马振莲[1]2003年在《大鼠脊髓损伤修复相关基因的分离与初步分析》文中研究指明脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一类高致残率的中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病，SCI的治疗一直是困扰神经生物学的重大难题。近年来科学家尝试用多种手段治疗脊髓创伤，如外周神经移植、胚胎脊髓组织移植、细胞治疗和基因治疗等，取得了显着进展。但这些治疗手段主要侧重于外界因素对神经再生的影响，由于脊髓损伤后修复的分子机理还不清楚，因而无法针对在修复过程中起关键作用的分子进行直接、有效的干预。脊髓损伤后的修复过程中在基因水平上发生一系列复杂的变化，包括基因表达、结构和功能的改变，某些变化可以直接影响损伤后的修复过程。探讨脊髓损伤修复的分子机理、寻找治疗SCI相关疾病的合适的药物靶标已经成为迫切需要解决的问题。目前，这方面的研究主要着眼于损伤后较短时间内(1h-3d)基因表达谱的变化，关于修复过程中分子水平的变化至今未见报导。本研究的目的在于寻找在脊髓损伤后的修复过程中起关键作用的分子，为临床治疗SCI提供合适的药物靶标。 近年来兴起的消减杂交技术是分离组织或细胞间差异基因的有效方法。本实验采用基于PCR的消减杂交方法，并在经典消减杂交的基础上引进了一些新的技术，如Cap-finder技术、长距离PCR、Biotin-dNTP、磁性分离系统和Sephacryl离心柱分离技术。在建立的损伤修复模型基础上，通过两轮改良消减杂交构建脊髓损伤后4.5天的cDNA消减文库。该文库的扣除效率，通过钓取管家基因G3PDH和损伤脊髓中高表达基因basigin进行了鉴定，结果表明消减杂交后G3PDH的丰度大大降低，而basigin在消减文库中的丰度显着增加。两轮杂交后的目的cDNA扩增产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取110个克隆进行酶切鉴定，并对重组质粒进行测序分析，去除重复序列后初步筛选得到51个差异克隆。进一步通过反向点杂交剔除11个假阳性克隆，最终得到40个差异克隆。根据测序结果对部分差异序列设计引物，进行半定量RT-PCR验证。然后将40个差异序列与Genbank序列数据库进行同源性比较，分析发现其中32个是已知基因，其余8个为新基因。32个已知基因中，包括Synuclein、Clusterin、Gaa、Vimentin、Reticulon、Neurofascin等与神经系统发育、退行性病变、神经细胞的存活及轴突延伸密切相关的分子。对8个未知基因片段进行了较为全面的生物信息学分析，运用SMART功能分析软军事医学科学院硕士学位论文件对开放读框进行功能域搜索，结果显示69号基因ORF末端含有一Leu拉链结构，该结构是转录因子与其DNA调控序列进行特异结合的保守结构域之一，目前发现主要存在于一些与细胞周期调控相关的分子中，与细胞生长、分化和调控密切相关。因此69号基因可能是在脊髓损伤修复过程中起关键作用的调控因子。然后运用CDNA末端快速扩增法（RACE）对69号克隆的了和3’末端进行扩增，得到了5’末端序列，为深入研究它在脊髓损伤修复过程中的功能奠定基础。
贾祎佳[2]2014年在《转SHH基因的骨髓间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤的实验研究》文中指出由于交通事故、外伤、塌方、自然灾害等原因导致的脊髓损伤（Spinal cordinjury, SCI）一直是医学界的难题之一。脊髓损伤可以导致神经细胞的缺失，破坏神经传导，进而引起许多组织、器官功能障碍，是最常见的一种致残、致死率性疾病。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担，严重影响人类生活质量。目前脊髓损伤的主要治疗方法包括手术解除压迫、类固醇、蛋白激酶、金属蛋白酶抑制和再生技术等，但是治疗效果有限。近年来，关于脊髓损伤后的修复治疗研究取得了很大进展，其中干细胞基因疗法移植治疗是公认的有希望的治疗方法，是目前治疗脊髓损伤的研究焦点。研究表明骨髓间充质干细胞具有来源广泛、具有良好的增殖和分化能力、易于获得和培养、免疫排斥反应低，而且不涉及伦理问题，是理想的基因治疗的载体。在治疗脊髓损伤方面，骨髓间充质干细胞可以分泌神经营养因子，改善脊髓损伤的微环境；具有桥接作用，可以为轴突再生提供一个很好的连接通道；可以促进新生血管的形成并对损伤部位进行靶点归巢。然而由于脊髓损伤后局部缺血、低氧等微环境的改变，骨髓间充质干细胞移植后不能很好的存活，这极大程度上限制了它的应用。生长因子对于脊髓损伤的修复必不可少。音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）是胚胎发育过程中由脊索产生的一种因子，作为一种重要的调控因子Shh参与了调控了神经系统的发育和分化过程。当前研究表明Shh信号途径在胚胎干细胞分化为神经系统的过程中是必须的。它在以下方面对脊髓再生产生作用：音猬因子可以诱导干细胞生成运动神经元和少突胶质细胞,提高骨髓间充质干细胞分泌神经营养因子,促进神经元的存活和促进轴突的生长,阻碍星形胶质细胞的生成。