李昌禹[1]2003年在《人参发根诱导及高产发根无性系的筛选研究》文中指出本试验建立了人参发根适宜的诱导方法。采用菌液针刺、菌脓涂抹和菌液共培养等方法，利用发根农杆菌A_4对吉参1号的根、茎及叶等外植体进行发根诱导试验。人参茎、叶、叶柄及幼根等外植体间，人参幼根诱导率高；不同诱导方法，以菌液滴加法对人参发根的诱导率最高。结果表明，以人参二年生根片菌液滴加法诱导发根较好。利用rolC基因特异引物从人参发根R9923系基因组中扩增出0.8kb DNA片段，表明，其确为发根农杆菌A_4诱导的转化根。 进行了高产发根R9923系的筛选研究。将生长较快的几个发根系进行液体培养，R9923系生长速率最高为28.8倍，发根干重最高达28.4克/L，总皂苷含量为1.52%，总皂苷产量高达0.432g/L。通过对各发根系生长速率、发根干重和总皂苷含量与产量等性状的综合比较，确定了高产人参发根R9923系。 进行了发根系R9923生物产量及其皂苷的关系研究。发根生物量的形成大约经历以下时期：延迟生长期，对数生长期，直线生长期与减慢期。高效液相色谱分析表明，人参发根在整个生长期间，均有持续、稳定合成人参皂苷的能力，皂苷含量的变化与发根生长的周期性和培养液中糖等营养成分的消长有关，发根中皂苷的积累随生物量的增加而大幅度提高，二者呈正相关。 优化了发根的培养条件，并初步研究了人参发根工厂化生产工艺，为人参发根工厂化生产奠定了理论基础。发根继代培养宜在N/5固体培养基上，悬浮培养液为1/2MS；发根培养时在2周前须进行补料，以保证发根的正常生长和皂苷的积累。发根种子罐接种量为3～5克，培养时间约2周，次级培养罐接种量为30克左右，再培养2周，即可转入生产罐中进行皂苷的生产，直至4周后采收。
郜玉钢, 孙卓, 臧埔, 王南, 赵春琳[2]2010年在《人参发根的诱导及其分子检测》文中研究说明[目的]探讨发根农杆菌诱导人参发根分子机理。[方法]用发根农杆菌A4菌株感染3年生人参根外植体,在无激素的MS培养基上诱导人参发根,并对其进行分子检测,考察rolB和rolC基因是否转化并整合到人参基因组中。[结果]成功获得了人参发根,该发根在固体和液体培养基上得到了很好的继代;从人参发根DNA中检测到rolB和rolC基因,与已发表发根农杆菌质粒相应的核苷酸序列的同源性达到99%。[结论]发根农杆菌质粒的rolB和rolC基因已转化并整合到人参基因组中,是人参发根产生的分子机理。
王士杰[3]2011年在《茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究》文中认为人参在中国有着几千年的药用历史,作为名贵药材和补品,在中医学及其他国家民族医学中一直占有重要地位。由于人参生长对环境的要求高,目前普遍采用伐林栽参方式进行人工栽培,对林地破坏严重,环境代价高昂,寻求替代资源成为解决这个难题的一个有效途径。人参发根由发根农杆菌(本实验采用A4菌株)侵染人参根外植体转化而成,属非天然植物。与传统的植物组织培养、细胞悬浮培养相比,植物发根具有生长速度快、活性物质含量高和遗传性状稳定等特点。人参发根培养目的之一就是要获得相对含量较高的人参皂苷,实现人参皂苷工厂化生产。发根中次级代谢产物含量受培养条件、营养因子、前体物和诱导子等因素影响,茉莉酸甲酯作为一种植物信号分子,能够促进次级代谢产物积累,提高发根中人参总皂苷的含量。随着生物工程的日益发展,应用代谢工程手段改变植物细胞生物合成途径,提高次级代谢产物产量已经逐渐成为研究热点。本文对人参发根叁角瓶摇床培养进行考察,通过添加不同浓度的茉莉酸甲酯进行诱导,最终确定浓度在200μmol·L-1时效果最好,在一个培养周期内人参发根生物量增长13.82倍,人参发根总皂苷含量达到2.28%,比对照高35.71%。