南华大学药物药理研究所 衡阳湖南 421001
【摘 要】循环游离DNA（cfDNA）是指凋亡或坏死的细胞进入血管中所释放的DNA片段，主要存在于细胞外的环境中，呈游离状态。有学者研究发现特殊状态时，其循环游离DNA的含量明显高于正常人。当机体在这些状态并且血中游离DNA也具有肿瘤细胞DNA类似的特征，通过检测血液中游离DNA来反映某些疾病的状态成为一种有力的手段。这篇综述着重是论述循环游离DNA是一个强有力的诊断工具作为疾病诊断可靠的标志物。
【关键词】循环游离DNA；诊断；分子标志物；肿瘤
1.前言
游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA主要是由单链或双链DNA组成，以DNA-蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，主要存在于血浆或血清、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、尿液、滑膜液等体液中。
早在1948年Mendel和Metais等[1]首次报道在人的血中存在细胞外核苷酸，他们发现循环游离DNA存在健康人和患者的血浆中都能检测到，早期由于临床检查技术的局限性，相关临床应用才得到了长足的发展，1966年，Tan等[2]研究发现在系统性红斑狼疮患者的血清DNA含量比一般正常人要高，1973年Kofflev等[3]也在其它一些比如肝炎、胰腺炎等病人血清中检测到比较高浓度的DNA，之后在1977年，Leon等[4]研究发现在胰腺癌患者中血液游离DNA水平过高，第一次证实了肿瘤患者的游离DNA水平明显高于正常人，1989年，Stroun等[5]根据游离DNA生物化学的特性对肿瘤患者血液进行深入研究，得出游离DNA很可能是来自于肿瘤细胞的结论。紧接着在1994年，Sorenson等[6]在胰腺癌患者的外周血DNA中检测到了K-ras基因的突变，由此可以证明，检测游离DNA的分子改变或许就可以反映出原发肿瘤的相应状态，肿瘤分子标记物的研究自此进入了一个崭新领域。大多数肿瘤因为缺乏有效的早期诊断手段，当被查出时癌症大多发生转移并发展到了中晚期，错过了最佳治疗时机而使癌症病人的存活率下降。游离DNA因为检测方便快捷，而且具非侵入性等特点，那么，随着肿瘤分子生物学的深入研究，血液中游离DNA结合各类分子生物学检测技术，有望成为具有一定敏感性及高特异性的肿瘤临床诊断方法。
2. 循环游离DNA在疾病诊断中应用
2.1 游离DNA在肿瘤突变中的检测 - 新一代肿瘤标志物
肿瘤组织是肿瘤DNA的主要来源，目前临床上主要通过侵入性检测，以获取肿瘤组织样本进行检测。这项操作对患者有一定风险，有时也无法采集到合适的样本，因此，人们一直努力在外周血中寻找新的肿瘤分子标志物，进而实现通过非侵入性的方式对肿瘤进行检测，肿瘤是体细胞突变疾病，这些突变仅存在肿瘤细胞中。肿瘤细胞死亡后将释放自身的DNA片段到血循环中，即循环肿瘤DNA（ctDNA）。多项研究显示，血液中的循环肿瘤DNA可以作为一类特异性的分子标志物用于肿瘤的检测和预后监测。检测游离 DNA 中肿瘤特异性的基因突变具有较好的临床价值，如 EGFR、KRAS和TP53 基因等这些在多种类型肿瘤中具有高突变频率的基因其检测对肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。如Sun H[7]等通过扩增PCR方法检测肺癌EGFR基因突变，其中非小细胞肺癌EGFR基因19外显子占总突变率的44%，是最常见的突变类型，以及21外显子上的L858R突变最为常见，占其总突变的41%，此外TP53基因在肺癌突变率中也高达45%，可用于判断肺癌基因分型发生的风险评估。