张光东[1]2003年在《大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞的定向诱导分化》文中进行了进一步梳理颅神经嵴向腹外侧迁移到达颌突的中胚层以后，就被称为“外胚间充质”。神经嵴源性的外胚间充质干细胞具有可塑性，可分化为骨、软骨、牙本质和牙髓等多种组织，因此，在颅面和牙齿发育过程中起着重要的作用。外胚间充质干细胞在体内经过多步的分化，最终分化为分泌矿化基质的高柱状的成牙本质细胞。在这个过程中，有许多细胞外基质分子、信号分子、生长因子(如：FGF、IGF、TGF等)和它们受体的精确调控，而且，精确的细胞-细胞、细胞-基质、基质-基质交互作用有利于促进成牙本质细胞的分化以及对基质钙化起关键作用成分的合成。研究者已经注意到在成牙本质细胞分化调节过程中的几种调节因子及其与上皮源性成釉细胞间复杂的相互作用。 DSPP基因(表达DPP和DSP两种蛋白)，基本上是牙本质矿化所独有，目前虽然有报道显示在大鼠长骨中有少量DSPP表达，但大多数学者仍将DSPP作为成牙本质细胞活性的特异性表面标志。 本研究采用细胞培养、免疫组化、原位杂交以及RT-PCR等实验手段，以DSPP基因、DSP蛋白作为成牙本质细胞的特异性标志，通过体内体外实验诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞的分化，为进一步阐明牙齿发育和牙体牙髓损伤修复机制以及组织工程牙齿的研究提供实验和理论依据。 实验共分叁部分： 第四军医大学博士学位论文 1．SD大鼠颔突外胚间充质干细胞的体外培养和鉴定 采用差异消化贴壁法分离和纯化培养SD大鼠颌突外胚间充质干细胞；倒置显微镜观察细胞生长特性；免疫组化法鉴定细胞来源。结果，细胞里成纤维细胞样细胞生长，状态稳定。免疫组化染色显示细胞表达HNK．l、VIM、S上 和NSE，而GFAP、NF、CK和Vlll因子为阴性。从而证明培养的细胞为外胚间充质干细胞，为定向诱导分化研究提供了实验基础。 2．hFGF和！GFl诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞分化 L＊ bFGF和 IGFl对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性的影响。 采用MH比色法和ALPase细胞免疫化学法检测bFGF和（或只GFJ刺激后，大鼠外胚间充质干细胞的增殖活性和ALPase活性。结果显示：bFGF和IGF－l刺激组和IGF刺激组细胞增殖活性与对照组无明显差异，而bFGF刺激组明显高于对照组；但是对于ALPase活性，bFGF和IGF1刺激组和IGF刺激组明显高于对照组，而bFGF和 IGF－l刺激组又明显高于IGF刺激组，bFGF刺激组则与对照组无明显差异。因此认为bFGF可促进大鼠外胚间充质干细胞的增殖，bFGF和 IGF－l可能协同促进其分化。这可为其诱导分化研究提供参考。 2．2 bFGF和！GF’4诱导大鼠外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞分化。 ＊2司在培养液中加入bFGF和（或n 刺激大鼠外胚间充质干细胞，结果显示：在bFGF和IGF－l刺激组，细胞生长状态好，胞浆突起变长，免疫组化显示数量较多的细胞表达DSP，IGFI刺激组中只有少量细胞形成较为典型的成牙本质细胞样形态，而且部分细胞表达DSP，而bFGF组和对照组没有出现成牙本质细胞样细胞表型。 2．2二在平面培养的基础上，以胶原作为支架，建立大鼠颌突外胚间充质干细胞叁维诱导培养模型，采用免疫组化、原位杂交、RT．PCR和von Kossa 3 第四军医大学博士学位论文染色等手段从形态学和表型鉴定显示：bFGF和IGF诱导组细胞出现单极胞浆突起，而且平行排列，且表达 DSP、DMP、DPP mANA和 DSPP，矿化液诱导培养Zld后，细胞形成矿化结节。