张民秀[1]2012年在《广西CSFV地方株的分离、全基因序列测定分析和致病性研究》文中研究表明本实验通过采集广西各地临床上疑似猪瘟的组织病料,经RT-PCR方法鉴定为阳性后接种到PK15细胞,采用带毒传代的方法分离到两株猪瘟病毒GXGP03和GXLC15。对这两株进行全基因克隆并测序,GXGP03和GXLC15株全长分别是12295bp和12296bp。GXGP03和GXLC15经序列分析发现,与HCLV、Shimen株的同源性较低,为84.2%-85.5%；与Paderborn、GXWZ02株的同源性为94.2%-94.9%。进化树分析表明,GXGP03和GXLC15都属于Subgroup2.1,与Paderborn、GXWZ02属于同一个亚群,亲缘关系较近,与HCLV株、Shimen株亲缘关系较远,并且根据GXLC15和GXGP03株的全基因组及各个基因进行进化树的构建,发现Erns基因、NS3、NS4B、NS5A的进化树中显示的基因分群与全基因组、E2基因、NS5B进化树中的基因分群基本相似,故推测着几个基因可成为基因分群依据的潜在性基因。通过与HCLV、India疫苗株、Shimen. Shimen-HVRI、Paderborn、GXWZ02株的3'-UTR序列比较发现,GXGP03和GXLC153'-UTR与强毒株Shimen、Shimen-HVRI及中等毒力株Paderborn、GXWZ02株一样缺失14个碱基。将40株毒株与GXGP03株、GXLC15株的Erns、E2蛋白进行氨基酸序列比较。分析Erns、E2糖基化位点,发现不同亚群毒株的糖基化位点存在差异,主要存在在数量上的差异,这是否与毒株的毒力相关,需要进一步研究。分析GXLC15和GXGP03株的Erns氨基酸序列,发现第476位氨基酸位点都为为Ser,没有发生变异,表明了GXLC15和GXGP03以非乙酰硫酸肝素的方式在PK15细胞上增殖。动物实验表明,GXLC15和GXGP03株对猪具有明显的致病性,在临床症状上表现为皮肤出现出血点和出血斑、腹泻、体温升高等症状,剖检后发现脾脏边缘梗死并呈锯齿状、肠系膜淋巴结出血、肿胀、肾点状出血、膀胱点状出血、腹股沟淋巴结出血、切面呈大理石花纹样等猪瘟典型症状。应用定量PCR对GXGP03攻毒后猪的分泌物、排泄物、血清进行CSFV的检测,发现猪在感染第6天出现病毒血症,并且在感染后第6～10天,在分泌物和排泄物中检测到CSFV病毒,说明CSFV在攻毒后第6～10天开始排毒。通过实验分析CSFV毒株毒力的强弱与白细胞变化、体温变化、临床症状、排毒情况有关。本实验中GXGP03和GXLC15感染猪只后白细胞数量在第4天开始减少,抗体在第4～第10天迅速上升,抗体滴度超过1：1024,并且白细胞数量的减少和抗体滴度的升高总是出现在体温升高、产生病毒血症、皮肤出血等临床症状之前。攻毒后组织病理变化显示,GXGP03感染猪只后,产生严重病理变化的为脾脏和肺脏。根据动物实验的临床症状、病理变化、结合GXGP03和GXLC15的分子生物学特性可判断GXLC15和GXGP03株是中等毒力的毒株,病程呈亚急性经过。
蒋毅立[2]2006年在《广西猪瘟病毒不同来源株的E2基因的克隆和序列分析》文中提出本研究采用RT-PCR技术对来自广西不同地区的猪流产胎儿与死胎82份、新生仔猪33份和老母猪白细胞172份进行猪瘟病毒检测，结果共有9份为阳性，其中死胎及流产胎儿4份、新生仔猪3份和母猪白细胞2份，从阳性病料中选取6份进行猪瘟病毒E2基因的克隆、测序，得到长度为1119核苷酸的目的基因片段。将这些阳性材料接种于易感细胞PK-15，经过三代盲传，用RT-PCR可检测到GXGZ02、GXXJC1和GXXJB1材料所接种的细胞为猪瘟阳性。 应用DNAstar序列分析软件对所测定的6个毒株与已知序列的HCLV、Shimen等毒株的相应片段进行同源性分析比较。结果显示，GXGZ02株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为82.3％和84.2％，其余5株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为96.8％～97.3％和94.3％～94.9％，推定的氨基酸同源性分别为89.8％～96.4％和91.2％～94.5％。除GXGZ02株，其余5株毒株之间核苷酸和推定的氨基酸同源性分别为99.1％～99.6％和98.4％～99.2％。6个广西毒株E2基因的所有Cys位点都没变，可推测猪瘟病毒E2蛋白在抗原结构方面依然保持很高的稳定性。与石门毒株、兔化弱毒疫苗株相比，广西毒株在具有中和特性的B、C区域内723和724氨基酸位点发生了变异。 把6个广西毒株与国内外已发表的猪瘟病毒相应序列进行比较，并建立了遗传进化树。该遗传树主要分为两大群和一个另类，除GXGZ02株属于基因Ⅱ群外，其余五株皆属于基因Ⅰ群，与属于同一基因群。