在对30 例携带PIK3CA、TP53基因突变乳腺癌患者的循环肿瘤DNA水平进行分析后发现，循环肿瘤 DNA水平的变化与该患者的治疗及预后情况基本一致，也是说检测出肿瘤组织中游离DNA含量与其PIK3CA基因突变存在一致的改变。在结直肠癌发生转移的患者中也对cfDNA水平进行了分析，通过ctDNA可以检测到具有临床意义的KRAS基因突变，检出率为87.2%，特异性达到了99.2%[8]，循环游离DNA 的浓度也相应升高，且发现浓度升高与基因突变检出率呈正相关。在非霍奇金淋巴瘤患者血浆中，检测到免疫球蛋白重链序列的重排，类似微卫星不稳定，在实体肿瘤中经常发现的这个特征，首次在小细胞肺癌患者血浆和头颈癌患者血清中检测发现，灵敏度检测微卫星改变也是有限的。在KANYAMA等对胃癌患者的研究中，血清P16过甲基化水平明显高于对照组，与相应的实体肿瘤检测结果一致：但是并没有检测到与肿瘤组织类型，疾病分期及是否转移是否相关。在启动子区CpG岛甲基化在抑癌基因的甲基化改变，经常在多种肿瘤中被发现，甲基化基因突变有：P16、DAPK、GSTPI基因等，采用甲基化特异性PCR（MSP）被证明是一个诊断肺癌的工具，由于可以在许多肿瘤检测到这种异常的状态，决定了这是一种具有较高敏感性，而特异性欠缺的检测方法。因此，各种基因杂合性缺失和甲基化异常直接测定血液中游离DNA并研究肿瘤的相关性是相对不足的。因此针对循环游离 DNA 突变的检测，需要突变位点在肿瘤具有以下特点：发生频率高并具有肿瘤特异性，还应考虑到正常细胞所释放的DNA造成的干扰，现多数研究表明，肿瘤患者外周血液DNA 水平不仅明显高于正常人，且血液游离 DNA具有肿瘤组织细胞DNA一致的基因改变类型，通过血液游离DNA基因突变的检测，可以对相应疾病进行预警，并有利于进一步对疾病进行分型评价肿瘤特异性循环游离DNA是一种很有前途的非侵入性诊断和预后工具。
2.2 血液游离DNA产前诊断中的应用
孕妇血液中存在来源于胎盘滋养层凋亡细胞的胎儿游离DNA，通过检测孕妇血浆中的游离DNA即可安全准确地预测胎儿是否具有患染色体非整倍体疾病的风险。循环游离DNA母血筛查，作为一种无创性产前血液测试方法。起源于七十年代，科学家发现女性在怀孕期间，胎儿的DNA游离基因片段通过血液进入到母体，怀孕周数越高，母体血液中所含的胎儿游离基因片段也越多，在怀孕7周胎时，胎儿游离的基因片段达到最高值。先于早期最为广泛的产前诊断技术有羊膜腔穿刺，绒毛膜活检或脐血穿刺等等侵入性的方法，这可能更大程度的引起宫内感染流产或炎症等，这些侵入性的方法导致流产的风险占0.5%-2%[9]。Porreco等[10]通过母体游离DNA检测胎儿染色体非整倍体疾病（如21-三体，18-三体和13-三体），由于可以直接检测到胎儿的染色体，与传统的生物标记物相比，检出率有很大幅度的提高，准确率已经可以达到99%，而假阳性率低于1%。因此无创新的产前诊断方法已成为临床研究的新趋势。1997年，LO等[11]用PCR技术扩增出孕妇外周血Y染色体特异序列，首次证明孕妇外周血浆中存在游离DNA，性别诊断正确率有80%，具有高敏感性和特异性，这是发展相对比较成熟的技术。Sciellour等[12]对产前RhD血型进行研究RhD阴性的孕妇在产前对胎儿游离DNA RhD上的第7和第10外显子都进行扩增，然后分析胎儿的 RhD血型，待孕妇生产之后又对初生婴儿的RhD血型进行鉴定，这种方法运用在RhD型中准确率超过99%，结果显示二者完全一致，这说明了母体游离DNA的检测对胎儿 RhD 的血型鉴定是可靠的。最为大家熟知的是循环游离DNA无创产前检测（NIPT）是一项非常成熟的技术，已面向临床。
2.3 其它病理障碍
