1．湖南省长沙市第一医院内分泌代谢科 湖南长沙 410005；
2.湖南省长沙市中南大学湘雅医院内分泌代谢科 湖南长沙 410008
【摘 要】目的 本研究旨在明确：1、抑制神经酰胺的合成是否能改善糖尿病大鼠肾脏病理病变。2、抑制神经酰胺的合成是否能减少肾脏Ⅳ型胶原蛋白的表达。方法 将雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分成正常对照组（NC group）（n=15）与糖尿病模型组（DM group）（n=45）。正常组给予普通饲料喂养，糖尿病模型组给予高脂高糖饮食（66.5%普通饲料、2.5%胆固醇、10%炼猪油、20%蔗糖、1%胆酸盐）喂养。喂养4周后，糖尿病模型组开始予以腹腔注射小剂量链脲霉素（STZ）30mg/kg破坏部分胰岛β细胞，建立2型糖尿病模型。造模成功后将模型组随机分成：myriocin干预的DM组（MTD group）（n=15），DM对照组（DMC group）（n=15）。MTD组予以myriocin 0.3mg/kg Qod腹腔注射干预，DMC组及NC组予以等量溶媒腹腔注射干预。12周后，采所有大鼠空腹全血并麻醉处死所有大鼠，立即分离肾脏组织，保存于-80℃低温冰箱。分别用光镜（HE染色、PAS染色）、电镜观察肾脏病理改变及肾小球硬化指数比较，Western-blot检测肾脏Ⅳ型胶原蛋白。结果 1、与NC组比较，DMC组、MTD组肾脏病理改变明显、肾小球硬化指数明显升高（P<0.01），但MTD组低于DMC组（P<0.05）。2、与NC组比较，DMC组、MTD组肾脏Ⅳ型胶原蛋白表达明显升高（P<0.01），MTD组低于DMC组（P<0.05）。结论 1、2型糖尿病大鼠模型肾小球硬化指数增高，肾脏病理改变明显（ColⅣ表达增加）；腹腔注射神经酰胺从头合成途径抑制剂myriocin干预2型糖尿病大鼠模型，肾小球硬化指数、肾脏病理均得以改善。2、2型糖尿病大鼠模型中，神经酰胺积聚能上调肾脏ColⅣ的表达，而使用神经酰胺从头合成途径抑制剂myriocin能下调肾脏ColⅣ的表达，提示神经酰胺参与了肾脏ColⅣ表达的调节。
【关键词】 神经酰胺；糖尿病肾病；组织病理；Ⅳ型胶原蛋白
随着经济社会的发展、生活水平的改善、饮食习惯的改变、人口老龄化等原因，我国糖尿病的发病率逐年增高。持续的慢性高血糖逐渐引发心脑血管、眼底、肾脏和神经系统等急慢性并发症，而糖尿病肾病是糖尿病最严重和最常见的慢性并发症之一，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因。近年来人们对神经酰胺及其代谢产物在糖尿病肾病发生发展中的作用做了部分研究，证实神经酰胺及其代谢产物是糖尿病肾病发生发展的重要原因。Myriocin是一种真菌霉素，能特异性抑制神经酰胺从头合成途径中关键酶SPT，大量的在体及体外实验均证实了其能有效的抑制神经酰胺的合成。本研究通过高糖高脂饮食喂养联合小剂量STZ腹腔注射建立2型糖尿病模型。应用光镜（HE染色、PAS染色）、电镜观察肾脏病理改变及肾小球硬化指数，使用Western-blot检测肾脏Ⅳ型胶原蛋白。
一、材料和方法
1.材料：（1）动物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分成正常对照组（n=15）与糖尿病模型组（n=45）。连续两次空腹血糖大于或等于7.0mmol/l和（或）餐后血糖大于或等于11.1mmol/l者定义为2型糖尿病大鼠。造模成功后将模型组大鼠随机分成：myriocin干预的DM组（MTD group）（n=15），DM对照组（DMC group）（n=15）。MTD组予以myriocin 0.3mg/kg QOD腹腔注射干预，DMC组、NC组予以等量生理盐水腹腔注射，共计12周。DMC组、MTD组大鼠继续高糖高脂饮食喂养，NC组普通饲料喂养。（2）试剂：链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、多球壳菌素（myriocin）均由美国sigma公司生产；糖原PAS过碘酸雪夫染色试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司；HE染色试剂盒购自Solarbio公司；Anti-Collagen Ⅳ antibody购自Abcam公司；兔抗GAPDH多克隆抗体购自杭州贤侄生物科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP、PVDF膜购自Millipore公司；蛋白Marker（10-250kDa）购自MultiSciences公司。