孙世琪[3]2000年在《猪瘟流行毒的E2基因序列分析及其致病性研究》文中提出本实验利用反转聚合酶链式反应（RT-PCR）、套组聚合酶链式反应（nPCR）与测定技术，测定了流行于甘肃的两株野毒株（GSLT，GSLX）E_2基因的核苷酸序列，用Goldkey软件分析比较了GSLT，CSLX相互之间以及它们与C-株兔脾组织毒（C-ST）E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性，分析了猪瘟流行毒的变异程度及其与C-ST的分子差异，并通过系统进化树分析，确立其遗传关系，试图从分子生物学角度揭示造成目前猪瘟仍频繁发生的原因。同时还以三株野毒（GSLX，GSLT，NXYC）建立了病理模型，对其致病性进行了比较研究。 实验结果表明：（1）GSLT与GSLX同源性高，同属于亚组群2.1，它们与C-ST同源性较低，属于不同的亚组群。GSLX、GSLT与C-ST比较，在E2糖蛋白抗原区中和抗原决定簇上有一定差异，可能会影响C株对野毒的中和滴度。（2）NXYC，GSLX，GSLT为中等毒力的毒株，均具有致病性，可引起亚急性型或慢性型猪瘟。（3）三株猪瘟流行毒可引起猪体许多器官发生病变，其中脑（小脑、大脑）、免疫器官（脾、淋巴结、扁桃体）和肾脏为其主要靶器官。（4）三株野毒所致病理组织学变化的特征是小脑与大脑的非化脓性脑膜脑炎，增生性肾小球肾炎、免疫器官的增生与坏死、小血管内皮增生及多组织器官的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润。
韩雪清[4]2002年在《猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究》文中进行了进一步梳理针对频繁出现的弱毒疫苗免疫失败现象和免疫猪群持续带毒等猪瘟(CSF)防制中的重大问题，本项研究从病毒的分子水平入手，试图从病毒分子变异水平以及当前流行毒的分子差异程度澄清原因，并针对CSF的持续感染研制出高效安全的基因工程标记疫苗和诊断试剂，为彻底消灭CSF提供科学依据和技术支撑。主要研究内容包括： 1．猪瘟病毒主要免疫原E2基因的序列分析：利用反转录PCR(RT-PCR)及套式PCR(nPCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株(C株)兔脾组织毒保护性抗原E2(gp55)基因，成功地将其克隆并测定核苷酸序列，与国内外已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因序列比较的结果是：C-株兔脾毒与C-株细胞(SK6)毒、C-株疫苗(犊牛睾丸细胞，CSFV-C)毒CSFV-SM株(石门)毒、Bresia株(荷兰)毒、Alfort株(德国)毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87％、98.34％、94.58％、91.00％、80.78％；氨基酸同源性分别为98.95％、97.37％、94.22％、91.60％、89.23％。对C-株兔脾毒与C-株细胞毒、经典强毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较，其结果为：C-株兔脾毒与C-株疫苗细胞毒的差异很小甚至没有差异。 2．猪瘟病毒分子流行病学分析：利用RT-PCR及nPCR扩增并测定了我国近期(1997～2001年)12个省的51株流行野毒株的E2基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：C-株兔组织毒、C—株细胞毒和中国50～60年代流行的石门强毒株同属于组群1(Group 1)；近期猪瘟流行毒株均属于组群2(Group 2)的两个不同的亚组群(Subgroup2.1和2.2)，表明我国目前流行毒株至少有2个亚组群。流行毒株与疫苗毒株有较大的差异(E2全基因核苷酸序列同源性82.2％～84.3％)，表明猪瘟流行毒株已远离疫苗毒株的方向演变，明确了我国CSF流行趋势及我国CSFV在世界SCFV大系谱中的位置，并为基因工程疫苗的研究提供了基因储备。 