然而因为Shh的快速清除性，Shh蛋白的注射并不能对脊髓损伤功能恢复产生很好的效果。在我们的实验中，我们使用转染音猬因子基因的骨髓间充质干细胞来治疗脊髓损伤，它可以持续稳定的分泌和表达Shh，尝试着解决音猬因子快速清除性和骨髓间充质干细胞的生存问题，进而可以很好的促进脊髓损伤后功能的恢复。本实验从细胞研究及动物实验两个方面进行了相关工作。研究内容主要包括以下叁个部分：1提取骨髓间充质干细胞并进行培养和鉴定。2构建Shh载体，采用慢病毒技术转染骨髓间充质干细胞并进行鉴定。3制作大鼠脊髓损伤模型，通过蛛网膜下腔注射转Shh的骨髓间充质干细胞，观察脊髓损伤后的修复效果。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定研究目的建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养，并进行细胞形态学、细胞增殖、细胞表面标记物、成骨成脂诱导分化的鉴定。研究方法1.实验动物健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重160-200g,由北京军事医学科学院动物实验中心提供。2．大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的原代分离培养10%水合氯醛腹腔麻醉SD大鼠，无菌条件下快速取大鼠的股骨及胫骨，PBS清洗干净。用剪刀剪掉长骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有100U/ml青、链霉素的L-DMEM培养基将骨髓冲出，直至骨髓腔发白；将冲出的骨髓内容物制成单细胞悬液，1200r/min离心5分钟，弃去上清，重悬细胞置于SD MSC完全培养基中生长，接种浓度为6-8×l06/ml，置于37°C、5%CO2的细胞培养箱中。3.BMSCs的纯化及传代在原代培养过程中，48小时后半量更换培养基，以后每3d全量更换含有10%胎牛血清的L-DMEM培养基，当细胞铺满培养皿约80%时，使用胰酶-EDTA溶液消化，1:3的比例进行传代培养。4.BMSCs的形态学检查培养后使用倒置显微镜观察贴壁细胞的形态变化以及生长情况，并进行拍照。5.MTT法检测细胞增殖能力取生长状态良好的SD大鼠BMSCs传至3代并接种于96孔培养板中，接种密度为5×103/孔，将细胞培养板置入浓度为5%的CO2培养箱中培养。每日取出一板采用MTT法进行检测。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上连续7日测定各孔光吸收值，并记录结果。以观测时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。6.流式细胞术测定BMSCs的细胞表面标记物表达取第3代生长状态良好细胞，胰酶-EDTA溶液消化，4°C离心，1200r/min，5min，计数细胞，各管依次加入单克隆抗体CD29, CD34, CD44, and CD45。室温孵育30min，PBS液洗涤细胞3次，除去未结合抗体，与FITC标记和PE标记的二抗避光作用30min， PBS液重悬细胞并置于冰上，流式细胞仪进行检测分析。7.BMSCs的成骨成脂诱导分化能力取第3代BMSCs，接种于6孔的细胞培养板中，待贴壁细胞密度达到80%时，在各诱导孔的完全培养液中分别加入成骨细胞诱导剂和成脂细胞诱导剂，各诱导孔每3天换液1次，同时设置未加诱导培养液的细胞培养孔作为空白对照。成骨细胞诱导剂诱导28天后，室温下40g/L多聚甲醛固定10分钟，然后对诱导分化的成骨细胞进行茜素红染色；成脂细胞诱导剂诱导23天后，40g/L多聚甲醛固定，然后对诱导分化的脂肪细胞进行油红O染色。倒置显微镜观察并拍照。结果1.BMSCs的形态学观测SD大鼠骨髓间充质干细胞形态以梭形细胞为主，呈放射状细胞集落单位排列，细胞生长良好，可持续稳定传代10代以上。2.BMSCs的细胞生长曲线细胞生长曲线显示BMSCs符合正常细胞生长特征并且生长活跃。3.BMSCs表面标记物的表达第3代骨髓间充质干细胞CD29，CD44均呈阳性表达，而CD34，CD45呈阴性表达。4.BMSCs成骨成脂诱导分化鉴定成骨、成脂诱导分化后，茜素红染色和油红O染色均呈阳性。小结全骨髓贴壁培养法操作步骤简单，能够大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，获得的细胞具有骨髓间充质干细胞的生物学特性，经诱导分化培养后具有成骨成脂分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为基因工程提供充足的载体细胞来源具有重要的现实意义。第二部分构建转音猬因子基因的骨髓间充质干细胞和鉴定研究目的以慢病毒为载体，体外构建音猬因子基因转染的骨髓间充质干细胞，并对转染细胞的转染效率进行鉴定，为干细胞移植治疗脊髓损伤提供稳定可靠的细胞来源。研究方法1.构建大鼠音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）的载体首先利用重迭PCR扩增attB1-Shh-attB2；然后利用Gateway Technology构建pDown-Shh；最后使用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/puro-EF1α>Shh>IRES/DsRed（red fluorescent protein，红色荧光蛋白）Express2。