南华大学附一医院血液科，湖南 衡阳 421001
作者简介：罗泽宇：（男，1981年08月-----，）湖南岳阳人，硕士研究生毕业，现任职于南华大学附属第一医院血液内科）
摘要：目的 探讨冬凌草甲素( Oridonin Ori)对多发性骨髓瘤（MM）细胞株KM3的抗骨髓瘤效应及可能作用机制。方法 经不同浓度冬凌草甲素处理KM3细胞后，MMT法检测细胞增殖抑制率；AnnexinV-FITC/ PI染色法检测凋亡细胞的百分率；实时荧光定量PCR检测细胞中BAFF和 APRIL mRNA表达水平；ELISA检测培养液上清中BAFF和APRIL蛋白的浓度。结果 （1）冬凌草甲素以浓度依赖性方式有效地抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，冬凌草甲素抑制KM3细胞活力的IC50为3.8μmol/L；(2）冬凌草甲素以浓度依赖性方式诱导KM3细胞凋亡；（3）冬凌草甲素能抑制KM3细胞BAFF和APRIL的表达。结论 冬凌草甲素能有效的抑制多发性骨髓瘤细胞株KM3的增殖，诱导其凋亡；BAFF和APRIL表达的下降可能是冬凌草甲素抗多发性骨髓瘤的重要作用机制。
关键词 冬凌草甲素 多发性骨髓瘤 KM3细胞 B细胞活化因子 增殖诱导配体
【中图分类号】R595.4【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0443-02
冬凌草甲素是从中药唇型科香茶菜属植物冬凌草中提取出来的有效成分, 其化学结构是一种二萜类化合物; 具有广谱的抗肿瘤作用, 目前已被广泛应用于各种实体瘤的治疗。冬凌草甲素对多发性骨髓瘤细胞的作用目前尚少见报道。我们以人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞为模型, 通过细胞培养的方法, 观察了冬凌草甲素对其生长的抑制作用及诱导凋亡作用, 并对其BAFF/APRIL 基因的表达水平进行了检测, 以期探讨冬凌草甲素对KM3细胞的作用机制, 为冬凌草甲素应用于临床治疗多发性骨髓瘤的可能提供可靠的实验依据。
材料与方法
1.1材料
KM3细胞株由上海长征医院血液科候建教授惠赠；冬凌草甲素由中国科学院广州生物医药与健康研究院周光飙博士惠赠。RPMI－1640粉剂为Gibco公司产品，超级无支原体新生牛血清为Sigma公司产品，MTT购自Sigma公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自BECTON DICKINSON公司；BAFF和APRIL游离蛋白检测ELISA试剂盒购自美国ADL公司；Trizol购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生物工程公司；氯仿，异丙醇，无水乙醇购自湖南师大化学试剂厂；焦碳酸二乙酯（DEPC）购自上海生物工程公司；荧光定量引物根据PCR引物设计原则，参照文献设计BAFF[1]、APRIL[2]和GAPDH引物；其中BAFF和APRIL引物由上海生物工程公司合成，GAPDH引物由广州英韦创津公司合成，引物序列如下：
BAFF上游引物为5’-TGAAACACCAACTATACAAAAAG-3’，BAFF下游引物为5’-TCAATTCATCCCCAAAGACAT-3’，预期产物大小为215bp。
APRIL上游引物为5’-TCTGTCCTGCACCTGGTTCC-3’，APRIL下游引物为5’-CAGCAGATAAACTCCAGCATCCT-3’，预期产物大小为174bp。
GAPDH上游引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCC-3’，GAPDH下游引物为5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’，预期产物大小为300bp。
KM3细胞培养
无菌操作条件下，将KM3细胞接种于含体积分数为10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于5%二氧化碳、饱和湿度、37℃培养箱中进行传代培养，每2-3天换液一次。
MTT法
取对数生长期KM3细胞，用10%灭活的新生牛血清RPMI–1640培养基制成的单细胞悬液，接种于无菌96孔板中，每孔200μl，含5×104个细胞。各实验组加入等体积不同浓度的冬凌草甲素，混匀，使冬凌草甲素终浓度分别为0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L，对照组加等体积DMSO，每组设3个平行孔。将培养板置于37℃，饱和湿度，5%CO2孵箱中常规培养，KM3细胞在培养44小时后，每孔加入5μmol/L的MTT 20μl，继续培养4小时。然后2000rpm离心10分钟，小心吸尽上清，每孔加150μl DMSO，振荡至MTT完全溶解，用酶标仪在490nm波长检测A490值（吸光值）。按下式计算细胞生长抑制率并以细胞生长抑制率对药物浓度绘制曲线。细胞生长抑制率（%）=[1－（治疗组A490均值/对照组A490均值）]×100%，取3孔平均数。重复实验3次，取平均值。
Annexin V-FITC/PI双标法检测早期细胞凋亡