3．猪瘟病毒E2基因的真核表达：分别将CSFV两个代表株的E2基因克隆入毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中，酶切线型化后电穿孔导入P.Pastotis进行整合，经G418筛选得到25个高拷贝转化子，经DNA斑点试验和DNA测序证明外源基因E2稳定地整合到P.Pastoris染色体中。经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE和Western blot结果证明了P.Pastoris培养上清液中含有正确糖基化的E2蛋白，表达量约250mg/L。重组P.Pastoris经连续培养8代仍可分泌特异性蛋白。免疫活性研究证明P.Pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生1：128～1：256猪瘟病毒的抗体。有望用于基因工程亚单位疫苗的研制。 4．猪瘟病毒E2基因的密码子改造优化：低利用率密码子的数量和分布是影响外源基因有效表达的参数之一，优化密码子序列能够提高外源基因的表达。利用PCR基础上的定点突变方法对猪瘟病毒E2基因的24个密码子进行优化。优化后的E2基因转化P.Pastoris菌，甲醇诱导表达。诱导培养上清的SDS-PAGE和Western blot分析显示，E2蛋白在P.Pastoris中得到了高效的表达，表达量约1.08g／L。这表明对E2基因上低利用密码子的改造是成功的， 猪瘟病毒EZ基因遗传变异及体外表达研究为进一步大规模生产打下了基础。5．毕赤酵母高效表达的培养条件探索：用PPastoris系统表达外源基因，对于不同的外源蛋白，表达量千差万别。除外源基因序列本身的内在特性起着很重要的作用外，表达条件对表达量高低的影响也极其显著。分别在不同时间、不同诱导型、不同pH、不同诱导剂量方面进行了较系统的对比：经不同时间表达，表明72小时蛋白可达峰值；采用抑制／诱导方式会提高表达量；表达EZ蛋白pH最佳值在7．5—8刀；最佳甲醇诱导量是2％～3％；得到了一套较完善的在PPastoris中表达CSFV EZ基因的条件，以供在规模化发酵罐中表达EZ基因蛋白生产亚单位疫茵。6．猪瘟病毒EZ基因的原核表达：PCR扩增出当前猪瘟流行野毒株，中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒EZ基因的主要抗原区，将其克隆到原核大肠杆菌表达载体PPROEX－HTb中诱导表达，经 SDS－PAGE检测表明，重组质粒能表达EZ基因主要区蛋白，Western blot检测表明，诱导表达蛋白与猪瘟阳性血清发生特异性反应，表达量为35％和38％，可用于基因工程诊断抗原。7．猪瘟病毒EZ基因的乳腺特异表达载体构建：将在乳腺细胞中特异分泌的信号肽序列连接到EZ基因，PCR得到了目的片段，再将pGFPCI载体上的Kana基因切下与在乳腺细胞中特异表达的P22载体连接，使其带有筛选标记，然后将带有信号肽的EZ插入到P22中，试图构建山羊乳腺上皮细胞的特异性表达载体。探索了构建的含目的基因的乳腺特异性表达载体调控成分的有效性，也为在体外培养的乳腺细胞中定位重组目的基因一体细胞克隆一动物乳腺生物反应器工作的开展作准备工作。
吴锐[5]2015年在《猪瘟病毒糖蛋白E2和3'非编码区在决定病毒特性和致病性中的作用》文中认为猪瘟是一种由猪感染了猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV)所引起的急性、高度致死性烈性传染病。猪瘟在我国发生和流行,给养猪业造成严重危害。疫苗接种是预防猪瘟的有效途径。我国现行用于预防猪瘟的减毒活疫苗为猪瘟兔化弱毒株(Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV),简称猪瘟疫苗C株,是上世纪50年代我国科研人员将CSFV强毒石门(Shimen)株在兔体中连续传代后适应获得。本论文研究了猪瘟疫苗C株E2基因和基因组3'非编码区在决定CSFV复制效率和致病性中的作用,旨在揭示猪瘟疫苗C株减毒的分子机制,为研发猪瘟新型疫苗提供新思路。主要研究成果包括：(1)以CSFV Shimen株基因组RNA为模板,特异引物RT-PCR扩增病毒基因组cDNA片段,将PCR扩增片段依次克隆连接到质粒载体pACNR1180中,构建基因组全长cDNA克隆pSM。