2.构建Shh慢病毒并利用其感染BMSCs在脂质体Lipofectamine2000作用下转染293T细胞，逐孔滴度稀释法检测慢病毒滴度；以Shh慢病毒感染BMSCs，并通过荧光表达法判定Shh转染情况。3.Real-time PCR测定转染细胞Shh的mRNA表达细胞组织总RNA提取后，按照说明书将提取的RNA在一定的化学反应体系以及反转录条件下合成cDNA,在Real-time PCR仪上进行扩增，记录Ct值、扩增曲线以及溶解曲线。并相对定量计算实验结果（2-ΔΔCT）。4.Western blot测定转染细胞Shh的蛋白含量细胞组织提取蛋白质后，用BCA法测定蛋白浓度。配置12%凝胶，上样、电泳、转膜、封闭、一抗反应、二抗反应，化学发光检测。结果1.构建转音猬因子基因的骨髓间充质干细胞构建音猬因子的重组慢病毒载体，经酶切及测序方法鉴定完全正确，可以转染293T细胞并表达，滴度为2-4×108TU/ml，转染BMSCs5日后红色荧光蛋白表达显着增强。2.转Shh基因的骨髓间充质干细胞Shh表达增高同未转染Shh的骨髓间充质干细胞相比，Shh慢病毒感染BMSCs能持续稳定高水平表达Shh mRNA和蛋白。小结成功构建Shh的慢病毒，然后将Shh基因成功转染至BMSCs基因组中，导致Shh的持续稳定高水平表达。为接下来的体内实验提供了基础。第叁部分音猬因子转染的骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤的效果研究目的建立统一的大鼠脊髓损伤模型，然后在大鼠脊髓损伤后的7天将转音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）的骨髓间充质干细胞移植入大鼠脊髓损伤模型，观察骨髓间充质干细胞的存活情况和脊髓损伤的运动功能的恢复。研究方法1.实验动物健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重200-220g,由北京军事医学科学院动物实验中心提供。2.建立大鼠脊髓损伤实验动物模型实验动物10%水合氯醛麻醉（0.3ml/100g,腹腔注射）；然后采用改良的ALLEN打击法。以T10为标志，行椎板切除术，暴露脊髓硬膜囊，垫一塑料垫片，将10g中的打击杆自25mm高度下落25mm(打击杆底部直径2.5mm)撞击脊髓。3.蛛网膜下腔注射转音猬因子的大鼠骨髓间充质干细胞（Shh-BMSCs）治疗脊髓损伤在脊髓损伤造模成功后7天，在大鼠L4节段咬除椎板，通过蛛网膜下腔将Shh-BMSCs移植入大鼠脊髓损伤模型，注射BMSCs和PBS作为对照。4.Shh-BMSCs治疗脊髓损伤后Shh的蛋白测定大鼠脊髓损伤治疗后28日，通过Western blot法检测脊髓组织Shh蛋白水平的变化。5.Shh-BMSCs对脊髓损伤大鼠神经保护作用的测定5.1神经营养因子的表达大鼠脊髓损伤治疗后28日，通过Western blot法检测脊髓组织成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子蛋白水平的变化。5.2BMSCs的存活情况大鼠脊髓损伤治疗后28日，损伤中心冰冻切片使用荧光显微镜观察，ImageJ软件进行BMSCs数量的分析5.3神经丝蛋白200（NF200）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光染色的测定大鼠脊髓损伤治疗后28日，损伤中心周围2mm的冰冻切片进行免疫荧光染色鉴定，经过洗片、破膜、封闭、一抗孵育（神经丝蛋白200和胶质纤维酸性蛋白）、二抗孵育和DAPI染色，最后使用荧光显微镜观察。使用Image J软件进行荧光表达量的分析。5.4尼氏染色对脊髓前角运动神经元进行检测大鼠脊髓损伤治疗后28日，损伤中心冰冻切片进行尼氏染色，经过预热60°C1%的甲苯胺蓝染液染色40min、蒸馏水洗3次、95%酒精快速分化脱色、无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，通风橱中风干后中性树胶封片。倒置显微镜下照相并对脊髓前角运动神经元进行计数，使用Image J软件进行人工定量。5.5HE染色对损伤空洞进行评估大鼠脊髓损伤后28日，损伤中心冰冻切片进行HE染色，Harris苏木素染液染色7分钟，0.5％伊红(水溶性)染液染色2-4分钟，倒置显微镜下照相并对损伤空洞体积进行评估，使用Image J软件进行定量分析。6.Shh-BMSCs对脊髓损伤大鼠行为学影响的评定脊髓损伤术后每一周对大鼠的运动情况进行Basso–Beattie–Bresnahan(BBB)评分，总共6周。由3位实验人员了解评分标准后，采用单盲法进行评分，取测量评分的平均值。7.统计处理实验数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，BBB评分采用重复测量的方差分析。采用SPSS15.0统计软件对数据进行统计分析。P<0.05被认为具有统计学意义。结果1.