循环游离DNA的发生在其它病理性疾病中也得到了广泛的发展，有研究显示，在急性症状（如创伤、烧伤、心肌缺血、中风以及败血症等）中，血浆游离DNA含量有所升高，未来对慢性疾病如神经系统疾病的检测也将成为可能，同时也有助于揭示疾病的发病机制。对于外伤的患者的研究发现其体内的血浆游离循环DNA的浓度在受伤一小时内会上升，同时循环DNA浓度与受伤的程度有关，血浆中循环DNA水平的高低还与创伤的程度和感染性疾病的严重程度相关，高水平的循环DNA预示着临床的高病死率，对于治疗中的患者的循环DNA的检测可以预测其在器官衰竭、急性肺损伤、急性呼吸综合征以及死亡方面的情况。AKirav等采用PCR的方法扩增糖尿病患者体内β-细胞甲基化基因和胰岛素基因，发现与正常人相比，糖尿病患者血清中的循环DNA明显升高。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆对循环DNA的检测也有效地应用在对器官移植排斥的检测中，对捐献者特异循环DNA的检测可以有效地预测肾移植排斥情况。由此可见，许多疾病的发生可造成体内循环DNA浓度的升高，其产生机制及与肿瘤的发生是否有一定相关性还有待进一步研究。另外如果将检测外周血DNA水平应用于诊断恶性肿瘤，也应该首先排除各类急慢性炎症和自身免疫性疾病的可能。
3. 循环游离DNA释放机制
尽管有研究表明外周血循环脱氧核糖核酸的含量是肿瘤患者高于健康人群，但循环游离DNA的实际起源仍然是个谜。在健康人体，循环游离DNA进入通过淋巴细胞和其它核细胞凋亡，坏死和主动分泌DNA有关，因此血液中游离浓度很低。在肿瘤患者中，巨噬细胞不能有效清除凋亡和坏死细胞，Gormally等[13]采用1%琼脂糖凝胶对正常对照组和肝癌患者的游离DNA进行电泳时，从肝癌患者标本的DNA看到了明显的凋亡DNA的条带，由此表明，循环游离DNA往往代表着梯状电泳模式是相似的，表明细胞是处于凋亡的，可能失去了细胞增殖的能力。关于肿瘤患者循环肿瘤细胞DNA的来源及其发生机制有以下3种观点：（1）实体肿瘤细胞在生长过程中能持续自发释放肿瘤细胞DNA进入外周血液，成为循环血DNA的主要来源；（2）循环中肿瘤细胞或微转移灶的裂解；（3）肿瘤细胞的坏死或凋亡。通过对胃肠肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈肿瘤、泌尿系统肿瘤、妇科肿瘤和皮肤癌等多种肿瘤的研究，游离循环肿瘤细胞DNA的检测被认为是一个潜在的肿瘤早期诊断和预后判断的有力手段。
4.前景展望
循环游离DNA无创检测具有样本采集无创伤性，简便易行，稳定性好等优点，使其成为循环肿瘤检测的良好标志物，人们研究肿瘤患者血液游离DNA，最终目的是找到一个简便而有行之有效，经济而又不痛苦的检测方法。自从循环游离DNA被发现，该领域在不断的发展，对循环游离DNA 研究方法上需不断的改进，随着分子生物学的深入研究，血液中游离DNA结合各类分子生物学检测技术，有望成为具有一定敏感性及高特异性的临床疾病的诊断方法，使其具有广泛的临床应用前景。
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作者简介：
彭华，1991年出生，在读硕士研究生，研究方向：分子药理学。
所在单位：南华大学药物药理研究所，湖南省衡阳市常胜西路28号，邮编421001 李冬友，硕士研究生，副主任医师，湖南省郴州市东华医院 湖南省 郴州市 邮编423000。
*通讯作者：郭紫芬 博士 硕士研究生导师 教授 南华大学药物药理研究所，湖南省衡阳市常胜西路邮编421001。
基金项目：国家自然科学基金（编号：81102516）
论文作者:彭华,李冬友,龚咏晴,周晶,张式一,郭紫芬
论文发表刊物:《航空军医》2016年第7期
论文发表时间:2016/6/22
标签：肿瘤论文; 患者论文; 细胞论文; 基因论文; 突变论文; 血液论文; 特异性论文; 《航空军医》2016年第7期论文;