取对数生长期的K562细胞，用10%灭活的新生牛血清RPMI–1640培养基制成3.0×105/ml的单细胞悬液，接种于无菌6孔培养板中。每孔2ml，各实验组加入等体积不同浓度的冬凌草甲素，混匀，使IC162终浓度分别为0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L，对照组加等体积DMSO。48小时后，1000rpm，离心5分钟，弃上清后收集细胞，行Annexin V/PI流式检测（按试剂盒说明进行操作）
1.5实时荧光定量PCR
T rizol 法提取细胞总RNA , 核酸蛋白紫外分析仪检测RNA 的质量和浓度。采用逆转录试剂盒将mRNA 逆转录为cDNA。使用SYBRGreen Ⅰ 荧光染料进行定量PCR 反应。反应体系:模板2 μl , 上下游引物各1 μl , 与10 μl 混合染料混合, 超纯水补足体积至20 μl , 混匀后放入PCR 热循环仪中进行反应,条件如下:95 ℃预变性2 min , 然后95 ℃10 s , 56/60 ℃20 s(BAFF 和GAPDH 退火温度为56 ℃, APRIL为60 ℃), 72 ℃ 30 s 共40 个循环。根据文献报道的标准曲线法[3]测定目的基因的相对表达量,该方法通过将一系列已知相对浓度的标准品与待测样品同时进行荧光定量PCR 检测, 然后以标准品的C t 值对初始浓度(相对值)做图(拟合曲线),即可得到标准曲线, 待测样品所得的C t 值经标准曲线方程便可知道其所含基因的初始量(相对于标准品的浓度)。我们根据所扩增的目的基因和管家基因GAPDH 的Ct 值, 即可计算出所扩增的目的基因相对于管家基因GA PDH 的变化倍数, 所扩增的目的基因相对于管家基因GAPDH 的变化倍数之比即是相对定量的结果, 即Folds =(C 目的基因/C 管家基因)(C :根据标准曲线将Ct 值转换为模板原始浓度), 由此可以准确地得出所扩增的目的基因在MM 患者及对照组患者中BAFF/A PRI L的表达强弱。
1.6 ELISA
根据ELISA 试剂盒说明书分别检测标本血清中APRIL 、BAFF 蛋白含量, 同时用标准品绘制标准曲线。
1.7统计学分析
IC50值用细胞生长抑制率对药物浓度对数作图，并按作图法求出；不同浓度冬凌草甲素干预后细胞的生长抑制率和凋亡率及BAFF和APRIL表达水平改变的各种统计图表采用Microcoft Excel统计软件获得。
结果
2.1冬凌草甲素抑制KM3细胞增殖——MTT结果
对于KM3细胞，MTT试验结果显示，在冬凌草甲素浓度为0μg/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L 时，干预48h相对应的平均细胞生长抑制率依次为0%、43.9%、62.1%、89.0%、93.8 %、94.3%、95.2%。随着冬凌草甲素浓度增高，细胞生长抑制率逐渐升高，呈浓度依赖性变化。药物抑制KM3细胞的IC50为3.8μmol/L。
2.2 Annexin V-FITC/PI双标记法流式检测细胞早期凋亡结果
经不同浓度的冬凌草甲素（0μg/mL，2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL）干预48h后，KM3细胞的凋亡百分率随冬凌草甲素的浓度升高而逐渐增加（见图1）。随药物浓度的增加，细胞的凋亡率逐步增加；说明冬凌草甲素诱导KM3细胞凋亡存在药物浓度依赖性。
其中右下格（LR）代表膜完整的早期凋亡细胞数。右上格（UR）代表晚期凋亡细胞和坏死细胞数。左下格（LL）代表正常活细胞数。左上格（UL）代表死亡细胞数。随着冬凌草甲素药物浓度的增加，早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死的细胞显著增多。
2.3冬凌草甲素对KM3细胞表达BAFF/APRIL mRNA的影响
经不同浓度的冬凌草甲素（0μg/mL，2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL）干预48h后，经荧光定量PCR检测不同浓度作用下KM3细胞BAFF和APRIL的mRNA表达水平的变化。BAFF和APRIL mRNA表达量均随着冬凌草甲素的浓度升高而逐渐降低（见图2）。随药物浓度的增加，细胞BAFF/APRIL的mRNA表达逐步降低，说明BAFF/APRIL与KM3细胞的存活有关。
讨论：
冬凌草甲素是从中药冬凌草中提取出来的有效广谱抗癌成分，其主要化学成分为一种四环二萜类化合物，其化学结构为C20H36O7。它能够抑制多种实体肿瘤细胞的增殖，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、恶性胶质瘤等[4-5]。其对实体瘤的治疗，目前已广泛运用于临床。冬凌草甲素对多种血液系统的肿瘤细胞也具有明显的生长抑制作用，并能诱导细胞发生凋亡；且能增加耐药细胞株对化疗药物的敏感性。郭勇等[6]到研究表明冬凌草甲素可诱导急性单核细胞白血病THP -1细胞凋亡、抑制细胞增生；刘琦等 [7]研究表明， Ori通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，活化Caspase-3抑制急性淋巴细胞白血病Molt-4 细胞的生长及诱导凋亡；郭娟娟等[8]研究表明，冬凌草甲素能逆转多药而药细胞系K562/A02的耐药性。段浩清[9]等研究提示：冬凌草甲素可以抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖并诱导其凋亡， 发挥其抗肿瘤作用.