脊髓损伤大鼠模型建立成功大鼠脊髓损伤后迅速出现摇尾反射，双后肢及躯体回缩，而后呈迟缓性瘫痪，表明脊髓损伤造模成功。术后腹腔注射青霉素并进行膀胱按摩。所有大鼠术后均存活。2.Shh-BMSCs促进体内Shh蛋白的表达大鼠脊髓损伤治疗28日，通过Western blot法检测脊髓组织中Shh的蛋白表达。经过Shh-BMSCs的治疗后，Shh的蛋白水平表达增高，差异有统计学意义。3.Shh-BMSCs能够促进神经保护3.1Shh-BMSCs促进成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子蛋白的表达大鼠脊髓损伤治疗28日，通过Western blot法检测脊髓组织中成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的蛋白表达。经过Shh-BMSCs的治疗后，成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的蛋白水平明显高于BMSCs和PBS治疗，BMSC组蛋白表达高于PBS组，差异有统计学意义。3.2Shh-BMSCs促进BMSCs的存活大鼠脊髓损伤治疗28日，在荧光显微镜下观察BMSCs的存活情况。Shh-BMSCs组BMSCs的数量明显高于BMSCs组，差异有统计学意义。3.3Shh-BMSCs促进NF200的表达，抑制GFAP的表达大鼠脊髓损伤治疗28日，通过免疫荧光法检测脊髓组织中NF200和GFAP的荧光表达。Shh-BMSCs组NF200的荧光表达水平明显高于BMSCs组和PBS组，BMSCs组NF200的荧光表达水平高于PBS组,差异有统计学意义，Shh-BMSCs组GFAP的荧光表达水平明显低于BMSCs组和PBS组，差异有统计学意义，BMSCs组和PBS组的GFAP的荧光表达差异没有有统计学意义。3.4Shh-BMSCs增加了大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动神经元的数量大鼠脊髓损伤治疗28日，通过尼氏染色检测脊髓组织中脊髓前角运动神经元的数量。同BMSCs组和PBS组相比，Shh-BMSCs组脊髓前角运动神经元数量明显增多，BMSCs组脊髓前角运动神经元数量多于PBS组，差异有统计学意义。3.5Shh-BMSCs减少了大鼠脊髓损伤后空洞的面积大鼠脊髓损伤治疗28日，通过HE染色检测脊髓损伤后空洞面积的变化。同BMSCs组和PBS组相比，Shh-BMSCs组脊髓损伤空洞面积明显缩小，BMSCs组脊髓空洞面积小于PBS组，差异有统计学意义。4.Shh-BMSCs促进运动功能的康复在BBB评分期间，从2周到6周，Shh-BMSCs组大鼠的BBB评分明显高于BMSCs组和PBS组，BMSCs组明显高于PBS组，差异有统计学意义。小结Shh-BMSCs在治疗脊髓损伤的过程中，Shh可以持续分泌，Shh表达增强，促进了BMSCs的存活，增强了神经的保护和运动功能的康复，能够促进脊髓损伤后神经功能的恢复，可以为临床治疗脊髓损伤提供更好的方法。
赵志军[3]2017年在《bcl-2基因修饰雪旺细胞蛛网膜下腔移植修复大鼠脊髓损伤》文中研究说明目的:探讨bcl-2基因转染雪旺细胞蛛网膜下腔移植对脊髓损伤大鼠损伤神经功能恢复的影响。方法:体外培养大鼠雪旺细胞,经Ad-EGFP为载体介导端B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)基因转染雪旺细胞,分为3组:对照组、阴性转染组及bcl-2转染组。Western blot检测雪旺细胞被转染后第3天和第14天的bcl-2蛋白的表达。选取成年雌性SD大鼠83只,成功造模72只,随机分为对照组,SCs组及bcl-2-SCs组,每组24只。依据改良Allen打击法建造大鼠急性脊髓损伤模型,分别于造模前、造模后1天、3天、1周、2周、3周、4周进行BBB、斜板试验及改良Tarlov方法对各组大鼠进行运动功能评定。造模后7天通过RT-PCR及Western blot检测检测脊髓损伤区周围胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经丝蛋白(NF-200)的表达,采用TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,造模后4周取材行病理切片HE染色及荧光显微镜观测EGFP标记的SCs存活及分布情况,HRP逆行示踪检测神经纤维修复情况,通过SEP和MEP观察大鼠神经电生理恢复情况。结果:Western blot结果显示Ad-EGFP介导的bcl-2基因转染大鼠雪旺细胞体外能稳定表达bcl-2;大鼠下肢运动功能评价bcl-2-SCs组优于SCs组,SCs组优于对照组。造模完成72h,bcl-2-SCs组细胞凋亡数均明显低于其他两组(P<0.05)。造模后7天,与对照组和SCs组相比,bcl-2-SCs组GFAP、NF-200基因和蛋白的表达均较显着升高P<0.05)。造模后4周,HE染色对照组可见脊髓组织缺失及脊髓空洞形成,无神经轴索通过。SCs组损伤区可见少量神经轴索样结构,脊髓空洞较小,bcl-2-SCs组可见较多神经轴索样结构,未见脊髓空洞。EGFP标记的阳性细胞数:bcl-2-SCs组多于SCs组,对照组数量最少,各组数据有统计学差异(P<0.05)。HRP阳性神经纤维数:bcl-2-SCs组>SCs组>对照组,各组之间有显着性(P<0.05)。造模后4周,SEP和MEP的潜伏期:bcl-2-SCs组<SCs组<对照组,且各组之间差异有显着性意义(P<0.05);波幅:bcl-2-SCs组>SCs组>对照组,且各组之间差异有显着性意义(P<0.05)。结论:bcl-2基因修饰雪旺细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,升高脊髓损伤区GFAP、NF-200基因和蛋白的表达,减少脊髓损伤区神经细胞凋亡,提升大鼠的肢体运动功能和电生理功能。