将pSM线性化,体外转录得到CSFV的基因组vRNA,将vRNA转染至PK15细胞,成功拯救出具有感染性的猪瘟病毒(vSM)。拯救产生的vSM与野生型猪瘟病毒(wtSM)在PK15细胞上具有相同的增殖特性。(2)基于CSFV Shimen株感染性cDNA克隆反向遗传操作,将猪瘟疫苗C株E2基因和3'UTR分别或同时替换Shimen株基因组的对应序列,构建了嵌合病毒感染性克隆pSM/CE2、pSM/C3'UTR和pSM/CE2/3'UTR,并拯救得到了嵌合病毒vSM/CE2, vSM/C3'UTR和vSM/CE2/3'UTR。与亲本病毒vSM相比,嵌合病毒vSM/CE2在细胞上的复制效率和形成蚀斑能力降低：嵌合病毒vSM/C3'UTR细胞生长特性略有改变；嵌合病毒vSM/CE2/3'UTR在细胞上的复制效率和形成蚀斑的能力显著降低,表明猪瘟疫苗C株E2和3'UTR对病毒复制有协同调节作用。用嵌合病毒vSM/CE2、 vSM/C3'UTR和vSM/CE2/3'UTR分别感染仔猪,所有组仔猪均存活,不表现任何猪瘟临床症状或者仅表现轻微的猪瘟临床症状。而感染亲本病毒vSM的仔猪均表现出典型急性猪瘟临床症状,所有猪在感染病毒11天内死亡。这些结果表明,嵌合病毒vSM/CE2、vSM/C3'UTR和vSM/CE2/3'UTR毒力减弱。(3)将嵌合病毒在PK15细胞上连续传代至第11代时,vSM/CE2-p11和vSM/CE2/3'UTR-pll在PK15细胞的复制效率比原代嵌合病毒升高约10倍；与原代嵌合病毒相比,vSM/CE2-p11形成更大的蚀斑,而vSM/C3'UTR-p11的复制效率和形成蚀斑能力没有改变。猪体实验结果表明,与原代嵌合病毒相比,vSM/CE2-p11和vSM/C3'UTR-pll对仔猪致病性明显增强,而vSM/E2/3'UTR-pll的致病性略有增强,但不足以导致仔猪死亡。(4)对病毒vSM/CE2-pll进行全基因组测序分析发现,E2基因出现氨基酸突变T745I和M979K。基于嵌合感染性克隆pSM/CE2反向遗传操作,构建了感染性克隆pSM/CE2/T745I、pSM/CE2/M979K和pSM/CE2/T745I;M979K,成功拯救突变体病毒vSM/CE2/T745I、vSM/CE2/M979K和vSM/CE2/T745I;M979K。与亲本病毒vSM/CE2相比,突变体病毒的增殖效率显著提高。猪体实验结果证实氨基酸突变T745I和M979K增强病毒vSM/CE2的致病性。(5)用具有减毒特性的重组嵌合病毒进行猪体免疫接种,于接种后第23天用CSFV强毒Shimen株攻毒感染,所有仔猪存活,均未表现出猪瘟临床症状。表明猪瘟疫苗C株E2和3'UTR替换构建的嵌合CSFV减毒株能够诱导完全抵抗CSFV强毒致死攻击的免疫保护。以上研究成果有助于更好的了解猪瘟疫苗C株减毒的分子机制并为开发新型猪瘟疫苗提供了有益的借鉴和参考。
张永国[6]2005年在《猪瘟Shimen株致猪血管内皮细胞病变前后表达差异基因寻找及E2基因PK-15细胞表达》文中研究表明猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪急性高度接触性传染性疾病,是严重威胁养猪业,具有重要经济意义的病毒性疾病之一,猪瘟可引起猪的全身组织器官弥漫性出血,小血管和毛细血管内皮细胞发生变性、坏死。猪瘟病毒为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,基因组大小约12.3kb,含一个大的开放阅读框(ORF),由11 个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。猪瘟病毒对血管组织具有亲嗜性,病理组织学检查时发现,组织器官的出血斑点主要是由于小血管和毛细血管内皮细胞发生肿胀、变性和坏死;梗死灶的发生主要是由于小动脉管内皮细胞发生变性、坏死、剥脱后,血管内膜粗糙,官腔内血栓形成,导致官腔狭窄或闭塞所致。此外,还可见到心肌呈实质变性,但病猪的肾脏等器官的实质细胞没有变性、坏死等病理变化。而目前在体外增殖猪瘟病毒利用的培养细胞大多数是猪肾细胞(如PK–15、PK–2a、SK–6等),其他还有猪肺、脾、睾丸、骨髓细胞等。这些细胞即使在猪瘟病猪体内都不会发生病理变化,所以在体外受CSFV 感染时不产生CPE也是理所当然的。