郭永清[1]2002年在《大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因在哺乳动物细胞中表达的研究》文中研究说明氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(carbamyl phosphate synthetase Ⅰ，CPSⅠ)是尿素循环中的起始酶，主要存在于肝细胞的线粒体中，它的基因表达特点有明显的肝组织特异性和发育阶段性，与肝细胞的分化有密切的关系。研究表明细胞增殖与分化的调节异常与细胞癌变有着密切的关系，分化异常在癌变过程中起着更为重要的作用。实验证明，在大鼠肝癌的诱发过程中发现，CPSⅠ的活性降低，这可能是由于酶蛋白质含量降低的结果。肝癌细胞中mRNA的检测与染色质结构的分析证实致癌过程中CPSⅠ的mRNA量减少，CPS Ⅰ转录区的染色质结构由高转录活性的松散型转变为低活性的致密型核小体结构。表明癌变过程中CPS Ⅰ基因表达调控的异常可能发生在转录水平。体外转录，寡聚核苷酸竞争和DNA结合蛋白的研究进一步提示，CPS Ⅰ的上游序列中存在着肝细胞特异DNA结合蛋白的调控顺序，其转录有组织特异性和分化特异性。以上我们的研究表明，CPS Ⅰ的表达及调控过程与肝癌变和分化的过程有密切的关系，因此深入研究CPS Ⅰ基因表达与调控，对阐明肝癌变的机制、了解大鼠肝氨甲酸磷酸合成酶！基因在哺乳动物细胞中表达的实验研究 硕士论文肝细胞分化的过程及病理和临床诊断有着重要的意义。 哺乳动物细胞基因表达是近年来发展起来的分子生物学手段和细胞生物学手段相结合的一种新技术，无论在生产有价值的功能蛋白质和基因治疗的应用中，还是在阐明基因结构、功能及其相互关系等的基础理论研究中都有着独特应用价值和前景。阐明CPS基因的结构和功能，深入了解肝细胞分化和癌变的过程，大量地在体外生产 CPS天然蛋白质，为基础研究和临床病理诊断提供必要材料，用大鼠 CPS cDNA基因作为基因源，在CHO细胞、NIH／3 T3细胞，7402肝癌细胞哺乳动物细胞中以载体表达的形式构建了3种“PSV厂cDNA”表达体系，初步观察了CPS在肝细胞外哺乳动物细胞和肝癌中的表达情况，分析了CPS的调节机制。目前国内外用载体表达的十余种基因，均为分子量较小的蛋白基因，本文还探索了用PSVZ载体表达大分子量的CPSI基因的可能性，结果5．6Kb长的CPSI全序列基因成功地在不同细胞系中进行了表达。以上工作目前均未见报道。下面摘要介绍本文主要方法和结果。 首先对CPSI GDNA基因片段进行修饰，并将修饰片段进行亚克隆，以适应该基因与阿 载体的重组和基因表达对外源基因结构上的要求。采用Bal31和S；脱氧核糖核酸酶删切法， 3大鼠肝氨甲酸磷酸合成酶1基因在哺乳动物细胞中表达的实验研究 硕士论文从5’一末端对CPSI CDNA重组基因进行定向删切，将获得的修饰片段与PBS出质粒重组，用限制性酶谱法和双链DNA测序法分析，结果筛选出PB Sm－CPS，。。（PS。。，两个亚克隆，分别含有0．587Kb和 0．712用长度的修饰后 CPSI CDNA片段，该两种C＊＊A片段均保留了原＊＊a基因的AT G翻译起起始信号；0＊］2＊be ＊＊A保留了完整的前导序 列门＊。血rs＊＊enCe） 回00．587Kb CPSI GDNA只保留了 8个单核着酸的前导顺序结构，它们的3’末端结构均无变化，两片段5’一末端前引入了Hindlll的酶切位点。 同时，我们对＊S几载体也进行了改造。通过平末端修饰法，消除了载体上对功能无影响的一个ECORI位点。然后又在载体的克隆位点处，引入了两BalnHI上coRI适应子。改造后形成的两新载体，PSV厂DFHR‘和 PSV厂DFHR‘’用质粒具有广泛的重组适应性。