侯伟健[1]2002年在《细胞外信号调节激酶与蛋白激酶C信号转导通路及即早基因表达在铅暴露小鼠记忆功能改变中的作用》文中认为一、慢性铅暴露小鼠脑组织蛋白激酶C活性变化及其与记忆行为改变的关系 前言 学习记忆是脑的高级功能，其物质基础是中枢神经系统高度的可塑性，包括神经网络、神经环路及突触连接等不同水平的可塑性。它既包括传递效能的变化，又包括形态结构的变化，二者的物质基础都涉及神经元和突触部位的某些蛋白质、受体、神经递质、离子及信使分子的物理化学变化。某些影响大脑学习记忆功能的毒物也是通过干扰中枢神经可塑性及信号转导过程而发挥其毒性作用的。 重金属铅是一种普遍存在的环境神经毒物，其对儿童的神经发育毒性已被许多研究所证实。铅具有很强的神经亲和性，可在神经组织中蓄积，引起神经系统功能(主要是学习记忆功能)的长期损害。目前铅神经毒作用机制研究中的一个重要内容就是探讨铅对中枢神经细胞信号转导过程中的两个重要因素—钙和蛋白激酶功能的影响。后者如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)等。 本研究以细胞信号转导途径为线索，分别探讨了PKC、ERK、NOS1等信号分子及即早基因(c-fos，c-jun)在慢性铅暴露小鼠脑细胞中的活性、蛋白表达及mRNA表达的改变，以及铅暴露小鼠记忆行为的变化，并将细胞中信号分子的改变与记忆功能改变结合进行分析以寻找一些内在规律。 蛋白激酶C是一种钙活化的、磷脂依赖性的丝氨酸／苏氨酸激酶。在调控细胞的许多生理过程，特别是在细胞内信息传递途径中，PKC起着一个关键的作用。目前，在铅的神经毒性研究过程中，铅对PKC的作用引起人们极大关注。这是因为铅比钙对 PKC有更高的亲和力。现已知，Ph卜可以取代Caz”激活蛋白激酶C。铅取代钙后可扰乱PKC的正常激活，导致PKC反应敏感性下降，扰乱PKC在学习记忆中的正常功能。本研究在第一部分中利用卜／中〕－A’fP体外磷酸化法进行脑组织胞浆和胞膜的PKC比活性测定，并进行了铅暴露小鼠记忆行为学测试。 实验材料 昆明小白鼠，由中国医科大学实验动物部提供；交配后，通过饮水饲喂不同浓度铅，产仔后按出生 l在上 5上2上0日龄取材； h／1－ATP购于北京亚辉生物工程公司； 鱼精蛋白（Protami＊）、抑蛋白酶肽（aProtinin）、胃酶抑素（PePStatin）、亮肽素OeupeptinX苯甲基磺酚氟沙MSF）等均购于Signa公司； 二硫苏糖醇（D TI’TI’入HE陀S工GTA等购于华美生物工程公司； Siglna 3 K30型高速低温高心机； Beckman ie3801型液体闪烁计数仪； 小鼠记忆测试（被动回避反应）明暗箱装置由沈阳医学院生理教研室制作。 实验方法 1．小鼠慢性铅暴露：通过饮水饲喂浓度为0．5上．4／．8＊．2J．6、14．4mmol／L的醋酸铅水溶液。对照组饲喂自来水。 2、利用一／刊一ATP体外标记磷酸化方法进行小鼠脑组织胞浆 PKC活性测定。 3、利用＊／印］－ATP体外标记磷酸化方法进行小鼠脑脑组织胞膜PKC活性测定。 4、利用小鼠被动回避实验（PAR）进行铅暴露小鼠记忆行为学检测。 ·2· 实验结果 不同浓度醋酸铅暴露的不同发育时段小鼠大脑细胞浆中PKC活性有不同程度的变化。l）铅暴露小鼠脑胞浆PKC活性与正常组相比可见一定的差异，多数组第15日问）为最高峰，低浓度染铅组在某些时段中PKC比活性高于正常组，而随着铅浓度的升高，这些时段的PKC活性逐渐降低，较高铅浓度组酶活性均低于正常组；InunoVL汐）组的 P22以后，比活性迅速升高，至P30时比对照组高出很多。2．