李晓江[4]2010年在《RNA干扰ROCK-Ⅱ基因表达促进脊髓损伤修复的实验研究》文中提出中枢神经系统(central nervoussystem,CNS)损伤后,髓鞘相关性轴突生长抑制因子Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)、少突胶质细胞-髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelinglycoprotein,Omgp)共同作用于高亲和受体NgR,在p75NTR的参与下,激活内源性的Rho后通过活化下游的效应分子ROCK,使其作用底物肌球蛋白磷酸酶磷酸化,从而影响细胞微结构的骨架肌动蛋白系统,最终抑制轴突生长。为了研究特异性shRNA-ROCK-Ⅱ对ROCK-Ⅱ基因表达的抑制和对轴突再生修复的作用,在体外和体内中分别进行了实验研究。体外试验中,将构建的小发夹片段RNA (small hairpin RNA,shRNA)与质粒结合后,通过脂质体介导转染自行培养并纯化、鉴定正确的少突胶质细胞后,应用RT-PCR、免疫组化方法检测ROCK-Ⅱ基因沉默效果,并对转染后的细胞在特定的时间点进行流式细胞术检测细胞生长周期情况。结果表明,体外构建的特异性shRNA-ROCK-Ⅱ有效地沉默了ROCK-Ⅱ基因表达。体内实验中通过制作的大鼠脊髓损伤模型进行分组研究,根据体外实验中观察到的转染后基因抑制的有效时间点,在mRNA水平和蛋白表达水平对ROCK-Ⅱ基因的表达进行评价,特异性shRNA-ROCK-Ⅱ抑制了损伤脊髓组织中的ROCK-Ⅱ基因的表达,同时脊髓损伤后轴突再生特异性生长标志物GAP-43蛋白的表达上调,进一步为说明神经细胞轴突具有再生的倾向提供了依据。实验证明,ROCK-Ⅱ基因的抑制与损伤后脊髓的轴突再生有正相关性,特异性shRNA-ROCK-Ⅱ抑制ROCK-Ⅱ基因的表达可以促进脊髓损伤的轴突再生。本实验利用小干扰RNA(small or short inferenceRNA,siRNA)的有效性和特异性,有效抑制了ROCK-Ⅱ基因的表达,阻断了Rho-ROCK传导通路,抑制了NogoA、MAG、Omgp等轴突生长抑制因子的作用,为脊髓损伤的治疗提供了新的方法。
王博[5]2014年在《细胞因子修饰的MSCs联合红景天促进脊髓损伤修复的实验研究》文中认为目的：在低氧环境下，对雌性大鼠脊髓撞击损伤模型，用中药红景天联合应用角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)和低氧诱导因子-1（hypoxia induciblefactor-1，HIF）基因修饰的骨髓间充质干细胞（marrow-mesenchymal stem cells， MSCs）进行防治，动态评估脊髓损伤修复愈合的速度、质量及功能重建情况，将为低氧环境下脊髓再生修复及功能重建提供新的治疗策略。方法：（1）雄性大鼠MSCs的分离、培养及鉴定，选用CD34、CD45、CD90、CD105抗体进行骨髓间充质干细胞的鉴定。（2）MSCs外源基因的修饰，MSCs分别用200MOI的Ad-KGF-HIF、Ad-KGF、Ad-HIF感染MSCs，72h收集细胞备用。（3）大鼠脊髓损伤模型建立，应用Allen打击法致雌性Wistar大鼠脊髓损伤，创建脊髓撞击损伤模型。（4）细胞移植及红景天的应用，模型大鼠分为7组：生理盐水对照组(a)、红景天组(b)、MSCs移植组(c)、Ad-HIF修饰的MSCs移植组(d)、Ad-KGF修饰的MSCs移植组(e)、Ad-KGF-HIF修饰的MSCs移植组(f)、中药红景天联合Ad-KGF-HIF修饰的MSCs组(g)。（5）组织学观察及功能评估， HE染色观察脊髓出血、水肿；神经尼氏体亚甲蓝染色观察神经细胞肿胀、变性、坏死变化；免疫组织化学法检测KGF和HIF蛋白的表达；功能评估标准采用改良Gale联合评分法（改良CBS法）进行评分。（6）RT-PCR法检测腺病毒及性别决定基因sry的表达丰度，以评价移植病毒的生物分布及移植细胞参与修复组织的量；原位杂交法检测Sry基因的分布定位，以确定MSCs细胞移植成功。结果：1、雄性大鼠MSCs的分离、培养后鉴定：结果CD105和CD90两种表面分子表达呈阳性，CD34和CD45两种表面分子表达呈阴性；2、Ad-KGF-HIF、Ad-KGF、Ad-HIF感染MSCs修饰后，ELISA法检测到细胞中两种外源基因的表达，且两种细胞因子的表达上清可刺激低氧条件下培养的成骨细胞增殖；3、用Allenˊs打击法成功建立了雌性Wistar大鼠脊髓损伤模型；4、细胞移植及红景天应用后，组织学观察结果：HE染色，3~6周a组、b组、c组有较多空腔且无明显变化， d组、e组空腔减少未见新生组织，f组、g组的空腔有较多新生组织，12周a组、b组仍有较多空腔，神经纤维及细胞坏死，在横断处附近形成较多空泡，f组、g组无明显空腔，空泡小而少。