2.方法：（1）肾脏组织HE染色、糖原染色及电镜。（2）计算肾小球硬化指数：取糖原染色的切片，高倍显微镜下（×400）随机观察40个不重复的肾小球，对肾小球硬化程度进行半定量评分，共5级。计算公式：[（1×N1＋2×N2＋3×N3＋4×N4）/每张切片观察肾小球总数]×100%，N代表相应级别的肾小球个数。由2位观察者对每张切片进行盲法评分，取平均值。（3）Western blot分析肾脏Ⅳ型胶原蛋白的表达：用伯乐Image Lab分析软件对蛋白条带进行分析，蛋白的相对含量以目的蛋白与GAPDH条带光密度的比值表示，按计量资料进行统计分析。
3.统计学处理：用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，实验数据以±s（均数±标准差）表示。先对实验数据进行正态性检验以及方差齐性分析，如数据不成正态分布，先将其进行对数转换，呈正态分布后再进行统计分析。采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.各组大鼠肾脏组织病理学（光镜+电镜）改变：
光镜（×400）：NC组大鼠肾脏组织结构清晰，肾小球体积、肾小球囊腔间隙均正常，毛细血管袢形态规则，系膜细胞及基质正常，肾小管体积、形态均正常。DMC组、MTD组大鼠肾脏组织结构变形，肾小球体积、肾小球囊腔间隙增大，毛细血管袢形态不规则，系膜细胞增生，系膜基质增多，肾小管管腔增大，部分小管呈灶性萎缩、坏死空泡样变性，管腔内有大量管型蛋白，但DMC组大鼠肾脏病变要明显重于MTD组。系膜基质的变化在糖原染色中更为明显。（图2-1，图2-2）
电镜：NC组大鼠肾脏组织显微结构清晰，肾小球毛细血管基底膜厚度正常、均匀、光滑，足突结构清晰，系膜细胞、系膜基质正常。DMC组、MTD组大鼠肾脏组织显微结构紊乱，肾小球毛细血管基底膜节段性增厚并呈杵状、表面粗糙，足突结构不清、部分融合、部分消失，系膜区扩大，可见系膜细胞增生、系膜基质增多，但DMC组大鼠肾脏组织显微病变要明显重于MTD组。肾小球内无电子致密物沉积。（图2-3）
NC groupDMC groupMTD group
图2-3 各组大鼠肾脏电镜比较
2.各组大鼠肾小球硬化指数比较
对各组大鼠肾脏组织进行肾小球硬化指数（GSI）评估，我们发现：与正常组相比，DMC组及MTD组的肾小球硬化指数均显著增加（P<0.01），且DMC组高于MTD组（P<0.05）。（表2-1，图2-4）
图2-10 各组大鼠肾脏ColⅣ相对光密度值比较
注：*与NC组相比P<0.01，#与DMC组相比P<0.05。
三、讨论
神经酰胺作为神经鞘磷脂的基本单位，它不仅是细胞膜的组成成分，而且是鞘磷脂信号途径的中心分子，并在1994年脂质第二信使国际会议中被公认为脂质第二信使。总之，神经酰胺在多种细胞效应（如细胞分化、增殖、细胞周期停滞、衰老、凋亡、应激反应）中起重要调控作用，参与了炎症细胞因子的产生、营养过度、胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤、神经退化症、特异性皮炎、自身免疫性疾病等的发生、发展。本实验我们发现2型糖尿病大鼠体内血清神经酰胺水平明显升高，使用SPT特异性抑制剂myriocin能有效地抑制2型糖尿病大鼠体内神经酰胺的合成和积聚。
糖尿病肾病的发病制较复杂，其确切的发病机制至今尚未阐明，根据目前的研究可以归纳为以下几个方面：1、血流动力学改变，主要体现在肾小球血流动力学异常、肾素-血管紧张素系统激活、内皮素合成增加等三个方面；2、糖代谢紊乱，主要体现在持续慢性高血糖、蛋白非酶糖基化和大分子糖化终末产物增加、多元醇代谢途径异常等三个方面；3、脂代谢紊乱；4、炎症反应与细胞因子，主要体现在TGF-β、PDGF、IGF-1、VEGF32、IL及TNF-α等的表达及活性增加；5、氧化应激和蛋白激酶C的活化；6、遗传易感性。
目前，糖尿病肾病病理改变公认的中心环节是肾小球细胞外基质的积聚（早期以合成增加为主，晚期以降解减少为主），而细胞外基质主要由纤维连接蛋白、IV型胶原组成。在既往的研究中，持续的高血糖能导致肾脏局部活性因子（如AngⅡ、ET、TXA2及PDGF等）增多，它们通过PKC-β通路诱导TGF-β1水平升高，后者在转录和翻译水平上增加IV型胶原蛋白的表达，或后者使IV胶原蛋白发生非酶促糖基化致其降解减慢，最终结果导致肾小球细胞外基质合成增加。
综上所述，本研究结果证实，糖尿病模型大鼠血清中神经酰胺水平升高，肾脏IV型胶原蛋白表达明显增加；在使用myriocin干预糖尿病模型大鼠后，其血清中神经酰胺水平下降，肾脏Ⅳ型胶原蛋白表达明显下降。尽管既往研究很少有神经酰胺参与肾脏Ⅳ型胶原蛋白表达调节的报道，但我们的实验结果揭示了神经酰胺直接或间接的参与了肾脏Ⅳ型胶原蛋白表达调节，且myriocin能减少肾脏IV型胶原蛋白的表达。至于神经酰胺参与肾脏IV型胶原蛋白表达的确切机制有待进一步研究。
论文作者:陈少波1,雷闽湘2
论文发表刊物:《航空军医》2017年第7期
论文发表时间:2017/6/21
标签：肾脏论文; 肾小球论文; 大鼠论文; 酰胺论文; 神经论文; 糖尿病论文; 胶原蛋白论文; 《航空军医》2017年第7期论文;