哈尔滨疾病预防控制中心 黑龙江 10056
摘要：目的 了解哈尔滨市地区诺如病毒流行特征及主要流行株的基因型。方法 采集2016年哈尔滨市哨点医院监测的301份疑似腹泻患者的粪便标本，采用荧光定量PCR检测诺如病毒RNA，并对阳性标本进一步测序分析。结果哨点监测病例诺如病毒阳性率20.93%，对序列进行分析，共检测出4种基因型诺如病毒，分别为GⅡ.P12/GⅡ.3型34株、GⅡ.Pe/ GⅡ.4型15株、GⅡ.17型11株及GⅡ.P16/GⅡ.2型4株；结论 诺如病毒感染性腹泻流行毒株仍以GⅡ组为主，GⅡ.P12/GⅡ.3型与GⅡ.Pe/ GⅡ.4型是2016年哈尔滨地区主要流行株。
关键词：诺如病毒；基因型；流行株
Molecular epidemiological characteristics of Norovirus in diarrhea cases in in Harbin from 2016
Wang Yu，Ren Li-na，Du Xi-qiao（Harbin Center For Disease Control And Prevention，Harbin，Heilongjiang Province 10056，China）
Corresponding author：Wang Yu，Email：wangyusky73@163.com.
Abstract：Objective It was investigated that the epidemic characteristics and dominant genotype of Norovirus in Harbin.Methods Fecal specimens and cases samples were respectively collected from 301 suscepted diarrhea patients in sentinel hospitals of Harbin and twice epidemic outbreaks of Norovirus．Norovirus RNA was detected by Realtime RT-PCR and positive specimens were further amplified and sequencing analysis.Results The positive rate of Norovirus in diarrhea patients was 20.93%，sequences analysis showed that there were four genotypes of Norovirus，including 34 strains of GII.P12/GII.3，15 strains of GII.Pe/GII.4，11 strains of GII.17 and 2 strains of GII.P16/GII.2..Conclusion The major epidemic period of Norovirus were autumn and winter in Harbin.GII.17geneotype was the major pathogen causing infection in Harbin and the predominant strains were GII.P12/GII.3 variant and GII.Pe/GII.4variant in 2016．
Key words Novovirus；genotype；predominant strains
腹泻病是儿童的重要疾病之一，据世界卫生组织WHO的报告，腹泻病已经成为造成5岁以下儿童死亡的第二位原因，仅次于肺炎[1]。每年5岁以下死亡的儿童中，因为腹泻原因造成的占1/5比例，约150万[2]，而诺如病毒感染导致的腹泻病，又在其中占有重要的地位，在发展中国家，诺如病毒已累计导致21.8万5岁以下儿童死亡[3]。
诺如病毒（Novovirus，NV）根据基因特征可分为6个基因组（GⅠ-GⅥ），其中GⅠ和GⅡ是感染人类两个最主要基因组[4]。该病毒感染性较强，少量病毒即可引起感染，其RNA分子在复制过程中容易发生突变和重组，变异率极高，新变异株极易引起急性胃肠炎的暴发，一旦暴发便会导致严重的公共卫生问题。哈尔滨地区近几年发生了多起由NV引起群体性腹泻疫情，导致大量的人力、物力和财力的损失。本研究收集了301份住院儿童腹泻患者便样，初步了解本地区的NV的分子流行特征，为NV的疾病预防控制和疾病负担研究提供相关科学依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源
采集2016年1-12月期间哈尔滨市某哨点医院监测点5岁以下门诊腹泻患儿的粪便标本，于-80℃保存备用。腹泻诊断标准按照WHO指导原则[5]：排便次数在24 h内大于或等于3次，大便性状改变（呈稀便、水样便、黏液样或稀糊样等），同时登记每例腹泻患者的姓名、性别和年龄等信息。
1.2 仪器与试剂
ABI7500 Fast荧光定量PCR仪、病毒核酸提取试剂盒（硕世，SD60104）、诺如病毒GⅠ和GⅡ双重实时荧光PCR检测试剂盒（硕世，A2602-50T）。
1.3 标本处理及阳性标本检测
解冻粪便样本，取约0.1g粪便，加入900μlPBS溶液（pH 7.2），制成10 %便悬液，后漩涡振荡器混匀30 s，室温静置10 min后，于8000 r/min离心5 min，吸取200 μl上清液，按硕世病毒核酸提取试剂盒说明书操作，核酸-20℃保存备用。诺如病毒GⅠ和GⅡ双重实时荧光PCR检测试剂盒检测诺如病毒，检测条件及判断按说明书要求。
