黑龙江省医院 150036
【摘 要】目的 探讨放射线对于脂质体传染的影响，探索提高脂质体传染效率的方法。方法：在转染Pegfp-N1荧光表达质粒前1h照射，剂量分别为0、2、4、8Gy，并且在18h后行倒置荧光显微镜下观察荧光表达，同时在照射36h后，使用倒置荧光显微镜观察PEGFP-N1荧光表达质粒转染细胞，并计算转染效率。结果：行0、2、4、8Gy剂量照射，转染效率分别为20%、62%、68%、78%。结论：利用放射线照射可以明显提高脂质体的转染效率，并且其效率与病毒载体相近。
【关键词】放射线；脂质；转染；直肠癌HR-8348细胞；实验探讨
虽然基因治疗对肿瘤细胞株具有一定程度治疗效果的，但是由于其转染效率较低、安全性较差以及缺乏可反复应用的载体，因此尚未在临床中得到广泛运用[1]。最近几年随着医学技术的进步，专家逐渐发现脂质体转染可以有效避免病毒载体的低安全性和不可反复运用性，为了能够探讨放射线对于脂质体传染的影响，探索提高脂质体传染效率的方法，对此我院行放射线促进脂质体转染人直肠癌HR-8348细胞的实验，现将研究结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 仪器和试剂 仪器：倒置荧光显微镜和CO2孵育箱。试剂：LIPOFECTIN REAGENT GIBICOL、1640培养基、胎牛血清GIBICOL、CO60源、pegfp-N1荧光表达质粒、HR-8348细胞、DH5A大肠杆菌菌株。
1.2 方法 具体操作步骤包括以下几点：（1）使用浓度为0.125%的胰蛋白酶消化细胞进行细胞计数，并将所得细胞数按照300、300、300、600、1200、2400放置在35mm的培养皿内；（2）在培养皿内加入剂量为2ml的培养液，同时设置3个复孔，并按照0、0.5、1、2、4、8Gy进行照射；（3）照射完毕后，将其放置在温度为37摄氏度、浓度为5%的CO2孵育箱中，时间为14天；（4）若培养皿中出现克隆时（肉眼可见）则停止培养，同时还需将培养液倒掉并使用酸碱值为7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐进行缓冲，共缓冲2次；（5）加入剂量为3ml的甲醇进行固定，15min后将固定液倒掉；（6）加入适量的的姬姆萨应用液进行染色，时间为20min；（7）使用流水缓慢将染色液祛除，在空气干燥情况下以肉眼计算克隆个数。（8）重复上述操作2次。（9）计算每次存活分数，并使用放射所研制的细胞剂量存活曲线计算机处理程序对结果进行相关处理。
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1.3 荧光表达质粒的提取和制备 分别利用氯化钙来制备新鲜大肠埃希菌感受态和碱裂解法制备感受态和质粒的提取[2]。
1.4 PEGFP-N1质粒照射和指标观察 对1h后转染PEGFP-N1质粒进行0、2、4、8Gy的不同剂量照射，并且在18h后行倒置荧光显微镜下观察荧光表达，同时在照射36h后，使用倒置荧光显微镜观察PEGFP-N1荧光表达质粒转染细胞，并计算转染效率。
1.5 统计学分析 在统计方法上使用SPSS11.0（Statistical Product and Service Solution）统计软件，数据用xs表示，P0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 放射线对PEGFP-N1荧光表达质粒效果 在荧光表达质粒转染细胞的转染效率方面，放射组和未放射组具有显著差异（p<0.05）。在不同照射剂量（0、2、4、8Gy）前提下，36h后行倒置荧光显微镜下观察观察PEGFP-N1荧光表达质粒转染细胞的转染效率分别为20%、62%、68%、78%，由这个数据发现，经放射线照射后脂质体传染细胞的转染效率和病毒载体比较接近，因此在临床中可以将其作为治疗手段。
3 讨论
直肠癌是由直肠组织细胞发生恶变引起的消化道常见疾病，随着社会经济的发展和生活水平的改善，直肠癌的发病率呈现上升趋势。对直肠癌患者行传统手术治疗，由于术后复发率高达40%且术后生存时间仅为9个月，随着基因工程的广泛研究，目前自杀基因治等基因治疗具有广泛的使用前景，但是随着“杰辛格事件”的发生，使得基因治疗的安全性也受到质疑，因此如何使用新的治疗方法成为医学界一道难题。利用脂质体转染基因治疗具有较高安全性、排异性弱、易于反复转染，但是其转染效率远低于病毒载体的转染率。除了基因治疗外，放射治疗也是治疗恶心肿瘤的一种手段，且转染率较高但同时也存在安全性和反复性差等问题。若能够将基因治疗与放射治疗相互结合，不但可以克服基因治疗带来的转染率低的问题，而且还具有较高的安全性、反复性，因此二者的有效结合，无疑有利于肿瘤患者的进一步治疗。
本次研究发现采用多靶型模型拟合曲线和参数，直肠癌HR-8348细胞的LD50、LD70、LD80的数值参数分别为2Gy、4Gy、8Gy；在直线范围内将存活分数下降至63%则此刻所需的剂量DO值显示为3.92，而此时相对应的细胞积累亚致死性损伤的能力与细胞损伤修复有关的DQ 值和N 值等参数分别4.23和1[3]。
目前医学界对放射线促进外源基因的转染机制尚未形成统一观念，但是绝大部分医师认为，由于DNA损伤可以在数分钟内进行逆转，放射线所导致的细胞膜和的转运功能也会起到一定的保护作用，放射进一步导致一些基因的转运也有可能影响到细胞的转运，因此放射线不会造成DNA的损伤。
综上所述，利用放射线照射可以明显提高脂质体的转染效率，并且其效率与病毒载体相近。
参考文献：
[1]吴荣，迟蜂.结直肠癌术后局部复发或转移的三维适形放疗[J].中华放射肿瘤学杂志，2009，4（11）：302.
[2]Lee Chong Yun，Cai Yong，Liu，and other more multi-slice spiral CT，B ultrasound，abdominal X-ray diagnosis of intestinal obstruction clinical value[J]Journal of Clinical Medicine，2009，12（2）：100-101.
[3]蔡欣，孙新亮，邹杨，等.L-OHP联合5-Fu/LV 二线治疗晚期大肠癌2周方案与3周方案的临床比[J].临床肿瘤学杂志，，2009，4：247-249.
论文作者:汪宁宁,高敏,季宏波,姜华,崔文慧,李莉
论文发表刊物:《航空军医》2015年8期供稿
论文发表时间:2015/12/18
标签：转染论文; 质粒论文; 放射线论文; 细胞论文; 效率论文; 基因治疗论文; 荧光论文; 《航空军医》2015年8期供稿论文;