病理组织学观察发现猪血管内皮细胞在猪瘟感染猪后发生明显的细胞病变,建立猪血管内皮细胞体外培养方法,观察猪瘟病毒感染猪血管内皮细胞致细胞病变后的细胞形态变化和细胞器的变化,探讨猪瘟病毒致猪血管内皮细胞病变的机理。猪瘟病毒E2基因编码的gp55 蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原,是目前研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因。采用来源于猪的PK–15 细胞做为受体细胞,利用哺乳动物细胞表达载体表达E2基因,一方面可充分利用受体细胞遗传密码子的嗜好性,提高重组蛋白的表达量,另一方面因为PK–15 细胞来源于猪,后加工与其他表达宿主相比具有无比的优越性,其免疫原性和疫苗的免疫保护力可望得到很大提高,为猪瘟病毒基因工程疫苗投入实际应用奠定基础。本研究由三部分构成,第一部分是建立猪脐静脉血管内皮细胞的培养方法,利用猪瘟病毒Shimen株感染猪脐静脉血管内皮细胞,研究猪瘟Shimen 株致细胞病变效应后的形态变化和细胞器的变化,初步探讨了猪瘟病毒致猪血管内皮细胞病变的分子基础。第二部分利用DDRT–PCR技术分析了猪瘟Shimen 株致猪脐静脉血管内皮细胞病变前后表达差异的基因,共发现了推测为猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变的11条敏感基因。第三部分是利用PK–15 细胞作为受体细胞,表达猪瘟病毒E2基因,为建立以重组蛋白为抗原的猪瘟病毒检测方法和猪瘟基因工程疫苗的应用奠定基础。主要试验和结果如下:1.选用I 型胶原酶,采用Jaffe 式灌流法成功的分离和培养了猪脐静脉血管内皮细胞。扫描电镜观察和第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧR Ag)检测阳性,证明分离培养的细胞为血
刘百林[7]2006年在《甘肃流行猪瘟病毒E2基因序列测定及分析》文中研究说明猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever viFUS，CSFV)引起的猪的一种热性全身性败血性传染病，以很强的传染性和高致死率为特征，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，给养猪业造成巨大的经济损失。因此研究猪瘟病毒的变异程度以及分子生物学检测方法，对猪瘟的防制具有重要意义。本研究采用RT-PCR技术对猪瘟病毒E2基因进行了扩增、克隆和测序，得到长度为1 100bp，编码367个氨基酸残基的目的基因片段。应用DNAStar序列分析软件对所测定的E2基因序列与参考毒株进行了同源性比较，发现与Alfort株核苷酸同源性为84.5％，推导的氨基酸同源性为91.3％，与Shimen株核苷酸同源性为84.1％，推导的氨基酸同源性为90.4％，与中国C株核苷酸同源性为83.3％，推导的氨基酸同源性为89.3％，与AY027672株核苷酸同源性为95.8％，推导的氨基酸同源性为97.0％，与AY554379株核苷酸同源性为96.1％，推导的氨基酸同源性为97.8％：从系统发生树上明显可以看出，本研究分离的毒株与近期分离的AY027672和AY554379株遗传距离较近，而与其他三株较远，证明已分离的猪瘟毒株在进化上存在着某些地理位置上的相关性，但随时间和地理位置的变化而又发生了较大的变异。在已测定基因序列的基础上，设计一对引物，建立了猪瘟RT-PCR检测方法，共计检测了15份可疑病料，发现8份为阳性，阳性率为53.3％，证明猪瘟在我国规模化养猪场普遍存在。
林旭埜[8]2009年在《猪瘟活疫苗全新工艺的研制与应用》文中提出猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的猪的一种危害严重的烈性传染病。本研究培育了猪睾丸传代细胞(Swine Testis Cell,ST细胞)应用于猪瘟活疫苗,建立了猪瘟活疫苗(传代细胞源)的生产规程和质量标准,批量生产猪瘟活疫苗,并在我国八省30余个猪场推广应用,获得良好效果。为猪瘟疫病的防控奠定了坚实的基础。ST细胞培育：选用ST细胞系作为繁殖猪瘟兔化弱毒病毒液的细胞基质,将ST细胞传3代增殖至适量建立基础细胞库；将基础细胞传4代增殖至适量建立工作细胞库,对基础细胞库和工作细胞库细胞进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验,确认无任何污染。