1.4 基因序列测定
收集2016年NV阳性标本核酸，选用QIAGEN One Step RT-PCR Kit扩增序列，测序引物中国疾病预防控制中心病毒所赠与（表1）。RT-PCR反应体系：5×RT-PCR Buffer 5μl，dNTP mix（10 Mm）1μl，RT-PCR Enzyme mix 1 μl，Rnase Inhibitor（20 U / μl）1μl，上下游引物（50 μM）各0.5 μl，RNA 5 μl，加去离子水至25 μl。反应条件：42 ℃反转录30 min，再95 ℃预变性15 min后，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，扩增40个循环，72 ℃终延伸10 min。GⅠ与GⅡ基因型PCR扩增产物分别为543 bp和557 bp，PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后，阳性送上海博杰公司进行测序。
表1 诺如病毒扩增引物
2.1 哨点医院监测
2016年哨点监测医院共收集到合格标本301份，阳性率为20.9 %（63 / 301），5岁以下住院儿童发病时间分布上，高峰期出现在10月，检出率达到38.1%，受其影响，11月亦出现小高峰，9-12月共检出NV 40份，检出率为63.49 %，总体上秋冬季节检出率较高，而其他月份较低。
性别感染差异上，301例腹泻病例中男童187人，检出NV阳性39份；女童114人，检出诺如病毒阳性24份。
诺如病毒感染患儿的临床情况，具有呕吐症状的占25.13%，腹泻次数最多为9次/天，最少为1次/天，平均持续4天。阳性腹泻粪便性状中以蛋花样便最多占，稀糊样便次之，水样便最少。
2.2 序列分析结果
2016年监测病例中共发现4种基因型，依次为GⅡ.P12/GⅡ.3型34株、GⅡ.Pe/GⅡ.4型14株、GⅡ.17型11株及GⅡ.P16/GⅡ.2型4株。34株GⅡ.P12/GⅡ.3与参考株（GeneBank：KU529185）同源性为96.03~99%，14株GⅡ.Pe/GⅡ.4与参考株（GeneBank：JX459908）核苷酸为89.3~95.1%，11株GⅡ.17型与参考株（GeneBank：KR020503）同源性为96.4~99.3%，4株GⅡ.P16/GⅡ.2型与参考株（GeneBank：KY865306）同源性95.3~98.1%
3 讨论
据美国CDC统计，诺如病毒在美国每年约可导致2100万的急性胃肠炎病例、7万的住院病例和800的死亡发生[6]。我国自1995年首次报道NV感染以来，在北京、上海、广东、江苏、浙江等多个地区报道了NV感染导致的急性胃肠炎的散发和暴发流行[7-9]。
本研究通过对住院病历与暴发疫情的监测数据发现，哈尔滨地区诺如病毒感染性腹泻流行株以GⅡ组为主，2016年优势毒株为GⅡ.P12/GⅡ.3型。其次占第二、第三位的流行株为GⅡ.Pe/GⅡ.4变异株和GⅡ.17型。近几十年来，GII.4基因型诺如病毒是全球最主要的流行基因型，目前该型别依然是我国主要流行型；近年以来GII.17基因型诺如病毒引起的感染逐渐增多，并在我国及日本等亚洲国家和地区引起暴发流行，呈现增值趋势，并且在暴发疫情统计中，由GII.17型导致的占到75%。由于不同基因型别的诺如病毒可同时感染同一个宿主，在病毒包装过程中容易在ORF1/ORF2重叠交界区发生重组，自然环境下可检测到不同G/P组合的毒株[11]，Chan[12]和Han[13]等人的研究认为GII.17诺如病毒新变异株的高发人群为大龄儿童和成年人，要警惕由该型别NV引起的中学以上校园和人员密集公共场所病毒性胃肠炎的暴发。
哈尔滨地区首次在腹泻患者检测到GII.P16/GII.2突变株。目前，世界各地对GII.P16/GII.2变异株引起散发病毒胃肠炎感染和暴发情况较少，Wang[14]等在对2007-2009年武汉地区诺如病毒调查中，首次在我国检测到GII.P16/GII.2变异株，并且只发现于儿童患者。
另外，诺如病毒感染性腹泻散发与暴发疫情流行在不同地区时间分布存在较大差异，具有明显的季节性分布规律。研究显示，国内诺如病毒胃肠炎暴发主要集中在1-3月份和11-12月份两个阶段[15]。本实验室，两次高峰期分别延迟1-2个月与提前3-4个月，监测显示哈尔滨地区高峰流行期与南方地区略有不同，哈尔滨地处我国北方高寒地区，季节转换期与南方地区不同，流行依然呈现出冬季高发的趋势。
本研究从分子流行病学角度分析了哈尔滨地区诺如病毒的流行现状，对于GII.P16/GII.2等新型变异株应特别给予重视，近期一种新变异重组株GII.P16/GⅡ.4 Sydney_2012引起2016年冬季日本诺如病毒大流行，因此开展诺如病毒连续监测，及时发现新的变异株，对于进一步认识诺如病毒，及时有效控制诺如病毒感染性腹泻疫情具有十分重要。
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作者简介：
王宇（1984-），男，黑龙江哈尔滨人，主管检验技师，硕士，主要从事病毒分子生物学研究。
论文作者:王宇,任莉娜,杜溪乔
论文发表刊物:《健康世界》2018年20期
论文发表时间:2018/11/23
标签：病毒论文; 哈尔滨论文; 胃肠炎论文; 地区论文; 阳性论文; 标本论文; 检出论文; 《健康世界》2018年20期论文;