我们利用多凌草甲素干预多发性骨髓瘤细胞株KM3，采用MTT法检测其对KM3细胞增殖的影响。我们分别采用0μmol/l、2μmol/l、4μmol/l、8μmol/l、16μmol/l、32μmol/l、64μmol/l这几个不同的冬凌草甲素浓度干预KM3细胞48小时，重复三次，测得的平均细胞抑制率分别为:0%、43.9%、62.1%、89.0%、93.8%、94.3%、95.2%.并计算得IC50为3.8μmol/l。从这里我们可以发现，随着药物浓度的增加，KM3细胞的生长抑制率不断增加，冬凌草在低浓度时就对KM3细胞有着较高的抑制率，提示冬凌草甲素对KM3有着比较强的抗多发性骨髓瘤活性。
本实验用不同浓度的冬凌草甲素干预KM3细胞，经Annexin V-FITC和PI染色，用流式细胞仪检测其凋亡率。结果发现经不同浓度的冬凌草甲素（0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）干预48hr后，Annexin V-FITC阳性而PI阴性的K562细胞百分率分别为4.20％、9.93％、16.38％、29.37％,随着药物浓度的升高，早期细胞凋亡率相应增加。
冬凌草甲素诱导KM3细胞的凋亡作用机制尚不明确。Takayuki等[10]研究表明，冬凌草甲素可通过阻断NF-кB信号传导途径抑制淋巴细胞类恶性肿瘤的增殖，促进细胞的凋亡；刘伟峰等[5]研究表明，冬凌草甲素可通过上调miRNA-15a，使VEGF 表达减少，而诱导肝癌细胞HepG2 凋亡；郭勇等[7]研究证实冬凌草甲素通过抑制Akt /mTOＲ、Ｒaf /MEK/EＲK 信号转导通路的活化，以及调节凋亡调节蛋白Bax 和Bcl-2 的表达而发挥抗白血病效应；郭沛等[11]研究表明阿糖胞苷与冬凌草甲素能够协同抑制U937 细胞增殖、诱导细胞凋亡，其机制可能是主要通过线粒体途径介导。
BAFF和APRIL是近来发现的肿瘤坏死因超家族成员，它们具有高度的同源性，能够促进B细胞的增殖和存活，同时对浆细胞也有类似作用，在多种肿瘤性疾病中表达增加，促进肿瘤性疾病的进展。本人在前期工作[12]中发现，MM患者骨髓单个核细胞存在BAFF和APRIL mRNA异常表达，血浆中游离BAFF和APRIL蛋白的表达也升高，且BAFF和APRIL的表达水平与MM患者的肿瘤负荷呈正相关，可作为评价多发性骨髓瘤的预后新指标。本实验通过不同浓度冬凌草甲素干预KM3细胞后，通过荧光定量PCR检测BAFF/APRIL的mRNA表达水平的变化，结果发现随着冬凌草甲素浓度的增加BAFF/APRIL的mRNA含量显著下降；同时我们通过ELISA检测干预后的细胞培养液上清中游离BAFF及APRIL蛋白的含量，结果是随着药物浓度的增加，游离BAFF/APRIL蛋白含量逐渐减少。有研究表明[13]miＲ-202 通过对NF-κB 的活化基因BAFF基因的靶向抑制作用，使信号通路失活，诱导骨髓瘤细胞凋亡；BAFF/APRIL经EPK1/2途径下调BIM抑制BCR诱导的细胞死亡，促进破骨细胞分化，加速多发性骨髓瘤的进展[14]；BAFF/APRIL系统还可以通过NF-KB，PI3/AKT途径促进骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞的粘附作用，增加BAFF/APRIL的旁分泌[15]。因此冬凌草甲素诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡可能与BAFF/APRIL及其受体介导的多条信号传导途径有关。
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论文作者:罗泽宇1 李君君1曹翊雄1 文锋1 黄丽芳1
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/27
标签：冬凌草论文; 细胞论文; 浓度论文; 抑制论文; 凋亡论文; 引物论文; 诱导论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;