同时,我们使用实验室自行设计研制的发酵罐进行了人参发根培养实验,结果表明,人参发根在发酵罐中培养30天,生物量平均增长达到23.14倍,人参发根总皂苷含量达到2.04%,人参皂苷单体Rb1、Rd的含量比对照有较大提高,分别提高55.0%和30.1%。人参发根生长迅速,无需添加外源激素,次级代谢产物含量高,茉莉酸甲酯作为诱导子对于提高人参皂苷含量有明显的促进作用,同时表明经改进的发酵罐能够满足人参发根生长需要,有利于进行扩大培养。人参发根次级代谢产物人参皂苷的种类和含量的差异与生物合成途径中相关基因差异表达调控有关。为研究这些差异表达基因,本实验利用抑制消减杂交技术构建了以茉莉酸甲酯诱导的人参发根为检测子、以对照人参发根为驱动子的抑制消减文库(SSH文库)。采用Trizol法提取两种人参发根材料的总RNA,分离纯化,获得的高质量驱动子和检测子mRNA。采用Clontech公司SSH试剂盒进行差减杂交,构建的人参发根消减文库,经蓝白斑筛选出117个cDNA阳性克隆,文库的重组率在85%以上,满足文库构建要求,其中97个cDNA克隆测序成功。消减文库的差减效率检测表明将18S rRNA基因减弱了212倍,使差异表达cDNA也被富集了同样的倍数。菌落PCR结果表明文库的外源片段的长度分布在200～1,000 bp之间,平均片段长度在500 bp左右。结果表明：所构建的SSH文库在RNA提取质量、插入片断大小、重组率、消减效率等方面均符合文库的质量标准,能够满足下一步实验的要求。采用质粒提取试剂盒对文库中所有的阳性克隆进行质粒DNA提取。对人参发根构建的抑制消减杂交cDNA文库中的97个EST克隆测序,其数据经过手动去除载体序列,Seqman序列拼接组装,Blastx、Blastn和Interproscan的注释,结合GO功能分类,完成对EST序列统计分析。结果显示：对成功测序的有效克隆进行聚类分析,发现有5个重迭群和79个单拷贝EST,代表了共计84个独立基因。基因注释及功能分类结果表明：已知功能的唯一序列共53个,占63.1%,未知功能唯一序列31个,占36.9%。对84个唯一序列进行功能分类,得到11类。其中有16个克隆与代谢途径相关；31个未知基因；5个克隆与压力反应有关；6个克隆与生物合成有关；7个克隆与tRNA修饰,GTPase,离子结合相关；5个克隆与蛋白质折迭水解有关；1个克隆与转录调控有关；4个克隆与信号传导有关；4个克隆与分泌途径有关；2个克隆与电子传递有关；3个克隆与细胞组织结构有关。对人参皂苷合成相关的EST序列PRB3、PRB6进行分析,在Genebank上进行同源蛋白比对得到两个同源性达到97%的基因编码产物,分别是鲨烯合酶和鲨烯环氧酶,查找开放阅读框,并进行保守区预测。人参发根SSH文库构建成功,获得了在MeJA诱导下的差异表达基因,对人参皂苷合成途径中关键酶和关键基因的克隆、表达以及新基因的发现和功能研究奠定了物质基础。
崔学政, 李闯, 孙春玉, 蒋世翠, 张美萍[4]2012年在《人参基因工程研究进展》文中认为已有研究表明,再生和遗传转化体系的建立是开展基因工程研究的前提和基础,文中针对农杆菌介导的人参遗传转化以及转基因技术在人参皂苷生产和生物反应器方面的研究进行了综述,并就目前人参基因工程研究存在的问题和今后的主要发展方向进行了展望。
参考文献：
[1]. 人参发根诱导及高产发根无性系的筛选研究[D]. 李昌禹. 中国农业科学院. 2003
[2]. 人参发根的诱导及其分子检测[J]. 郜玉钢, 孙卓, 臧埔, 王南, 赵春琳. 安徽农业科学. 2010
[3]. 茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究[D]. 王士杰. 吉林农业大学. 2011
[4]. 人参基因工程研究进展[J]. 崔学政, 李闯, 孙春玉, 蒋世翠, 张美萍. 安徽农业科学. 2012