(1.福建中医药大学附属第二人民医院病理科，福建 福州 35O003；
2. 福建中医药大学中西医结合学院 ，福建 福州350l08；
3.江苏省泰州市人民医院内科，江苏 泰州 225300)
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81072736）;福建省自然科学基金资助项目（C510025）
摘要：目的 研究石斛合剂对高糖高脂+STZ造模糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡及相关基因P53mRNA表达的影响。方法 大鼠高脂高糖饲养1月后腹腔注射STZ制备糖尿病模型，经石斛合剂治疗2周后检测胰岛细胞凋亡及P53mRNA表达。结果 石斛合剂可显著地降低糖尿病大鼠空腹血糖(P<0.05或P<0.01)；显著减少糖尿病模型大鼠胰岛细胞凋亡(P<0.05)，减少P53mRNA表达(P<0.05)。结论 石斛合剂降低血糖,减少大鼠胰岛细胞凋亡，其可能与其降低糖尿病模型大鼠胰腺组织P53表达有关。
关键词：石斛合剂； 细胞凋亡； 糖尿病； 大鼠
糖尿病患病率逐年上升，流行病学调查表明，全国≥2O岁人群DM患病率为9.7％，且糖耐量异常人群远远超过确诊的DM患者［1］。开发治疗糖尿病中药，临床应用前景可观。本课题组既往研究证实石斛合剂能显著降低实验动物高血糖,调节胰岛素分泌、升高胰岛素/C肽比值,降低血酯、FFA水平,且应用于临床后证实该方降糖疗效确切。本研究通过建立高糖高脂+STZ造模糖尿病大鼠模型，观察石斛合剂对胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因P53表达的影响，探讨其治疗糖尿病的机制。
1 材料与方法
1．1 实验动物及药物、试剂 清洁级健康Wistar大鼠50只（上海斯莱克实验动物有限公司），3月龄，雌雄各半，体重140～160g。石斛合剂(福建中医研究院药厂制备，批号：010615，生药含量：2.0 g·mL-1)。STZ(Sigma公司美国)；血糖试剂盒(南京建成)；Oligd(T) (上海博亚)；M-MuLV反转录酶(Fermentas公司美国)；TRIZOL、DEPC、PCR引物、TaqDNA 聚合酶(上海生工)。
1．2 分组及给药方法 Wistar大鼠50只，适应性喂养1周，随机分为正常对照组10只、糖尿病模型组（模型对照组10只、石斛合剂低、中、高剂量组各10只）。大鼠高脂高糖饲养1月后腹腔注射STZ(30mg)制备糖尿病模型。
正常对照组：给予NS灌胃(0.1 mL·kg-1 )2周；模型对照组：给予NS灌胃(0.1 mL·kg-1 )2周；石斛合剂低、中、高剂量组：石斛合剂7.5、15、30 g·kg-1灌胃2周。实验过程模型组死亡２只，各剂量组各死亡一只。实验结束后用乙醚麻醉，腹主动脉取血，并取胰腺组织备测。
1.4 观察指标及检测方法
1.4.1 一般情况观察及生化指标检测观测大鼠进食量、饮水量、精神状态、毛色、活动及排尿量、每周体重改变。空腹血糖(FBC)采用葡萄糖氧化酶法测定。
1.4.2 TUNEL法检测细胞凋亡 胰腺组织石蜡包埋3μm连续切片。常规脱腊、水化，蛋白酶K室温孵育15min。3%H2O2孵育10min,高压修复2min,血清封闭20min,后加50μL的TUNEL反应混合溶液,湿盒中37℃孵育60min，PBS冲洗，滴加转化剂POD，37℃孵育30min，每张切片加100μLDAB液,显微镜下控制染色时间。阴性对照用PBS代替TUNEL反应液。结果判定:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性。切片于20倍物镜下观察,计算每个胰岛内凋亡细胞数。
1.5 统计学方法 数据资料采用SPSS for Windows 19统计软件包进行统计，结果用表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 石斛合剂对糖尿病模型大鼠空腹血糖的影响与 模型对照组血糖29.35±3.24 mmol·L-1比较，石斛合剂治疗各剂量组血糖（23.97±1.24、20.93±4.38、23.16±4.06 mmol·L-1）均有显著性下降(P<0.05或P<0.01)，但未降至正常（4.99±0.92 mmol·L-1P<0.01），治疗各剂量组之间差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 石斛合剂对大鼠胰腺细胞凋亡的影响与正常对照组（0.90±0.43）比较，糖尿病模型大鼠胰岛凋亡细胞数量（3.37±1.51）增加（P﹤0.01），石斛合剂治疗各剂量组（1.88±1.03、1.33±1.00、1.67±0.94）与模型组比较，凋亡细胞数量显著减少（P<0.05）。治疗各剂量组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.3 石斛合剂对各组胰腺P53mRNA表达的影响与正常对照组比较，模型组P53mRNA表达升高（P<0.05）。石斛合剂治疗后各剂量组P53 mRNA表达减少（P>0.05）。与正常对照组表达无关异（P>0.05），中高剂量治疗组与模型组比较，P53mRNA表达显著降低（P<0.05）。结果见表1及图1。