4mmoUL铅暴露组的PKC比活性在＊ 至 P22则不但未见降低，反而继续升高m2至 ppo又继续升高，成为最高点。2）铅暴露小鼠脑细胞膜PKC活性总体上比胞浆低，PKC活性高峰时段在 P 2 2左右，胞膜 PKC活性随铅浓度的升高而升高。其中9．6nunoUL组升高最为明显。当铅浓度达到一定程度后，胞膜的PKC比活性又降低。3川鼠活体记忆行为D！！练测试可见，训练初期低浓度铅暴露组的记忆保持时间略高于正常组，而高浓度铅暴露组的记忆保持时间低于正常组。训练后期低浓度组与高浓度组记忆保持时间均低于正常组。 讨 论 正常对照组小鼠脑细胞浆 PKC活性在 PI至 PS期间增加较缓，而在 PS至n 段迅速增加，并达到高峰，从n 至P22段又明显降低n 为低谷，而后 P30又升高。 铅暴露鼠脑胞浆中PKC活性高峰也在P15左右，有些染铅组p．4pmol／L刀KC活性由于过度激活在P22和P30在段活性持续升高。不同浓度的铅对不同发育时段的PKC活性有不同程度的激活或抑制。低浓度铅可引起PKC的激活，而较高浓度暴露则引起PKC活性抑制。小鼠脑细胞膜 PKC活性以 P22为最高点，并且其活性随铅浓度升高而升高。 正常对照组小鼠在8！！练最初记忆保留时间缓慢增加，而随?
高双[2]2007年在《慢性染铅小鼠脑皮质及海马中PKCγ及ERK表达变化的研究》文中研究指明目的铅具有很强的神经亲和性，可在神经组织中蓄积，引起神经系统功能(主要是学习记忆功能)的长期损害。目前铅神经毒作用机制研究中的一个重要内容就是探讨铅对中枢神经细胞信号传导过程中的两个重要因素钙和蛋白激酶功能的影响。如蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein Kinase,ERK)。pb~(2+)可以取代Ca~(2+)激活蛋白激酶C，铅取代钙后可扰乱对PKC的正常激活，导致PKC反应敏感性下降，扰乱PKC在学习记忆中的正常功能。铅通过对PKC(蛋白激酶C)的异常激活或抑制而干扰LTP(长时程增强)的形成和维持，并影响发育期小鼠海马中PKC活性和PKC7同工酶的分布。ERK1／2在促进转录，LTP的生成及维持的过程中起到重要的作用。研究提示，铅可以通过影响神经递质的变化进而影响cAMP和CREB在长期记忆中的作用，并影响LTP的形成。铅浓度对发育期小鼠脑组织ERK表达的影响随铅浓度的增大而增大，ERK1／2的水平随铅浓度升高而逐渐降低，铅对ERK的影响在发育后期比发育前期影响大。已有实验证明，低浓度铅可引起PKC的异常激活；高浓度铅可引起PKC的异常抑制。但做为蛋白激酶C的一个亚型，PKC-γ在小鼠脑组织中的表达变化情况尚未清楚，有进一步进行研究的可行性。而通过细胞外信号调节激酶对慢性染铅小鼠脑皮质及海马表达异常的对比研究，更能进一步探讨铅的神经毒理作用机制。方法一、小鼠慢性铅暴露模型的建立昆明系小鼠由中国医科大学实验动物中心提供。按每笼雄：雌为1：2自然交配，随机分为四组，依次分为对照组和低、中、高剂量铅中毒组。从出生第一天起开始通过饮水饲以不同浓度醋酸铅水溶液。对照组饮用自来水。低、中、高剂量铅中毒组饮用含2.4、4．8、9.6mmol.L~(-1)醋酸铅水溶液。自第21天起，幼鼠开始自己饮用与其母鼠相同的饮用水。于出生后第1、7、14、21、28、35天解剖动物取出脑皮质和海马，至-70℃冰箱保存。二、测定指标及方法1、利用PKC-γ及ERK抗体，Western blot方法测定慢性染铅小鼠脑皮质中PKC-γ及ERK的异常表达。2、利用PKC-γ及ERK抗体，Western blot方法测定慢性染铅小鼠海马中PKC-γ及ERK的异常表达。