取出Millicell小室，固定染色穿过微孔滤膜侵袭至下室的细胞，在400倍倒置显微镜下计数，每张膜取10个视野。
1.4 RT-PCR检测
川芎嗪分别作用Hep-2细胞48h后，各组收集5×106个细胞，提取总RNA。以MMP-2或MMP-9 PCR产物光密度值与β-actin PCR产物光密度值的比值作为目的基因mRNA表达的相对值。
1.5 统计学分析
所得结果均用表示，数据分析采用SPSS17.0，计量资料的多组比较采用方差分析，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 川芎嗪对Hep-2细胞增殖的影响
当0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L川芎嗪分别作用Hep-2细胞48h后，细胞生长抑制率依次为12.2％、18.9％、27.9％，提示低浓度川芎嗪对Hep-2细胞48h生长抑制率<30％，符合细胞粘附和侵袭实验要求。川芎嗪对Hep-2细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。
2.2 川芎嗪对Hep-2细胞粘附能力的影响
川芎嗪作用Hep-2细胞1h后，三个处理组细胞粘附率随川芎嗪浓度的增加而下降。组1与对照组比较差异无统计学意义（P＝0.155），组2与对照组比较差异有统计学意义（P＝0.018），组3与对照组比较有显著性差异（P＝0.001），组1、2之间差异无统计学意义（P＝0.318），组1、3之间差异有统计学意义（P＝0.029），处理组2、3之间差异无统计学意义（P＝0.219）（表1）。
3 讨论
川芎嗪是伞形科植物川芎的根茎提取的活性生物碱。研究表明，川芎嗪能抑制人乳腺癌细胞的粘附侵袭能力，并可下调细胞乙酰肝素酶mRNA的表达[3]。本实验表明0.15g/L、0.2g/L川芎嗪能有效抑制Hep-2细胞与FN的粘附能力，0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L川芎嗪能显著降低Hep-2细胞的运动能力和侵袭能力，并且0.2g/L组的抑制作用大于0.1g/L组和0.15g/L组（P<0.01）。结果显示低浓度川芎嗪可以从粘附、运动和侵袭等多环节抑制Hep-2细胞的侵袭转移能力，其最佳作用浓度为0.2g/L。
在肿瘤细胞侵袭过程中，MMPs可直接诱导宿主细胞产生更多MMPs，通过多种机制促进肿瘤的侵袭和转移[4]。有文献报道，MMP-2和MMP-9在喉鳞癌细胞中高表达，并且在喉鳞癌的发生和浸润中发挥重要作用[5]。本实验经不同浓度川芎嗪分别作用Hep-2细胞48h后，各组川芎嗪能显著降低MMP-9 mRNA的表达（P<0.01），而MMP-2在各组Hep-2细胞中无表达，Hep-2细胞MMP-9 mRNA的表达与细胞侵袭力成正相关，提示川芎嗪可能是通过下调MMP-9 mRNA的表达而抑制Hep-2细胞的侵袭转移能力。此外，实验显示0.1g/L川芎嗪对Hep-2细胞与FN的粘附能力无明显抑制作用，可能与药物浓度过低有关；0.2g/L组与0.15g/L组比较，川芎嗪对Hep-2细胞MMP-9 mRNA的抑制作用无差异，其抑制作用不呈剂量依赖性，而川芎嗪对Hep-2细胞侵袭能力的抑制作用呈剂量依赖性，说明川芎嗪可能还通过其它机制发挥抗侵袭转移的作用。
综上所述，低浓度川芎嗪可以有效抑制喉鳞癌细胞株Hep-2细胞的侵袭转移能力，其作用机制可能与下调Hep-2细胞MMP-9 mRNA的表达有关，是一种较好的抗肿瘤侵袭转移的药物，具有良好的临床应用前景。
参考文献
1 Furusaka T.New Combination Therapy to Improve the Functional Preservation Rate of the Larynx in Laryngeal, Oropharyngeal, and Hypopharyngeal.Gan To Kagaku Ryoho. 2015;42(10):1141-1147.
2 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养. 西安：世界图书出版公司，2004:216-228.
3 杨君，舒敬德，方庆丰，等.川芎嗪对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231侵袭黏附能力的影响. 中国临床药理学杂志.2012;28(5):352-354.
4 Hajighasemi F,Gheini MH.Lipopolysaccharide Effect on Vascular Endothelial Factor and Matrix Metalloproteinases in Leukemic Cell Lines In vitro.Iran J Cancer Prev.2015;8(3):e2327.
5 Zhang H,Shen B,Swinarska JT,et al. 9-Hydroxypheophorbide α-mediated photodynamic therapy induces matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9 down-regulation in Hep-2 cells via ROS-mediated suppression of the ERK pathway.Photodiagnosis Photodyn Ther.2014;11(1):55-62.
论文作者:李圆 周雪华 崔彩霞 陈朝辉 代丽丽 魏庆宇 罗嵩
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/21
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