1：正常对照组；2：模型对照组；3：石斛合剂低剂量组；4：石斛合剂中剂量组；5：石斛合剂高剂量组。6×loading buffer 2μl，P53和β-actinPCR产物各5μl；100V，30min，曝光时间4s。
3 讨论
目前，国内外学者认为糖尿病的发病机制与胰岛β细胞凋亡密切相关。不论是1型或2型糖尿病，胰岛β细胞凋亡增加[2-4]，胰岛素的分泌减少。机体细胞凋亡有内源性和外源性两种途径[5]，机体通过复杂的信号调节网络调节凋亡，最终维持维持机体的正常生理状态。其中P53基因为重要的基因。
P53是抑癌基因，位于17号染色体短臂1区3带。P53发现于1979年，其蛋白由393个氨基酸组成。近三十年对其生物学作用进行了深入研究，发现其可通过激活下游与细胞生长抑制、凋亡等相关基因发挥作用。
本实验中观察到与正常对照组相比，模型组大鼠血糖显著升高，胰岛细胞凋亡数量增加。石斛合剂治疗后模型大鼠血糖降低，胰岛凋亡细胞显著减少。与前期体外实验结果观察结果一致。凋亡相关调控基因的表达，模型组大鼠P53mRNA表达显著增加；而经过石斛合剂治疗后P53mRNA表达减少。中、高剂量治疗组与模型组相比，P53mRNA表达具显著降低。结合前期实验中，我们发现，糖尿病模型大鼠胰腺iNOS合成增加；石斛合剂治疗后BaxmRNA表达降低、Bcl-2mRNA表达增加［6］。推测石斛合剂可能通过抑制iNOS合成，减少NO合成，通过MAPK途径减少P53表达，从而协调促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2的表达,调节胰岛细胞凋亡，进而达到防治糖尿病和降低血糖的作用。
参考文献
[1] Yang S H, Dou K F, Song W J.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med,2010;362(25):2425-2426.
[2] Anuradha R1, Saraswati M, Kumar KG, Rani SH.Apoptosis of beta cells in diabetes mellitus.DNA Cell Biol. 2014;33(11):743-8.
[3] Cnop M1, Welsh N, Jonas JC, etal.Mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 and type 2 diabetes: many differences, few similarities.Diabetes. 2005;54 2:S97-107.
[4] Cnop M1, Welsh N, Jonas JC, etal.Mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 and type 2 diabetes: many differences, few similarities.Diabetes. 2005;54 Suppl 2:97-107.
[5] Goldar S, Khaniani MS, Derakhshan SM, Baradaran B.Molecular mechanisms of apoptosis and roles in cancer development and treatment.Asian Pac J Cancer Prev. 2015;16(6):2129-44.
[6] 高尤亮,施红,杨秀珍,等.石斛合剂对糖尿病模型大鼠胰岛细胞凋亡及诱导型一氧化氮合酶表达的影响.《中医学报》 2012;(6)
论文作者:高尤亮1，施 红2，杨秀珍3，余文珍2，郑燕芳2，王晓宁2
论文发表刊物:《中华急诊医学杂志》2016年6月
论文发表时间:2016/12/9
标签：石斛论文; 合剂论文; 胰岛论文; 凋亡论文; 模型论文; 大鼠论文; 细胞论文; 《中华急诊医学杂志》2016年6月论文;