对ST细胞进行了细胞使用最高代次的研究,工作细胞库复苏的细胞传25代仍能生长良好,并保持细胞的纯净性和良好的病毒增殖能力。将基础细胞库的第3代细胞、最高限制代次细胞(工作细胞库复苏传至20代)和超过最高代次5代细胞(工作细胞库复苏传至25代细胞)进行细胞软琼脂集落试验、裸鼠肿瘤形成试验、染色体数检查等试验,未发现异常。没有致瘤、致癌、致畸性,符合弱毒活疫苗生产用细胞的各项特性,该细胞可用于猪瘟疫苗的生产。猪瘟种毒：对猪瘟兔化弱毒进行纯净性、安全性、免疫原性等多项检验,建立的生产用细胞毒种种子批经全面鉴定结果均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)中相关标准。疫苗研制：应用生物反应器进行了猪睾丸传代细胞的高密度培养和猪瘟病毒的高密度培养。对不同代次细胞产毒情况、不同接毒量、接毒后不同时间收获、病毒液于不同温度保存期等工艺进行研究和比较试验。结果显示,当脾毒种病毒含量≥105RID/ml时,接种含0..2-0.3%脾毒种的维持液,当细胞毒种病毒含量≥5×105RID/ml时,接种含3-5%的细胞毒种的维持液,于接种后5天作第1次收获换液,以后每隔4天收获换液1次最为合适,此时收获的病毒液病毒滴度最高且稳定；收获的病毒液在-15℃以下保存3个月,病毒液效价基本保持不变。建立了应用生物反应器培养猪瘟活疫苗的生产工艺；制定了猪瘟活疫苗(传代细胞源)的生产规程和质量标准。安全与效力检验：ST传代细胞源猪瘟活疫苗每头份的病毒含量比原代牛睾丸细胞苗的规程标准高了10倍,安全和效力检验试验结果证明：传代细胞源猪瘟活疫苗(7500RID/头份)30头份接种猪,3批实验室疫苗的安检猪均未出现任何不良反应,对猪安全。以1/7500头份接种家兔,所有效力指标合格；以1/5000头份接种猪,攻毒后均100%保护。疫苗对猪能产生良好免疫保护力。与同类产品的比较：参照《中华人民共和国兽药典》(2005年版)猪瘟活疫苗(细胞源)成品检验方法检验,将研制开发的的用ST传代细胞生产的猪瘟活疫苗(传代细胞源)与同类产品用牛睾丸原代细胞生产的猪瘟活疫苗(细胞源)的各项指标的比较试验表明用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗1/5000头份免疫猪能100%产生免疫保护；1/7500头份接种家兔均能符合规程兔体反应热的要求,全部合格。比较疫苗的病毒含量、效力和安全检验结果,该疫苗的病毒滴度和免疫保护效力高于现有BT原代细胞活疫苗规程标准的10倍,用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗以30倍剂量进行安全检验,全部合格。通过对ST、BT细胞疫苗毒株E2基因所编码的gp55抗原蛋白的核甘酸、氨基酸序列比较及抗原结构和中和抗原决定簇上的差异分析,发现猪瘟兔化弱毒疫苗株在经ST和BT细胞培养后,其保护性抗原基因E2并没有明显的变化,所研究的猪瘟细胞疫苗毒在遗传上表现高度的稳定性。推广应用：在获得农业部猪瘟活疫苗(传代细胞源)生产许可后,严格按照农业部发布的猪瘟活疫苗(传代细胞源)制造及检验暂行规程、暂行质量标准的规定组织生产和检验,2008年共生产猪瘟活疫苗(传代细胞源)5批,517万头份。2009年生产了22批,经检验合格20批,2462万头份。至2009年7月31日为止,在规定的8省共销售使用了猪瘟活疫苗(传代细胞源)7批733万头份,参照各猪场免疫程序对仔猪、保育猪、育肥猪和种猪进行免疫接种,未有不良反应以及免疫猪发生猪瘟临床感染和亚临床感染的反馈。在规定的广东、湖南、河南、四川、江苏、山东、辽宁和福建等8省选择了30多个规范化猪场使用,按照猪瘟活疫苗(传代细胞源)规定的使用说明,结合各场的免疫程序进行免疫接种,并进行临床应用安全性观察、田间免疫效果等情况的跟踪调查工作,经过7批次389万头份疫苗使用观察,对经产母猪、种公猪、后备种猪、商品肉猪一次与多次免疫接种,未见任何不良反应,安全性好,免疫效果确切。