神经尼氏体亚甲蓝染色，1-12周，a组、b组神经细胞损伤最严重且修复很少c组d组、e组神经有修复但不明显，f组、g组神经细胞逐渐修复，神经细胞数量增多。术后1周、3周、6周、12周评估功能指标，c组、d组、e组、f组、g组运动功能均优于红景天组与对照组，其中g组较为明显；5、sry基因：RT-PCR法检测sry基因，移细胞移植组sry基因检测量均较高。原位杂交检测sry基因的移植后脊髓组织中的表达量，细胞移植组均表达，g组表达量高于其它组移植细胞的监测。结论：1、密度梯度离心法成功分离MSCs，重组腺病毒感染后可成功表达具有生物活性的HIF和KGF两种外源基因；2、成功建立了脊髓损伤模型；3、初步验证了在低氧环境下大鼠脊髓损伤模型中，HIF和KGF双基因修饰的大鼠MSCs联合红景天的防治方案对于促进脊髓损伤的修复具有较好的效果；4、检测到HIF和KGF基因在局部有表达，在损伤修复组织检测到移植细胞的存在，表明转入的基因及细胞均参与了脊髓损伤的修复；
陈雷[6]2008年在《转基因神经干细胞移植治疗臂丛根性撕脱伤的实验研究》文中研究说明臂丛神经根性撕脱伤是指脊神经根在脊髓起点的断裂,造成神经连续性的中断、脊髓细胞的损伤,从而导致上肢功能部分或完全丧失,临床上难于治愈,是一世界性的难题。神经根回植术治疗臂丛神经根性撕脱伤是一种新的尝试方法,但疗效尚不肯定。本实验以成年Wistar大鼠为对象,采用颈胸椎后路建立颈5、6、7神经根撕脱、颈6神经根脊髓内回植的动物模型;以PGET-1 TA质粒及pLEGFP-C1质粒为载体将体外扩增的NT-3基因导入由胎鼠脑组织分离到的神经干细胞内;于神经根回植后第二天,将该转NT-3基因的神经干细胞移植于臂丛根性撕脱伤模型大鼠相应的脊髓节段内,分别于术后1、2、4、6个月观察实验动物患肢功能、检测肌皮神经诱发电位潜伏期和诱发电位波幅、观察脊髓前角的病理改变并进行细胞计数、移植部位行免疫组化检测移植细胞的迁移、存活与分化。探讨神经根回植术结合转NT-3基因神经干细胞移植对大鼠臂丛神经根性撕脱伤的实验性治疗作用。经过对实验结果的分析,我们得出以下结论:1.大鼠肌皮神经的纤维成分主要来自于C5～C7,未见C8的纤维成分加入;2.经颈胸椎后肩胛下入路可顺利建立大鼠臂丛神经根性撕脱伤神经根回植模型;3.利用无血清培养技术可成功自胎鼠脑组织内分离到具有自我复制能力和多向分化潜能的神经干细胞;4.研究了鹿茸多肽体外诱导神经干细胞分化的作用,证实其在促进神经干细胞向神经元分化方面有着明显的作用,且当其浓度为50μg/L时,神经元阳性细胞数达到75%左右。5.利用逆转录病毒载体的包装细胞PA317,可将pLEGFP-C1-NT-3转入神经干细胞内,NT-3基因能够在神经干细胞内有效表达;6.转NT-3基因神经干细胞移植组肌皮神经诱发电位潜伏期及波幅与对照组相比具有明显的改善;7.转NT-3基因神经干细胞移植对臂丛神经根性撕脱伤神经根回植后脊髓前角运动神经元具有明显的保护作用,移植细胞可较长时间存活(术后6个月),在移植局部表达NT-3蛋白,并迁移、分化为神经元。综上所述,本实验证明了转NT-3基因神经干细胞移植对臂丛神经根性撕脱伤神经根回植后神经电生理功能恢复具有明显作用,移植细胞可较长时间存活(术后6个月),在移植局部表达NT-3蛋白,并可迁移、分化为神经元,对脊髓前角运动神经元具有明显的保护作用。
王宇[7]2005年在《大鼠脊髓损伤与修复相关基因：生物信息学分析及SCIRR10分子特性》文中研究指明近年来因车祸、坠伤、工伤、地震等意外事故导致脊髓损伤的患者逐年上升。严重的脊髓损伤所导致的截瘫不仅给患者带来巨大的痛苦,而且也给家庭和社会造成了严重的负担。脊髓损伤是由于对脊髓的伤害导致的部分或全部的感觉或运动功能丧失。因此脊髓损伤与修复的研究已经成为神经医学和分子生物学的重要研究课题。自从本世纪初发现神经生长抑制基因以来,脊髓损伤与修复中的相关基因及其表达受到国内外学者的高度重视。我们课题组大量前期工作中利用基于PCR 的改良锚定消减杂交技术获取了一批大鼠脊髓原代神经元损伤后差异表达的基因。本研究利用生物信息学软件以及网上数据库对这些基因进行了结构和功能的预测,同时对脊髓损伤与修复相关新基因SCIRR10 进行了基因结构和功能的研究。根据已知的SCIRR10 基因序列,获得了该基因的3’和5’端序列。并且构建了该基因编码的蛋白SCIRP10 原核表达载体,经过诱导条件的优化及亲和纯化,获得了SCIRP10 的重组蛋白。将重组蛋白(SCIRP10)免疫BalBc 小鼠,得到了针对SCIRP10 的多克隆抗体,为单克隆抗体的制备和该基因结构和功能的深入研究奠定了基础。要对脊髓损伤与修复相关基因进行更加深入的结构和功能的研究,单克隆抗体的制备是尤为关键的一步,也是在分子水平上探索脊髓损伤与修复功能的钥匙。在今后的工作中, 我们将继续应用一系列生物技术和方法( RNAi , in-situhybridization,X-ray)对这些脊髓损伤与修复相关基因的功能、结构和CNS 表达图谱进行研究。
