应用多种遗传标记甄别全同胞和半同胞关系1例
廖勇1，吴峰1，侯东林1，吴艳玲1，陶欢1，李成涛2，万华靖1
（1.四川基因格司法鉴定所，四川 成都 610041；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）
摘 要 ：目的 通过对1例全同胞关系存疑案例的鉴定，探讨多种遗传标记的综合使用在甄别同胞关系中的应用。方法 提取4名受检者（张1、张2，男性；张3、张4，女性）血痕DNA，使用EX20 STR试剂盒扩增检验常染色体基因座，X19试剂盒扩增检验X-STR基因座，Data Y24 STR试剂盒扩增检验Y-STR基因座，一代测序技术分析线粒体DNA高变区Ⅰ和Ⅱ的SNP多态性。 结果 基于常染色体STR基因分型的IBS评分结果提示：张2、张3、张4之间存在全同胞关系，无法判断张1与张2、张3、张4之间的全同胞关系；基于常染色体STR基因分型的ITO法、判别函数法计算结果，支持张2、张3、张4之间存在全同胞关系，提示张1与张2、张3、张4存在半同胞关系；依据X-STR基因分型和线粒体DNA高变区检测结果，提示张1、张2、张3、张4为同一生母，同时Y-STR基因分型结果排除张1与张2为同一生父，进一步支持张1与张2、张3、张4为同母异父半同胞关系，并得到根据常染色体STR基因分型结果重建父母基因型的验证。结论 对于同胞关系鉴定，需要综合应用各种遗传标记（包括常染色体STR、性染色体STR、线粒体DNA序列等），综合使用各种分析方法（包括IBS评分、ITO法、判别函数法和家系重建等），互相验证和支持，才能获得可靠的鉴定意见。关键词：法医遗传学；遗传标记；同胞关系；短串联重复；Y-STR；DNA，线粒体
同胞关系鉴定是法医物证学亲缘关系鉴定中的难点，特别是在全同胞鉴定案例中，在当事人隐瞒等原因造成存在半同胞关系而鉴定人不知情的情况下，会干扰甚至造成错误鉴定意见，让鉴定机构和鉴定人承担较高风险。
目前，同胞关系鉴定使用的遗传标记包括常染色体短串联重复（short tandem repeat，STR）序列基因座、性染色体STR基因座和线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高变区（hypervariable region，HVR）序列，判别方法主要包括基于常染色体STR基因座分型结果的状态一致性评分法（identity by state，IBS）[1]、ITO法、判别函数法[2-3]及家系重建[4]等。2014年，我国司法部司法鉴定管理局针对全同胞关系鉴定颁布了《生物学全同胞关系鉴定实施规范》（以下简称《规范》）[1]，按照《规范》，全同胞鉴定采用的标准遗传标记是常染色体STR基因座（必要时补充性染色体STR基因座、mtDNA高变区序列分析），判别方法为IBS评分法，该方法简单、直观、准确率较高并容易掌握，但该《规范》使用的适用范围是甄别全同胞与无关个体关系。在实际检案中，由于当事人隐瞒、不知情等原因造成误将半同胞关系当作全同胞关系来鉴定，会造成较高鉴定风险。
笔者在实际工作中受理了一起存疑全同胞鉴定案例，综合应用了多种遗传标记（常染色体STR基因座、性染色体STR基因座以及mtDNA HVR序列）、多种判断标准（基于常染色体STR的IBS法、ITO法、判别函数法及家系重建），最终获得了可靠的鉴定意见，现报道如下。
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1 对象与方法
1.1 对象
据委托方自诉，张氏四兄妹是同父同母全同胞兄妹，父母去世，现需要上户口，特委托四川基因格司法鉴定所对张氏四兄妹之间是否存在全同胞关系进行检验和鉴定。
为支持张1与张2、张3、张4之间半同胞关系，并进一步分析是同母异父还是同父异母关系，对张氏四兄妹样本进行X-STR和Y-STR基因分型以及mtDNA HVR-Ⅰ和HVR-Ⅱ测序分析。
1.2 方法
X-STR基因分型结果（表5）显示：张3、张4在每个基因座上均能找到一个相同的分型（来自相同生父），结合张2基因型（来自相同生母），可推断出全同胞张2、张3、张4的生父母基因型（表6），并且张1基因型均能从推断的生母基因型中找到来源（表6），由此提示张氏四兄妹来自同一生母。
全同胞指数（full sibling index，FSI）、半同胞指数（half sibling index，HSI）及同胞关系判定参照文献[2-3]采用ITO法计算，15个基因座同胞关系判定标准：（1）FSI和 HSI均＜1为无关个体；（2）FSI∶HSI≥1为全同胞关系；（3）FSI∶HSI＜1为半同胞关系。
张氏四兄妹血痕的D3S1358 等19个常染色体STR基因分型结果见表1。
判别函数法计算及同胞关系判定参照文献[3]进行，将15个基因座上等位基因全不同的基因座数、全相同的基因座数，代入全同胞-半同胞鉴别函数公式，得到全同胞D 值（D FS4）、半同胞D 值（D HS4），按以下标准进行判定：（1）D FS4＞D HS4为全同胞关系；（2）D FS4＜D HS4为半同胞关系。
mtDNA HVR-Ⅰ和HVR-Ⅱ测序结果显示，张1、张2、张3、张4 mtDNA与标准序列（Anderson序列）相比，在HV-Ⅰ（16024～16415nt）、HV-Ⅱ（73～340nt）碱基片段发生变异的序列一致（16129SG-A，16183SAC，16189ST-C，16193IC，16217ST-C，16234SC-T，263SA-G，306ICCC，315IC）。mtDNA属于母系遗传标记，可用来进行母系亲缘认定，根据遗传学原理和遗传规律，同一母系个体的mtDNA来自相同的母系祖先，结合X-STR分型结果，支持张1、张2、张3、张4来自同一生母。
随着现如今计算机技术及图像处理技术的不断创新，CT设备已经由第一代逐渐更新至第四代，运用于临床身体健康检查中起到愈发重要的作用。但是随着CT的飞速发展，逐渐增加借助CT检查身体各部位的人，所致受到CT检查带来电离辐射群体的总量，以及担任年平均辐射剂量也呈逐年递增趋势。经临床有关研究学者评判，医疗CT诊断产生电离辐射的危害，将作为未来对公众健康造成影响的关键问题之一[1]。因此近些年临床加大对CT辐射防护方法的研究关注度，笔者将近些年临床有关CT辐射防护方法研究，现综述如下。
2 结 果
2.1 常染色体STR基因座分型结果分析
The photocatalytic degradation of MB dye solution under visible light irradiation in the presence and absence of scavengers is shown in Fig. 8. For all the conditions the experiment was done for 40 min.