3、标本处理，提取蛋白质，蛋白定量，电泳，电转移，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色。叁、统计分析处理用SPSS10.0软件对实验数据进行方差分析。结果1、慢性铅暴露对小鼠脑皮质区组织中ERK蛋白表达的影响正常对照组中ERK表达水平从7d开始表达水平升高，14d为最高，21d略低于14d水平，28d又迅速降低，接近1d水平或略低。各染铅组中不同发育时段小鼠脑中ERK表达在整体上比正常组稍低；各浓度组从7d至14d段变化趋势与正常组基本相似，而在21d和28d时段中可见明显的不同：2.4mmol／L组28d的ERK表达接近(略高)于正常组水平，4.8mmol／L组在21d和28d的ERK表达量最低，9.6mmol／L组在21d和28d的ERK表达量有所回升。从中可见低浓度铅2.4mmol／L使ERK表达升高，但此后随铅浓度升高ERK表达量逐渐降低，铅浓度升高至9.6mmol／L时随着铅浓度升高ERK表达量不再降低相反有所回升。2、慢性铅暴露对小鼠海马组织中ERK蛋白表达的影响趋势同上：正常对照组中ERK表达水平从7d开始表达水平升高，14d为最高，21d略低于14d水平，28d又迅速降低，接近1d水平或略低。各染铅组中不同发育时段小鼠脑中ERK表达在整体上比正常组稍低；各浓度组从7d至14d段变化趋势与正常组基本相似，而在21d和28d时段中可见明显的不同：2.4mmol／L组28d的ERK表达接近(略高)于正常组水平，4.8mmol／L组在21d和28d的ERK表达量最低，9.6mmol／L组在21d和28d的ERK表达量有所回升。从中可见低浓度铅2.4mmol／L使ERK表达升高，但此后随铅浓度升高ERK表达量逐渐降低，铅浓度升高至9.6mmol／L时随着铅浓度升高ERK表达量不再降低相反有所回升。3、慢性铅暴露对小鼠脑皮质区组织中PKC-γ蛋白表达的影响不同浓度醋酸铅暴露的不同发育时段小鼠脑皮质中PKC-γ表达有不同程度的变化。正常组小鼠脑皮质中PKC-γ表达在发育后期逐渐升高，至第14日后迅速升高，第21日达到高峰，随后又迅速降低，至第35日时达到与出生相近的水平或更低。铅暴露小鼠脑皮质中PKC-γ表达波动与正常组基本相似，但差异较明显。多数组第21日(21d)为最高峰，随着铅浓度的升高，这些时段的PKC-γ表达逐渐降低，较高铅浓度组酶表达均低于正常组；而28d-35d时段均低于正常组。4、慢性铅暴露对小鼠海马组织中PKC-γ蛋白表达的影响趋势同上：不同浓度醋酸铅暴露的不同发育时段小鼠脑皮质中PKC-γ表达有不同程度的变化。正常组小鼠脑皮质中PKC-γ表达在发育后期逐渐升高，至第14日后迅速升高，第21日达到高峰，随后又迅速降低，至第35日时达到与出生相近的水平或更低。铅暴露小鼠脑皮质中PKC-γ表达波动与正常组基本相似，但差异较明显。多数组第21日(21d)为最高峰，随着铅浓度的升高，这些时段的PKC-γ表达逐渐降低，较高铅浓度组酶表达均低于正常组；而28d-35d时段均低于正常组。结论1、随着铅浓度的升高，PKC-γ表达量降低。2、铅暴露对发育期小鼠脑中ERK表达水平有明显的影响，尤其是在21d段。低浓度铅接触引起ERK1／2水平升高，高浓度铅引起ERK1／2水平降低。更高浓度的铅不能使ERK持续降低，相反略有回升。3、高浓度铅引起小鼠脑中ERK1／2和PKC-γ表达水平的变化趋势具有一致性。
