烟台毓璜顶医院 264000
【摘 要】目的 探讨慢病毒介导转化生长因子 β1（tansforming growth factor bata 1，TGF － β1）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）诱导成软骨细胞分化的作用。［方法］ 密度梯度离心法分离培养 BMSCs，探索病毒感染最佳条件，取第 3 代细胞，分为实验组和对照组，通过慢病毒载体将外源性 TGF － β1基因转染入细胞，观察绿色荧光表达情况，Ｒeal － time PCＲ 法和 western blot 法检测 TGF － β1 基因的 mＲNA 和蛋白表达情况，7、14 d 时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和 Ｒeal － time PCＲ 检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。［结果］ TGF － β1 基因转染 BMSCs 后能够稳定表达。转染 7、14 d 时，实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。转染 7、14 d 时，实验组 II 型胶原 mＲNA 均显著高于对照组（P ＜ 0. 01）。转染 7 d 时，实验组聚集蛋白聚糖 mＲNA 变化不明显，而 14 d 时显著高于对照组（P ＜ 0. 01）。［结论］ 慢病毒介导的 TGF － β1 基因可成功转染大鼠 BMSCs，并诱导其向软骨细胞分化。在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的 mＲNA 表达具有时间差异性。
【关键词】骨髓间充质干细胞；成软骨分化；转化生长因子 β1；慢病毒载体；大鼠
软骨组织缺乏血管和神经，软骨细胞的营养供给主要是通过关节滑液和细胞周围的基质，其自身修复能力相当有限。目前关节软骨退化性疾病在临床上有各种不同的治疗方法，但均不能达到十分理想的效果，近年来各个国家学者的研究证明，软骨组织工程与基因工程相结合的方式可能是软骨退行性改变相关疾病的有效治疗方法。
BMSCs结构相对简单，为具有特定生物学功能的多能干细胞，其具有来源广泛、取材简便、相对安全、体外增殖能力强、提取及体外培养方法已相对比较成熟等特点，并且其在一定的条件下可以分化为软骨、骨、脂肪、肌腱等组织的细胞。BMSCs如今已作为软骨组织工程研究中较为理想的种子细胞，且通过成软骨诱导将BMSCs诱导培养为软骨细胞的技术已比较成熟，是目前组织工程软骨修复研究的热点。BMSCs向软骨细胞分化过程中，受多种因素的影响和调控，诸如细胞因子、化学因素等。其中各种细胞因子如骨形态发生蛋白、转化生长因子（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）等在已知的研究中已被证实能够通过不同的通路影响软骨细胞分化。化学因素中，胰岛素、维生素等已被用于成软骨诱导培养液的成分中。通过基因转染技术与细胞生物技术相结合的方法，通过转基因技术，将 TGF － β1 基因慢病毒载体转染大鼠的 BMSCs，以实现外源目的基因在细胞内的持续高效表达，并观察目的基因在 BMSCs 中的表达以及诱导成软骨分化的情况，为进一步深入研究 TGF － β1 调控软骨分化的作用机制及体外构建组织工程软骨奠定实验基础。寻找促进软骨分化的新的因子，旨在为软骨细胞工程提供新的思路及为临床上治疗软骨退行性相关疾病提供新途径。
1 材料与方法
1.1实验动物健康 SPF 级 SD 大鼠 10 只，雌雄不限，4 周龄，体质量（80 ± 5）g，分离培养 BMSCs。
1.2 大鼠 BMSCs 的分离、培养 SD 大鼠脱颈处死，无菌环境下取股骨，PBS 冲洗，剔尽软组织，剪断骨骺端，吸取含 10% FBS 的DMEM 培养液反复冲洗骨髓腔，置于无菌培养皿中。75 μm 细胞过滤器过滤，1 000 r / min 离心 8 min，弃上清。PBS 重悬制成细胞悬液，小心加入至 2 倍体积1. 073 g / ml 的 percoll 分离液上层，2 000 r / min 离心 15min。收集中间乳白色的细胞层，再用 PBS 洗涤 2 次，加入适量的含双抗的 10% 胎牛血清 DMEM 培养液重悬细胞，1 000 r /min 离心 10 min，弃上清，加入适量DMEM 完全培养基（含 10% 胎牛血清、青霉素 100 U /ml、链霉素 100 U / ml），反复吹打，稀释成细胞悬液，以 1. 0 × 104个/cm2接种于 25 cm2培养瓶中，37℃、5% CO2培养箱培养。48 h 后换液，保留贴壁细胞，以后每 3 d 更换一次培养液，细胞融合达 90% 时以0. 25% 胰酶消化并传代培养。