然而其余组没有出现成牙本质细胞样细胞表型。 以上实验证实bFGF和IGFI可诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞的分化。为研究牙齿发育和牙体牙髓损伤的分子机制奠定了基础。 3．bFGF和！GF＊诱导大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞分化的体内实验 将经过不同因子诱导的细胞与珊瑚和牙本质陶瓷粉复合后分别植人大鼠和裸鼠皮下，在一定时间后取材，经HE染色、Mallory改良叁色法和免疫组化显示：经bFGF和IGF－l诱导的细胞可形成少量的钙化基质，而其余组均未出现基质沉积。这可为组织工程牙齿种子细胞的来源和支架材料的选择提供参考。
周泽渊[2]2004年在《颌突外胚间充质干细胞的可塑性研究》文中指出外胚间充质是脊椎动物一个独特的结构，它包含了迁移来的颅神经嵴细胞及其衍生物。颅神经嵴细胞被认为具有最高的分化潜能，它可以分化成为神经和间充质两个胚层的组织，是一种具有多向分化潜能的干细胞。多年来通过对鸟类和哺乳动物体内、体外以及细胞水平的研究，对颅颌面部的发育和形成的神经嵴-外胚间充质的模式已经有了深入的了解。 在发育过程中，颅神经嵴细胞经历了叁个主要步骤：从神经外胚层迁移至咽弓；在外胚间充质中增殖；最后分化成为颅颌面部的大部分组织。迁移的神经嵴细胞与周围组织的细胞相互作用，经历了一个从上皮到间充质表型的转化过程。以前研究认为神经嵴细胞的分化逐渐受到限制。然而1990年Baroffio等发现大约有2.6％的迁移的颅神经嵴细胞可以分化成神经和间充质两个胚层的许多衍生组织，提示迁移的细胞中包含具有多分化潜能性的颅神经嵴干细胞。目前还不清楚未分化的神经嵴干细胞迁移至外胚间充质后是否还存在，但是神经嵴是一个暂时性结构，而颅颌面部的大部分组织结构都由外胚间充质发育而来，提示外胚间充质也类似神经嵴是一个具有多分化潜能性的结构。因此，我们认为外胚间充质中包含迁移的神经嵴干细胞或其转化的干细胞-外胚间充质干细胞(Ecto-mesenchymal stem cell EMSC)。 第四军医大学博士学位论文 最近一些研究支持了这一观点，例如牙髓干细胞的发现，它存在于牙髓组织中，被认为来源于外胚间充质。另外一些研究显示神经峭干细胞迁移后仍然存在于它所迁移的组织中，一些时候它们的表型可以发生迅速改变。在周围神经系统中也存在神经峭干细胞，并且在体内可以自我更新。Labat等从长期培养的外周血单核细胞发现了一种神经晴来源的间充质干细胞，这种细胞同时表达神经外胚层和中胚层的标志，说明外胚间充质干细胞可能在体内长期存在。尽管许多证据显示EMSC的存在，但是目前对它的研究较少，还没有进行系统的鉴定和分离。 本研究旨在分离外胚间充质干细胞，并研究其可塑性。主要研究的内容和结果如下:1领突外胚间充质细胞的形态及表型鉴定1.1领突外胚间充质细胞的形态学研究 分离胚胎为E12.5 SD大鼠胚胎领突组织，制备电镜标本，观察外胚间充质细胞的超微结构。结果显示外胚间充质细胞主要为间充质样细胞，形状不规则，呈多突起的星形或梭形，突起不规则;核、浆比例大;核仁明显，大、靠边;常染色质多，异染色质少;高倍电镜显示细胞内部有大量的线粒体、少量粗面内质网和核糖体:未发现其它成熟己分化细胞，例如:脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞以及神经肌肉组织细胞及其超微结构特征，因此结果表明外胚间充质细胞代谢旺盛，增殖活性高，处于未分化状态。1.2领突外胚间充质细胞的表型鉴定 分离胚胎为E12.5 SD大鼠胚胎领突组织，制备石蜡标本，免疫组化鉴定外胚间充质细胞的分子表达。组织化学染色显示大部分领突间充质细胞表达神经峭干细胞的标志低亲和力神经生长因子受体LNGFR，Nestin，和人自然杀伤标志HNK一1，提示外胚间充质中存在表达神经峭干细胞标志的细胞。