经哺乳动物细胞表达鉴定，以上改造对载体功能无多l丁＊ 介对基因和载体修饰和改建的基础上，用Hindlll／BamHI双酶切从 PBS“’－CPS。。；和 PBSX‘－CPS，。，亚克隆中回收了 0．7Kb和 0．SKb两个CPSICDNA片段，通过与PSV。载体定向重组，构建 了 PSV。－CPS。。。和 PSV。－CPS。。，两个哺乳动物细胞表达质 4大鼠肝氨甲酸磷酸合成酶！基因在哺乳动物细胞中表达的实验研究 硕士论文粒，经限制性酶谱分析，证明插入片段的方向和结构均符合设计要求，重组质粒的各成分是完整的。用DNA一磷酸钙共沉淀介导的基因转染法，将 PSVZ－CPS。。s禾 PSV。－CPS。。，分别采PSV。呗eo共转染NIH／3T3细胞，经细胞间接免疫荧光和免疫酶标法鉴定，证明PSVZ－CPSS。SAIH／3T3、PSVZ－CPS507－N’IH／3T3两转化细胞均有特异 CPSI基因的表达，通过 G418抗药性筛选，己经建立了该两体系的稳定表达株。 PSV。－CPSs。。－NH／3T3禾 PSV。－CPS。。，－N’IH／3T3表达成功证明经改造后的两种形式的＊＊a片段的可表达性。据此，我们选择了 0尸 12Kb的 CPSI片段作为全序列 CPSIcDNA一个片段，另一个片段用 BalnHI和 EcoRI限制性内切酶酶解PHN3491，通过回收获得。该两片段在BamHI重组位点处对接可以组成含有完整CPSI前导顺序和结构基因的CPSI cDNA，但不含原基因的加尾信号，该信号由载体中来源于 SV40 PO
牛勃[2]1990年在《大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因在哺乳动物细胞中表达的研究》文中指出氨甲酰磷酸合成酶I(CPS I)是尿素循环中的起始酶，主要存在于肝细胞的线粒体中，它的基因表达特点是明显的肝组织特异性和发育阶段性，与肝细胞的分化有密切的关系。研究表明细胞增殖与分化的调节异常与细胞癌变有着密切的关系，分化异常在癌变过程中起着更为重要的作用。实验证明，在大鼠肝癌的诱发过程中发现，CPS I的活性降低，这可能是由于酶蛋白质含量降低的结果。肝癌细胞中mRNA的检测与染色质结构的分析证实致癌过程中CPS I的mRNA量减少，CPS I转录区的染色质结构由高转录活性的松散型转变为低活性的致密型核小体结构。表明癌变过程中CPS I基因表达调控的异常可能发生在转录水平。体外转录，寡聚核苷酸竞争和DNA结合蛋白的研究进一步提示，CPS I的上游序列中存在着肝细胞特异DNA结合蛋白的调控顺序，其转录有组织特异性和分化特异性。以上我们的研究表明，CPS I的表达及调控过程与肝癌变和分化的过程有着密切的关系，因此深入地研究CPS I基因表达与调控，无疑对阐明肝癌变的机制、了解肝细胞分化的过程及病理和临床诊断有着重要的意义。 哺乳动物细胞基因表达是近年来发展起来的分子生物学手段和细胞生物学手段相结合的一种新技术，无论在生产有价值的功能蛋白质和基因治疗的应用中，还是在阐明基因结构、功能及其相互关系等的基础理论研究中都有着独特应用价值和前景。为了有控制地在细胞内再现CPS I的表达过程、调控机制，阐明CPS I基因的结构和功能，深入了解肝细胞分化和癌变的过程，大量地在
参考文献：
[1]. 大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因在哺乳动物细胞中表达的研究[D]. 郭永清. 山西医科大学. 2002
[2]. 大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因在哺乳动物细胞中表达的研究[D]. 牛勃. 中国协和医科大学. 1990