王启宇[9]2012年在《山东省部分地区猪瘟流行病学调查及其E2基因的毕赤酵母表达》文中提出猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的一种热性、全身性出血、败血性传染病,以很强的传染性和高致死率为特征,不同年龄、性别和品种的猪均能感染,给养猪业造成了巨大的经济损失。近年来猪瘟免疫失败的报道较多,猪瘟流行出现了一些新特点,这可能与高免疫压力下猪瘟病毒变异存在一定的相关性,因此,开展猪瘟流行病学调查,掌握猪瘟的流行状况及病毒的变异程度,以及研发亚单位疫苗作为根除猪瘟的技术储备,对猪瘟的防控具有极其重要的意义。本研究首先利用IDEXX公司的猪瘟抗体、抗原检测试剂盒对2011年来自山东省不同地区的10个规模化免疫猪场的猪群做了抗体水平、抗原感染检测,其中对此10个猪场共1028份血清进行了抗体水平检测,另对这10个猪场中免疫状况较差的5个猪场重新采取的383份血清进行了抗原检测,结果抗体阳性率为45.34%-84.00%不等,抗原阳性率为0%-2.32%不等,说明所监测的山东部分地区猪瘟免疫水平参差不齐,部分猪场免疫效果较差,达不到良好的保护率,同时发现免疫猪群存在猪瘟带毒现象。针对猪瘟带毒、免疫失败现象,我们又对上述所检测猪场中送检来的13份病料进行了RT-PCR检测,共鉴定出6份猪瘟阳性病料,将之接种于PK-15细胞,成功分离到6株猪瘟病毒,分别命名为HZ、LW、YT、JN、RZ、TA,对这六株猪瘟毒株进行实时荧光定量检测,结果表明它们均是流行野毒株,从而进一步证实了免疫猪场的确存在猪瘟带毒现象,因此在实际生产中,应对猪群的猪瘟抗体水平进行定期监测,并适时采取措施,使之保持在较好的水平之上,以抵抗野毒的感染。利用分子生物学技术,我们对已分离的6株猪瘟毒株进行E2基因部分编码序列的扩增、克隆并测序,利用DNAstar软件对测序结果和推断的蛋白序列与Shimen株、HCLV株, Alfort株等9株经典猪瘟毒株进行比对,结果发现分离毒株E2基因之间的无论核苷酸同源性还是蛋白质同源性都很高；而与经典毒株比较,核苷酸同源性在79.4%-94.8%不等,蛋白质同源性在82.6%-96.1%不等,其中与GuangXi株的同源性最高；与HCLV株的核苷酸序列、蛋白质序列同源性分别只为79.4%-82.3%和83.2%-88.0%,与Shimen株的核苷酸序列、蛋白序列同源性只为81.3%-84.3%和84.4%-89.2%,这意味着山东省最近一年流行的猪瘟毒株与广西株有一定的亲缘关系,而与我国的疫苗株和Shimen株相比,则发生了较大的变异,说明我国猪瘟流行毒株正朝着远离疫苗毒株的方向变化；根据遗传进化树分析,此6株山东省流行猪瘟毒株均属于基因Ⅱ群,与GuangXi株同属于一个基因群,且都属于2.2亚基因群,而Shimen株、HCLV株属于基因Ⅰ群。鉴于山东省最近一年的流行毒株已向远离疫苗株的方向变化,这种变化是否是猪瘟免疫失败的原因之一尚难确定,但是开展猪瘟根除和猪瘟净化技术储备的研究,尤其是开展猪瘟基因工程疫苗的研究,意义还是非常重大的。我们对猪瘟病毒最主要的保护性抗原E2基因进行了去除跨膜区域的PCR扩增,将其插入巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建重组质粒pPICZaA-E2,将该质粒用Sac Ⅰ酶切线性化后,电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X-33中,经Zeocin筛选得到高拷贝转化子,通过甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western bolt试验验证,结果表明E2蛋白在酵母中获得成功表达,为猪瘟基因工程亚单位疫苗研究奠定了基础。
贾怀杰[10]2009年在《猪繁殖障碍性疫病流行毒株的分离、鉴定及其多重PCR诊断方法的建立》文中指出猪繁殖障碍性疫病是近年来养猪生产实践中最为普遍和突出的问题,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。其中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、圆环病毒和伪狂犬病毒等在临床上多引起猪的繁殖障碍性疫病,且常呈混合或继发感染。本研究采集临床疑似猪繁殖障碍性疫病病料,在初步分析和鉴别诊断的基础上,对繁殖障碍性疫病流行病毒株的分离和鉴定,克隆并分析其重要功能基因,为研制新型疫苗奠定基础;并建立适于临床应用的快速诊断方法,为猪病防控提供有效的技术手段。主要研究如下:1、采集江西省某猪场疑似猪繁殖障碍性疫病病料,经RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)阳性,病料处理后接种Marc-145细胞盲传,传至第6代时出现明显的细胞病变,RT-PCR检测为阳性,继续传代增殖,扩增、克隆和分析其基因代表序列,测定病毒感染细胞和靶动物的能力,电镜观察病毒粒子形态。