叶伟峰[3]2012年在《铅暴露大鼠脑区钙离子/钙调素关联信号通路及药物调控研究》文中提出我国目前铅污染程度非常严峻,铅是一种重金属元素,是目前最常见的工业及环境毒物,可在环境中长期蓄积,对环境甚至食品造成污染,构成对人类长期的危害。铅对人体却没有任何生理功能,铅会通过血脑屏障(blood-brain barrierBBB)进入脑神经组织,导致营养物质和氧气供应不足发挥神经毒性作用。另外,儿童作为特殊群体,相比成人对铅的神经毒性更为敏感,已经证实铅具有很强的神经发育毒性,铅暴露的年龄越小,对铅神经毒性的易感性越高。铅易透过胎盘屏障及通过乳汁分泌,胎儿及婴幼儿对铅的神经毒性更易敏感。铅无安全临界水平,铅对神经系统损害可发生在现有临床血铅浓度检测标准以下,并且儿童发育早期铅暴露所产生的智力损害可持续到成年阶段。目前,针对铅暴露现临床主要以预防为主,治疗为辅,尚缺乏有效药物能够解决铅神经毒性的影响。为治疗铅引起的神经毒性损伤,深入研究铅神经毒性分子机制是非常必要的。目前铅神经毒性分子机制研究中一个重要的内容就是探讨铅对中枢神经系统(central nervous system, CNS)信号途径传导过程中钙离子(calcium,Ca2+)和蛋白激酶功能的影响。铅通过影响细胞内Ca2+正常流动,干扰神经细胞膜对Ca2+的摄取和释放,扰乱细胞内Ca2+稳态而发挥毒性作用。铅也可取代Ca2+与钙调素(calmodulin, CaM)结合或直接与CaM结合,使之改变构型,并可结合及激活其依赖性酶与载体在内的调节蛋白,干扰神经细胞的功能。但是Ca2+/CaM依存的信号途径介导铅神经毒性的复杂分子机制尚不完全清楚,因此进一步深入研究铅对神经系统Ca2+/CaM依赖性信号分子表达的影响对了解铅介导神经毒性分子机制具有重要意义。大量研究表明,铅可诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生,使细胞的氧化还原状态发生改变,促使细胞和组织产生自由基,引起自由基生成增多,氧化损伤在铅毒性机制中发挥着重要作用。另外已经了解到,当组织细胞受到损伤或Ca2+稳态失衡时,细胞内自噬溶酶体(autolysosome)会激活,从而可以保护细胞免受细胞内毒物的损伤,但是过多的细胞自噬(autophagy)也会引起细胞过量损伤而发生程序性死亡。有报道铅暴露会导致附睾上皮细胞自噬增加,但铅暴露时是否会对神经细胞自噬水平产生影响未见有研究报道,自噬溶酶体信号转导途径是否参与铅神经毒性过程尚不清楚。本研究通过建立大鼠急性铅暴露模型,测定大鼠血铅浓度和脑组织铅含量,检测脑海马腹-背轴Ca2+/CaM依赖性信号分子的表达；建立大鼠慢性铅暴露模型及进行药物处理,检测断乳期仔鼠及药物处理后子代大鼠的血铅浓度和脑组织铅含量,并检测子代大鼠学习记忆能力,然后检测脑区Ca2+/CaM依赖性信号分子与自噬相关蛋白的表达,通过探讨以期发现其中的内在联系,为铅暴露神经毒性分子机制研究及创新药物治疗靶点提供重要线索。对于慢性铅暴露模型,我们使用具有清除自由基抗氧化作用的钙调素抑制剂美拉托宁(melatonin)对子代大鼠进行维期60天的调控干预,以期为临床治疗铅神经毒性提供相关研究依据。第一章急性铅暴露大鼠海马腹-背轴钙离子／钙调素依赖性信号分子表达研究目的：研究铅暴露下腹侧海马与背侧海马是否存在不同的神经生物化学改变。方法：建立大鼠急性铅暴露模型,Sprague Dawley (SD)大鼠随机分成3组,2个铅处理组(Low lead-exposed group、High lead-exposed group)每天分别腹腔注射25mg/kg和50mg/kg的醋酸铅,对照组(Control group)采用蒸馏水,持续5天。然后收集血样与脑组织样本,用石墨炉原子吸收分光光度法测定血铅浓度与脑组织铅含量,通过western blot(?)