李黎明[8]2017年在《复合递送基因修饰干细胞与药物的新型凝胶埋植体系的构建及其对脊髓损伤的治疗研究》文中研究指明干细胞具有多向分化潜能和丰富的细胞功能,对干细胞的基因修饰和基于干细胞的神经组织修复策略长期以来受到广泛关注。其中,对于中枢神经系统疾病,如脊髓损伤(SCI),其发生后呈现复杂的动态病程和病理状况,加之中枢神经组织自愈力低,对损伤后神经功能的恢复不但需要进行神经细胞的补充,还必须克服细胞外基质缺失以及组织微环境炎症反应等多方面的不利因素。如何建立能够在SCI发生后实现有效的神经功能恢复的多功能复合疗法,已经成为科学研究及临床治疗中的热点和亟待解决的难点问题。本文研究针对严重SCI后的神经组织修复这一难题,结合基因传递、干细胞疗法及局部缓控释递药手段,构建新型的多功能复合埋植体系。研究建立脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSC),结合临床治疗脊髓损伤的抗炎药物甲基泼尼松龙(甲泼尼龙,MP),进行脊髓组织的联合埋植治疗。首先,实验通过对MSC基因转染体系的优化和系统研究,制备BDNF基因修饰的MSC,另一方面,构建甲泼尼龙明胶微球(MPGM)缓释制剂以克服MP全身用药的系统毒副作用和脊髓组织利用率低的问题。同时,为实现干细胞与药物制剂的脊髓局部埋植,本研究基于天然细胞外基质成分透明质酸(HA)的交联反应和黏附肽的修饰建立叁维凝胶埋植支架载体,利用该载体包载基因修饰的MSC和MPGM进行SCI后的神经组织修复,通过体内外考察,对这一复合埋植体系的治疗效果进行评价,并对复合埋植体系内各组分在神经恢复中的功能及各组分的联合作用方式进行了探讨。为建立高效低毒的MSC基因转染体系,本文对新型脂质载体Screenfect A(SF)在MSC中的基因转染进行了优化和系统研究。基于SF所优化的MSC基因转染体系可以实现较高的基因转染效率,并同时保持MSC良好的细胞活性。进一步考察发现,SF在质粒的细胞摄取和表达阳性率中的表现与LipofectamineTM 2000(Lipo)相当,但SF的转染显示了更高的细胞平均表达水平和MSC增殖活性,且血清对SF转染MSC的效率及细胞活性的影响皆较小。相比常用脂质载体Lipo,基于SF的基因传递明显减少质粒用量,在对基因转染效率及MSC细胞活性的兼顾中显示明显的优势。进一步对SF所携载质粒的胞内转运行为的考察发现,质粒可于转染0.5h之内开始入胞,顺利进行溶酶体逃逸,进而于4h之内逐渐进入MSC细胞核。为了补充受损组织中缺失的细胞外基质,避免所埋植MSC的流失和细胞死亡,并为受损组织提供支撑和桥接,本研究基于HA构建叁维凝胶支架埋植载体。研究通过对HA分子量和支架制备处方的优化筛选,获得具有叁维多孔网状结构和一定力学强度的凝胶支架。为了提高支架的细胞相容性,促进MSC在支架内的黏附生长,研究引入源于层粘连蛋白链的多肽PPFLMLLKGSTR对凝胶支架进行表面修饰。体外实验结果显示,黏附肽的修饰显着提高了 HA凝胶支架对MSC的细胞相容性,MSC可于肽修饰的支架中黏附生长并长期存活。实验进一步对埋植体系的体内脊髓组织相容性及在体内对MSC的支持作用进行考察,将携载MSC的支架埋植入脊髓组织,肽修饰的支架本身即显示了良好的组织桥接功能,同时可显着提高MSC在组织中的存活。通过对支架-细胞复合埋植及二者单独埋植的研究分析发现,支架载体与干细胞在脊髓修复过程中具有明显的协同作用:支架载体或MSC单独埋植时作用微弱,而二者复合埋植后显着提高了脊髓组织完整性,对大鼠运动功能恢复和组织神经丝重建发挥了显着的促进作用。进一步对组织内继发性损伤初期情况的考察初步揭示了复合埋植体系发挥显着修复作用的可能原因,即干细胞与支架载体的埋植对炎症细胞浸润和胶质疤痕形成具有协同抑制作用。基于对支架载体体内外相容性和与MSC之间协同作用的探讨,本研究进一步利用所构建的支架载体携载BDNF基因修饰的MSC进行SCI后的神经组织修复治疗。体外实验结果显示,支架载体可支持基因修饰的MSC的长期存活及对所修饰基因的表达。体内埋植后,对MSC的BDNF基因修饰及支架的携载,都显着增强了 MSC细胞促进脊髓修复的作用,埋植治疗可明显抑制胶质疤痕形成,同时重建组织中的神经丝,在桥接脊髓神经组织的基础上,明显改善脊髓组织内的细胞形态。对于与支架共同埋植的MSC,BDNF的基因修饰可促进MSC存活以及对神经组织的修复作用,但对于缺少支架携载的MSC,其BDNF基因修饰对细胞功能的增强效果则极其有限,进一步证明支架载体对MSC脊髓埋植的重要作用。为将抗炎药物MP进行局部埋植以克服其全身用药的毒副作用和利用率低的问题,本研究制备甲泼尼龙明胶微球缓释制剂。分别对甲泼尼龙琥珀酸钠明胶微球(MPSS-GM)、琥珀酸甲泼尼龙明胶微球(MPH-GM)和甲泼尼龙明胶微球(MPGM)叁种微球进行药物释放性质的研究,考察支架的肽修饰体系对微球最终包载药量和释药性质的影响,结果发现,经过支架肽修饰体系的处理后,MPSS-GM只保留极少量药物,MPH-GM保留部分药物且释放较快速,而MPGM保留了最多的药物且释药时间最长。实验建立MP的高效液相分析方法学,对MPGM释药性质的进一步研究显示其可实现400小时以上的持续释药。为了实现MPGM在脊髓组织中的埋植,实验进一步利用肽修饰支架包载MPGM。