结果测定PRRSV的感染滴度为108.02/mL TCID50;感染实验仔猪可复制到猪蓝耳病典型的临床症状和病理变化;电镜观察可见约20nm的典型的PRRS病毒粒子,表明已成功地分离到一株美洲型PRRSV流行株(命名为JX0708株)。随后利用RT-PCR分段扩增法,从分离株中分别扩增PRRSV Nsp2非结构蛋白、ORF2～ORF7结构蛋白全基因,其中Nsp2非结构蛋白长3496bp,结构蛋白全基因长3176bp。NSP2非结构蛋白氨基酸序列分析发现,该毒株与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株的同源性高达99.4%(JX143株,EU708726),与美洲型代表株VR-2332相比缺失了30个氨基酸,这表明该毒株为变异的美洲型PRRSV毒株。结构蛋白基因遗传演化关系分析进一步证实该毒株的变异存在某种地域上的相关性,但每个基因的变异,并不严格遵从地域上的相关性。2、采集甘肃兰州某猪场疑似猪瘟病料,处理后接种PK-15细胞盲传,经RT-PCR检测为猪瘟病毒(CFSV)E2基因阳性,继续传代增殖,测定病毒感染细胞和动物的能力,电镜观察病毒粒子形态。电镜观察可见约25nm的典型的CSF病毒粒子。细胞毒接种于家兔无体温变化,接种30日龄仔猪可复制到猪瘟典型的临床症状和病理变化,证实已分离到猪瘟强野毒株CSFV GSLZ株。已CSFV GSLZ株分离毒为材料,采用RT-PCR技术扩增到了其E2全基因,长度为1111bp,与标准参考毒株及其国内外分离株同源性比较,发现与其有较高的同源性。与中国C株的氨基酸序列及其抗原表位比较,发现在主要抗原区发生了变异。3、利用PCR技术从断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)疑似病料中,扩增、克隆和分析了两株PCV2全基因组,全长均为1767bp,同源性和结构特性分析显示两种毒株的变异主要发生在ORF2区段,ORF1区段相对较保守。遗传演化关系分析显示,本试验克隆的2株PCV2皆属于欧洲型毒株,2株病毒全基因组序列同源性为95.8%,分别命名为PCV2 GSLZ(登录号为FJ447482)和GSBY毒株,这对PCV2的分子流行病学调查以及预防控制提供了理论依据。4、本研究在建立CSFV、PCV2、PRRSV和PRV单项PCR诊断方法的基础上,成功建立了同时检测CSFV、PCV2、PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法,并对30份临床样品检测,证明该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,这为上述几种繁殖障碍性疫病的早期诊断和鉴别诊断提供了一种快速、敏感、特异的诊断方法,也为其病原的分离、分子流行病学调查以及免疫预防控制提供了理论依据。
参考文献：
[1]. 广西CSFV地方株的分离、全基因序列测定分析和致病性研究[D]. 张民秀. 广西大学. 2012
[2]. 广西猪瘟病毒不同来源株的E2基因的克隆和序列分析[D]. 蒋毅立. 广西大学. 2006
[3]. 猪瘟流行毒的E2基因序列分析及其致病性研究[D]. 孙世琪. 甘肃农业大学. 2000
[4]. 猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究[D]. 韩雪清. 西北农林科技大学. 2002
[5]. 猪瘟病毒糖蛋白E2和3'非编码区在决定病毒特性和致病性中的作用[D]. 吴锐. 武汉大学. 2015
[6]. 猪瘟Shimen株致猪血管内皮细胞病变前后表达差异基因寻找及E2基因PK-15细胞表达[D]. 张永国. 西北农林科技大学. 2005
[7]. 甘肃流行猪瘟病毒E2基因序列测定及分析[D]. 刘百林. 甘肃农业大学. 2006
[8]. 猪瘟活疫苗全新工艺的研制与应用[D]. 林旭埜. 南京农业大学. 2009
[9]. 山东省部分地区猪瘟流行病学调查及其E2基因的毕赤酵母表达[D]. 王启宇. 南京农业大学. 2012
[10]. 猪繁殖障碍性疫病流行毒株的分离、鉴定及其多重PCR诊断方法的建立[D]. 贾怀杰. 甘肃农业大学. 2009
标签：生物学论文; 畜牧与动物医学论文; 氨基酸残基论文; 猪瘟论文; 同源重组论文; 猪瘟病毒论文; 同源基因论文; 问题疫苗论文; 传代培养论文; 核苷酸论文;