1.3 TGF － β1 基因慢病毒载体转染 BMSCs 诱导软骨分化取生长良好的第 3 代 BMSCs，以 4. 0 × 105/5 ml培养液种于 25 cm2培养瓶中。BMSCs 分为 2 个组：对照组（转染对照慢病毒的 BMSCs）和实验组（转染TGF － β1 慢病毒的 BMSCs）。
1.4甲苯胺蓝染色分别在诱导分化 7、14 d，细胞爬片用 PBS 洗 2次，4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 洗 3 遍，加 1% 甲苯胺蓝浸染 2 h，蒸馏水洗 5 min，PBS 洗 2 遍，普通光镜下观察染色结果。
1.5统计学处理 采用 SPSS 17. 0 统计软件进行统计分析，计量资料采用 x珋± s 表示，以独立样本 t 检验进行统计学处理，P ＜ 0. 05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 BMSCs 形态学观察48 h 后，可见少量的成纤维样 BMSCs 贴壁生长，呈三角形或纺锤形，。培养 6 d 左右，细胞体积增大，呈现集落生长，大部分呈长梭形，少量呈三角形。9 ～ 12 d 细胞可融合至90% 以上，细胞形态均一，呈漩涡样排列。传代后细胞生长旺盛，3 ～ 4 d 可融合至 90% 以上，呈长梭形、宽大扁平形或不规则形。
2.2 转染后 BMSCs 中 TGF － β1 mＲNA 及蛋白的表达 Ｒeal － time PCＲ 结果显示，转染后 7、14 d，实验组细胞 TGF － β1 mＲNA 高表达，与对照组比较，差异有统计学意义（P ＜ 0. 01）（图 1）。Western blot 结果显示，转染后 7 d，实验组细胞 TGF － β1 蛋白呈强阳性表达，对照组未检测到 TGF － β1 蛋白的表达（图1）。以上结果说明慢病毒载体介导的 TGF － β1 基因能成功转入 BMSC 内并稳定表达。
2. 3甲苯胺蓝染色转染 7 d 时，实验组细胞甲苯胺蓝染色呈阳性，可见胞质呈蓝紫色异染； 14 d 时，实验组染色进一步加深，呈明显的紫蓝色。7、14 d 时，对照组染色均为阴性（图 2）。
3讨论
目前较常用的基因治疗载体有逆转录病毒、腺病毒及慢病毒载体。逆转录病毒载体虽可使目的基因整合至靶细胞基因组并实现稳定表达，但其缺点在于无法感染不分裂细胞。有研究发现腺病毒载体可通过感染小鼠骨髓来源的DCs，使之表达病毒所携带的目的基因，具有表达时间快、效率高的优点，由于病毒基因组游离于宿主基因组外，仅能瞬时表达外源基因，无法实现稳定表达；另外，腺病毒载体有较高的免疫性，会诱导DCs成熟。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，其病毒基因组是RNA病毒，可整合于宿主基因中而使宿主长期、稳定表达外源基因，并且免疫反应小，可同时感染分裂期细胞和非分裂期细胞，主要缺点是感染所需时间较长。慢病毒载体是目前研究DCs基因治疗方面的最佳载体，日益受到重视。本实验将TGF-β1过表达的慢病毒载体稳定感染iDCs，48 h后置于倒置荧光显微镜下观察发现GFP高表达，感染对照组同样高表达GFP，说明该病毒基因组已成功转导进入DCs宿主内；另外，通过ELISA测定上清液TGF-β1表达水平的结果亦证明了以上的结论。
综上所述，本研究通过诱导小鼠骨髓单核细胞，扩增出大量高纯度的iDCs细胞，并将携带有TGF-β1目的基因的慢病毒载体稳定感染进iDCs中，使其获得高分泌TGF-β1蛋白的特征，为进一步研究TGF-β1对诱导体内免疫耐受的影响提供了实验依据。证实 TGF － β1 基因慢病毒载体可以成功转染大鼠 BMSCs，并能诱导其成软骨细胞分化，为进一步深入研究 TGF － β1 调控软骨分化的作用机制及体外构建组织工程软骨奠定了基础。
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论文作者:王光达,隋来健,盖鹏宙（通讯作者）,李桂石
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2017年8月第16期
论文发表时间:2018/2/28
标签：软骨论文; 细胞论文; 转染论文; 病毒论文; 基因论文; 载体论文; 实验组论文; 《中国医学人文》(学术版)2017年8月第16期论文;