体外考察发现,包载MPGM的肽修饰支架仍具有药物缓释功能和良好的MSC细胞相容性。利用肽修饰的支架携载MPGM和基因修饰MSC进行联合埋植,体内试验结果显示,MP和BDNF-MSC在脊髓组织中的联合埋植可有效调节组织中炎症反应,埋植7天时对促炎因子的下调作用和抑炎因子的上调作用最为明显,14天和28天时,联合埋植仍显示明显的抑炎作用,并显着促进了脊髓组织再生。对包载空白GM的支架携载BDNF-MSC进行埋植的研究,显示其也具有一定的炎症缓解作用,与前期对支架和MSC埋植的结果一致,也揭示了复合埋植体系中微球和MP的作用。本课题为了实现基因修饰的干细胞和甲泼尼龙药物在脊髓组织局部的联合递送,对MSC的非病毒基因转染体系和甲泼尼龙的缓释制剂进行研究,并构建一种对干细胞和神经组织相容性良好的肽修饰的HA埋植支架载体。研究通过对携载埋植后的脊髓修复情况的研究,逐步揭示了干细胞、BNDF基因修饰、甲泼尼龙缓释给药和埋植支架载体在神经组织修复中的功能,本研究为共载干细胞与药物的埋植体系的构建提供了理论与实验依据。
刘勇[9]2016年在《坐骨神经预处理后miR-25-3p促进大鼠脊髓后索损伤修复》文中认为目的本实验旨在研究坐骨神经损伤预处理对脊髓后索损伤修复的影响,并运用microRNA组学及生物信息学的方法研究其可能发挥作用的机制,以期找到发挥这种作用的关键microRNA。方法1.运用HE染色和免疫组织化学染色的方法,观察坐骨神经损伤预处理与不进行坐骨神经预处理大鼠脊髓后索损伤后21天的形态改变,及损伤局部NF200表达的差异。2.利用microarray 3.0芯片对预处理组和损伤组在脊髓后索损伤造模后1d、7d、14d和28d坐骨神经对应的背根神经节中microRNA的表达进行检测,并运用生物信息学的方法分析所得到的数据,筛选出差异表达microRNA,然后运用PCR的方法对其表达改变进行验证。3.运用Targetscan软件预测筛选出的microRNA的靶m RNA,并运用Western Blot和PCR的方法对该m RNA的含量及其相应蛋白的表达进行检测。结果1.预处理组与损伤组相比,脊髓后索损伤造模后21天脊髓后索纤维束排列更加有序,白质纤维分布更为均匀。2.脊髓后索损伤造模后21天预处理组脊髓后索损伤部位NF200染色面积更大,用Image-Pro Plus 6.0软件处理并分析所得图像,测定NF200累积光密度值,发现预处理组其表达量明显比损伤组高,差异有统计学意义。3.分析预处理组与损伤组microRNA表达谱发现预处理组miR-25-3p的表达在脊髓后索损伤后1d、7d和14d明显上调,在28d基本恢复到对照组水平。对miR-25-3p的表达进行聚类分析,发现预处理组在脊髓后索损伤后7d表达数值独立于损伤组和预处理组其他时间点。4.应用PCR方法对预处理组及损伤组miR-25-3p在脊髓后索损伤后1d、7d、14d、28d的表达进行验证,其结果与microarray芯片趋势表现出了良好的一致性。预处理组背根神经节中miR-25-3p表达与对照组相比无明显差异。5.用Western Blot的方法对背根神经节中PTEN的表达进行检测发现,预处理组PTEN蛋白表达在脊髓后索损伤后1d、7d、14d下调,在28d基本恢复到对照组水平,损伤组各时间点与对照组相比均无明显改变。利用PCR对PTEN m RNA进行检测发现预处理组和损伤组各时间点PTEN m RNA与对照组相比均无统计学差异。结论1.坐骨神经损伤预处理可在一定程度上促进脊髓后索损伤的修复。2.预处理组miR-25-3p的表达在脊髓后索损伤后1d、7d和14d明显上调,在28d基本恢复到对照组水平。3.PTEN蛋白表达在预处理组脊髓后索损伤后1d、7d、14d下调。4.miR-25-3p是坐骨神经损伤预处理促进脊髓后索损伤修复的关键microRNA之一,其作用可能与抑制PTEN的表达有关。
参考文献：
[1]. 大鼠脊髓损伤修复相关基因的分离与初步分析[D]. 马振莲. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[2]. 转SHH基因的骨髓间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 贾祎佳. 山西医科大学. 2014
[3]. bcl-2基因修饰雪旺细胞蛛网膜下腔移植修复大鼠脊髓损伤[D]. 赵志军. 山东大学. 2017
[4]. RNA干扰ROCK-Ⅱ基因表达促进脊髓损伤修复的实验研究[D]. 李晓江. 吉林大学. 2010
[5]. 细胞因子修饰的MSCs联合红景天促进脊髓损伤修复的实验研究[D]. 王博. 甘肃中医学院. 2014
[6]. 转基因神经干细胞移植治疗臂丛根性撕脱伤的实验研究[D]. 陈雷. 吉林大学. 2008
[7]. 大鼠脊髓损伤与修复相关基因：生物信息学分析及SCIRR10分子特性[D]. 王宇. 吉林大学. 2005
[8]. 复合递送基因修饰干细胞与药物的新型凝胶埋植体系的构建及其对脊髓损伤的治疗研究[D]. 李黎明. 浙江大学. 2017
[9]. 坐骨神经预处理后miR-25-3p促进大鼠脊髓后索损伤修复[D]. 刘勇. 天津医科大学. 2016
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