同时，外第四军医大学博士学位论文胚间充质细胞表达S一100，波形丝蛋白Vimtine，但不表达成熟细胞的标志。S一100是神经胶质前体细胞和神经峭来源的间充质前体细胞的标志，但是在中胚层来源的间充质细胞中不表达，说明外胚间充质细胞是一种幼稚的未分化细胞，并且来源于神经峭。结果说明外胚间充质中存在着迁移的神经峭干细胞或其转化的干细胞，我们称之为外胚间充质干细胞。2领突外胚间充质干细胞的分化研究2.1磁珠分离领突外胚间充质干细胞 采用差异消化贴壁法分离和纯化培养SD大鼠领突外胚间充质细胞;利用磁珠技术分离具有神经靖干细胞标志一LNFGR的外胚间充质干细胞，倒置显微镜观察细胞生长特性;利用免疫荧光双标技术鉴定分离的细胞。结果显示磁珠分离的外胚间充质细胞呈成纤维细胞样细胞生长，状态稳定;免疫荧光结果显示磁珠分离的LNGFR十的细胞共表达神经峭干细胞的其它标志Nestin和HNK一1，结果说明成功分离了LNGFR+的外胚间充质干细胞，为下一步研究打下了良好的基础。2.2诱导领突外胚间充质干细胞向骨骼肌细胞分化 利用DMSO诱导外胚间充质干细胞分化，通过免疫组化和RT一尸CR鉴定，以大鼠成纤维细胞作为对照。结果显示外胚间充质干细胞经DMSO诱导后，细胞形态发生变化，细胞明显变大、变扁平，开始有管状排列现象，细胞与细胞之间互相融合，即成为肌管细胞，此时细胞内有数个细胞核象串珠样排列在细胞中央;免疫组化结果说明诱导的外胚间充质干细胞表达骨骼肌细胞的标志Desmin;RT一PCR鉴定结果显示诱导的外胚间充质干细胞表达成肌细胞特异标志一Myod mRNA。而对照组细胞形态未出现变化，也无骨骼肌细胞标志表达。以上说明外胚间充质干细胞被DMSO诱导成为骨骼肌细胞。2.3诱导领突外胚间充质干细胞向成骨细胞分化 第四军医大学博士学位论文 利用矿化液诱导外胚间充质干细胞分
张光东, 金岩, 史俊南, 邓蔓菁, 聂鑫[3]2003年在《胰岛素样生长因子1诱导外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化》文中研究说明目的 :探讨SD大鼠颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的分化机制。方法 :在建立SD大鼠颌突外胚间充质细胞体外培养模型的基础上 ,用胰岛素样生长因子 1(IGF - 1)刺激外胚间充质细胞 ,采用倒置显微镜和免疫组化等方法从形态学和功能方面检测细胞的变化。结果 :在不含LIF的培养液中加入 10 0ng/mLIGF - 1培养的外胚间充质细胞 ,10d后在倒置显微镜下可见一些细胞出现单一细胞浆突起 ,似成牙本质细胞。消化后爬片经免疫组化抗DSP染色 ,部分细胞胞浆呈强阳性着色。结论 :IGF - 1可部分地诱导外胚间充质细胞向功能性成牙本质细胞分化 ,可能是牙齿发育过程中的重要细胞因子之一
聂鑫[4]2004年在《外胚间充质干细胞的多向分化及在组织工程周围神经再生中的应用》文中研究表明在胚胎发育的早期，神经管闭合前，颅神经嵴干细胞向腹外侧迁移到达颌突的中胚层以后，就被称为“外胚间充质干细胞”。起源于颅神经嵴的外胚间充质干细胞(ecto-mesenchymal stem cell, EMSC)是胚胎颌面发育过程中的暂时性结构，具有自我更新和多向分化的潜能，在颌面部的发育过程中可分化为骨源性细胞、软骨源性细胞、神经源性细胞、肌源性细胞等，并将形成上下颌骨、颞下颌关节软骨、肌肉、神经、牙等组织器官。但在体外实验中，很少涉及到外胚间充质干细胞的纯化、培养及多系谱分化，此外组织发育过程中，启动并刺激细胞分化的关于细胞-生长因子、细胞-胞外基质、生长因子-胞外基质的相互作用仍未阐明。以前吕红兵等对外胚间充质干细胞的前体细胞一颅神经嵴干细胞的研究显示GGF、TGF-βs、BMPs等生长因子在体外可影响神经嵴干细胞的最终分化。