去检测背侧海马(doral hippocampus)和腹侧海马(ventral hippocampus) Ca2+/CaM依赖性蛋白的表达,包括钙蛋白酶(calpain)的特殊底物血影蛋白(spectrin),钙调磷酸酶(calcineurin),磷酸化钙离子／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, p-CaMKⅡ)和神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS).另外,通过免疫组织化学法检测了腹侧海马calcineurin的表达。结果：经过5天的急性铅暴露,血铅浓度与脑组织铅含量均显着性升高(P<0.01),其中海马铅含量高于其它脑区铅含量。我们在腹侧海马观察到了calcineurin的结构活性形式(45kDa和48kDa),同时也观察到了calpain激活引起spectrin降解的作用。我们的研究数据显示,在急性铅暴露后,nNOS在腹侧海马的表达显着地高于背侧海马(p<0.05),同时,相对于背侧海马而言,p-CaMKⅡ (Thr286)水平在腹侧海马表达显着降低(P<0.05)。结论：现有数据表明急性铅暴露会导致海马腹-背轴Ca2+/CaM依赖性信号分子呈现不同的表达模式。本章研究结果提示,相比背侧海马来说,腹侧海马可能更易受到铅神经毒性的影响。第二章慢性铅暴露大鼠脑区钙离子／钙调素依赖性信号分子表达及药物调控研究目的：深入探索慢性铅暴露对大鼠脑区Ca2+/CaM依赖性信号分子表达及药物调控研究。方法：首先建立仔鼠慢性铅暴露模型,SD大鼠受孕后随机分成4组,对照组(Control)给予蒸馏水,3个处理组(L-lead. M-lead和H-lead)分别给予0.5g/L、1.0g/L和2.0g/L的醋酸铅饮用水。孕鼠自孕16天起自由饮用直至新生仔鼠21天断乳为止,仔鼠由母鼠喂养至断乳后与母鼠分笼饲养,并收集仔鼠血样与脑组织样以石墨炉原子吸收分光光度法进行测定,剩余仔鼠开始饮用与其母鼠相同含量的醋酸铅饮用水直至60天成熟期。然后基于仔鼠慢性铅暴露模型,构建5组慢性铅暴露模型与药物处理组,4个处理组(L-lead或L. L-lead+Melatonin或L+M、H-lead或H. H-lead+Melatonin或H+M)继续饮用原相同含量的醋酸铅饮用水,L+M组和H+M组每天灌胃美拉托宁溶液,剂量为5mg/kg,对照组(Control或C)继续给予蒸馏水,持续60天。以Morris水迷宫观测子代大鼠学习记忆能力的变化,并收集血样与脑组织样以石墨炉原子吸收分光光度法进行测定。用、western blot(?)去检测脑区Ca2+/CaM依赖性蛋白的表达,包括CaMKⅡ途径和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途径关联蛋白表达。结果：仔鼠慢性铅暴露模型中,21天铅暴露仔鼠血铅浓度与脑组织铅含量显着高于对照组(P<0.05)。慢性铅暴露模型与药物处理后,Morris水迷宫测定结果显示铅暴露组逃避潜伏期(escape latency)、目标象限停留时间(time in correct quadrant)及过台次数与对照组相比无显着性差异,药物处理组与铅暴露组相比亦无显着性差异；与同一天的对照组相比,第1天低剂量铅暴露组与对应的美拉托宁处理组、第2天低剂量铅暴露美拉托宁处理组短期记忆时间(short-term memory)显着增多(P<0.01),各天美拉托宁处理组与对应的铅暴露组相比无显着性差异。