其中BMP-2／4可诱导其分化为神经元，GGF可诱导其分化为雪旺细胞，TGF-β1、2、3可诱导其分化为平滑肌细胞。邓蔓菁、张光东等也对外胚间充质干细胞的特性进行了初步研究。此外，另一种间充质干细胞-骨髓间充质干细胞也已证实可横向从一种组织分化为另一种组织，这些研究充分证实了外胚间充质干细胞的分化潜能的可行性，也为干细胞用于疾病治疗的潜在应用提供了理论基础。 组织工程产品涉及生物材料、种子细胞及生长因子。其中种子细胞的老化及来源问题一直困扰着组织工程产品的临床应用。干细胞拥有自我更新和增殖旺盛的特点，可为组织工程种子细胞 第四军医人学博卜学位论文提供新的来源。本课题的目的在于检测外胚间充质干细胞是否具有多向分化潜能，阐明细胞分化过程中不同生长因子及相关基因的作用机理及方式。同时对干细胞在组织工程神经在修复坐骨神经缺损的应用作一简单研究。本实验共分为3部分:第一部分:未分化外胚间充质干细胞的获取及生物学特性 通过酶消化法初步获取未分化EMSCS，利用不同细胞对消化的耐受性及干细胞的特性进行进一步纯化。免疫组化鉴定HNK一l阳性，表明细胞来源于神经峭:NSE，S一100阳性，表明细胞仍具有神经系统的某些特性;VIM阳性，表明细胞来源于外胚间充质;GFAP、、NF、CK表达阴性从而排除了其他来源细胞的污染。EMSCS可通过LIF抑制自然分化的特性，而bFGF能促进细胞的增殖活性。这些结果有利于我们对EMSCS作进一步研究。第二部分:外胚间充质干细胞的多向分化潜能分析 在自然条件下，EMSCs可向平滑肌细胞分化，而利用分化抑制因子LIF可抑制的自然分化趋势，加入TGF一p可促进细胞的分化趋势，在TGF一p、IGF、维生素C、地塞米松软骨培养液中，EMSCS可被诱导分化为软骨样细胞;加入二甲基亚矾可促进细胞向成肌细胞的转化，出现肌肉相关蛋白myoD、myogenin、myosin的表达，用于动物实验可见成肌样结构出现。我们利用大鼠面神经核团通过RT一PCR方法获取TC 1 ocDNA，利用pcDNA3.1构建了真核表达载体，通过对EMSCS的转染，细胞出现神经元样变化，开始表达NF和nestin。此外，我们利用BPE及forskolin使细胞转化为神经胶质样细胞，并出现GFAP的表达。所有这些结果都证实EMSCs是一种具有自我更新能力，并可向其他细胞类型分化的特殊干细胞。 第四军医大学博}学位论文第叁部分:外胚间充质干细胞的多向分化诱导 将牛去细胞基质(BAM)、向神经胶质样细胞分化的EMSCs按一定的比例混合，注入PLGA神经导管形成凝胶。构建组织工程神经桥接大鼠坐骨神经缺损，四个月后通过免疫组化、电生理、透射电镜等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况。结果显示神经已完全连接，疗效好于对照组，表明以外胚间充质干细胞为种子细胞的组织工程神经对修复神经缺损有较好的疗效。MBP及GAP一43的免疫组化染色证实组织工程神经修复机理与正常神经的缺损修复相似。结果表明我们构建的组织工程神经是神经缺损修复过程中较好的替代品。 综上所述，EMSCS可根据不同要求分化为不同类型的细胞，这为寻求新的组织工程产品的种子细胞来源奠定了理论基础。
参考文献：
[1]. 大鼠颌突外胚间充质干细胞向成牙本质细胞样细胞的定向诱导分化[D]. 张光东. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 颌突外胚间充质干细胞的可塑性研究[D]. 周泽渊. 第四军医大学. 2004
[3]. 胰岛素样生长因子1诱导外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化[J]. 张光东, 金岩, 史俊南, 邓蔓菁, 聂鑫. 牙体牙髓牙周病学杂志. 2003
[4]. 外胚间充质干细胞的多向分化及在组织工程周围神经再生中的应用[D]. 聂鑫. 第四军医大学. 2004