铅暴露组血铅、海马铅、皮层铅与纹状体铅含量均显着高于对照组(P<0.05),美拉托宁处理组血铅浓度、脑组织铅含量与对应的铅暴露组相比无显着性差异。随着铅暴露剂量的升高,我们观察到海马CaMKⅡ (Thr286位点)磷酸化活性减弱而p-Synapsin I (Ser603)和p-GluR1(Ser831)水平表达代偿性升高,此外,慢性铅暴露后海马p-ERK (Thr202/Tyr204)表达上调,海马PKC途径中NMDAR1表达增加,p-MARCKS (Ser152/156)表达减少,高剂量慢性铅暴露组海马p-NR1(Ser896)与MARCKS表达增加。美拉托宁处理后对高剂量慢性铅暴露海马p-GluRl (Ser831)、p-ERK (Thr202/Tyr204)、NMDAR1、p-MARCKS (Ser152/156)与MARCKS有一定的逆转调控作用。此外,慢性铅暴露组纹状体CaMKⅡ途径和PKC途径关联蛋白表达相对于对照组无显着的变化。结论：本章研究结果表明慢性铅暴露对大鼠短期学习记忆产生了影响,海马Ca2+/CaM依赖性信号分子系统的稳态失衡参与了铅神经毒性分子机制过程,本研究的实验周期及治疗疗程条件下,美拉托宁对高剂量慢性铅暴露大鼠海马p-GluR1(Ser831)、p-ERK (Thr202/Tyr204)、NMDAR1、p-MARCKS (Serl52/156)与MARCKS有一定的逆转调控作用。第叁章慢性铅暴露大鼠脑区自噬相关蛋白表达及药物调控研究目的：探索自噬溶酶体信号转导途径是否参与介导铅神经毒性分子机制过程及药物调控研究。方法：以第二章慢性铅暴露模型与药物处理所收集脑组织为研究对象,用western blot(?)去检测海马与皮层自噬相关蛋白的表达,具体包括Beclin1.微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3, LC3)、核孔蛋白(nucleoporin, p62).溶酶体相关膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein2, LAMP2)、组织蛋白酶B(cathepsin B)。结果：经过检测发现,相对于各自的对照组来说,在脑海马神经细胞低剂量铅暴露组Beclin1表达明显下调(P<0.05)；高剂量铅暴露组Beclin1表达明显上调(P<0.05),LC3有极显着上调(p<0.001),cathepsin B在38kDa处有明显下调(P<0.001),30kDa与25kDa处片段有下调趋势,但无显着性的差异。在脑皮层神经细胞,发现低剂量铅暴露组p62表达显着上调(p<0.05)；高剂量铅暴露组LC3、p62与LAMP2表达均有显着增加(P<0.05)。美拉托宁处理组与对应的铅暴露相比,各个自噬相关蛋白表达均无显着性差异。结论：本章研究结果表明慢性铅暴露可能会对神经细胞自噬水平产生影响,并且不同海马与皮层出现不同的自噬现象,不同剂量铅暴露出现不同的自噬现象,这些不同的自噬现象反映了脑区对铅神经毒性代偿与失代偿的不同反应,我们推测自噬溶酶体信号转导途径可能参与介导了铅神经毒性分子机制过程。本研究的实验周期及治疗疗程条件下,美拉托宁未对慢性铅暴露海马与皮层脑区自噬水平起到调控作用。
参考文献：
[1]. 细胞外信号调节激酶与蛋白激酶C信号转导通路及即早基因表达在铅暴露小鼠记忆功能改变中的作用[D]. 侯伟健. 中国医科大学. 2002
[2]. 慢性染铅小鼠脑皮质及海马中PKCγ及ERK表达变化的研究[D]. 高双. 中国医科大学. 2007
[3]. 铅暴露大鼠脑区钙离子/钙调素关联信号通路及药物调控研究[D]. 叶伟峰. 浙江大学. 2012