表1 张氏四兄妹常染色体STR基因座分型结果
依据以上常染色体STR分型结果，参照《规范》[1]，对张氏四兄妹样本两两之间进行IBS评分，获得累积IBS值（表2）：张2、张3、张4之间倾向性认为是全同胞关系，张1与张2、张3、张4之间全同胞关系无法给出倾向性意见。
表2 张氏四兄妹IBS评分
至此，多种遗传标记（常染色体STR、性染色体STR、线粒体DNA）检测结果相互验证和补充，综合分析后，支持以下鉴定意见：（1）支持张2、张3、张4两两之间存在全同胞关系；（2）支持张1分别与张2、张3、张4之间为同母异父半同胞关系。
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为了验证张1与张2、张3、张4之间半同胞关系，采用判别函数法得到张氏四兄妹之间在D3S1358 等15个基因座上D FS4、D HS4：张2、张3、张4两两之间存在全同胞关系，这一结果再次得到支持；张1分别与张2、张3、张4之间存在半同胞关系，这一结果和ITO法相一致（表4）。
表3 张氏四兄妹FSI∶HSI比值
表4 张氏四兄妹D FS4、D HS4值
表5 张氏四兄妹X染色体STR基因座分型结果
2.2 性染色体STR基因座分型结果及mtDNA HVR测序分析
张氏四兄妹：张1（男）、张2（男）、张3（女）、张4（女），四人指尖血血痕（载体为滤纸片）。
按照《法庭科学DNA实验室检验规范》[5]提取上述检材的DNA，常染色体STR基因座分型采用EX20试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司），X染色体STR（X-STR）基因座分型采用X19试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司），Y染色体STR（Y-STR）基因座分型采用Data Y24试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）。对上述PCR产物，用Applied BiosystemsTM3730xl 基因分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行毛细管电泳和基因型分析。IBS评分及同胞关系判定依据《规范》[1]进行，19个必检基因座同胞关系判定标准：（1）IBS≥22，倾向性认为全同胞；（2）22＞IBS＞13，无法给出倾向性意见；（3）IBS≤13，倾向性认为无关个体。
无钾处理区枣树叶缘焦枯，叶子皱缩，叶缘和叶尖失绿，呈棕黄色或棕褐色干枯，发病症状从枝梢中部叶片开始，随病势发展向上、下扩展。钾在树体内以无机酸盐、有机酸盐、钾离子等形式存在，在光合作用中占重要地位，对碳水化合物的运转、储存，特别是淀粉的形成有重要作用；对蛋白质的合成也有一定促进作用；钾还可作为某些酶和辅酶的活化剂。本试验钾肥50%作基肥施入，剩余50%于盛花期追施。
表6 张2、张3、张4生父母X染色体STR基因型推断及与张1比对
mtDNA提取及HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列分析按照《法庭科学DNA实验室检验规范》[5]进行，PCR引物设计和扩增体系参照文献[6]，PCR产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
Y-STR基因分型结果显示，张1与张2在DYS3891 、DYS389Ⅱ 、DYS439 、DYS456 、DYS458 、DYS437 、DYS635 、DYS448 、DYS527a/b 、DYS447 、DYS19 、DYS392 、DYS522 、DYS393 、DYS390 、DYS385a/b 共18个Y染色体STR基因座上分型不一致。Y染色体为男性所特有，Y染色体STR是父系遗传标记之一，可用来进行父系亲缘认定，根据遗传规律，同一父系的男性Y染色体来自相同的父系祖先，因此排除张1与张2来自同一生父。
1.“属性层-结果层”产生7种正向影响关系。影响程度由大到小分别是服务价值对于功能性结果(0.86)、功能价值对于心理性结果(0.76)、服务价值对于心理结果(0.66)、功能价值对于功能性结果(0.65)、功能价值对于社会性结果(0.63)、服务设施价值对于社会性结果(0.57)、建筑与环境对于功能性结果(0.41)。
式(6)中:μ=B/T为频率变化率。当TB≫1时，信号能量主要集中在[-B/2，+B/2]，TB越大，其振幅谱越接近于矩形，可近似表示为
为进一步验证和明确张氏四兄妹之间的同胞关系，同样依据常染色体STR分型结果，得到张氏四兄妹之间在D3S1358 等15个基因座上的FSI、HSI值及FSI∶HSI值。结果（表3）提示：张2、张3、张4两两之间存在全同胞关系，这与IBS结果相一致；张1与张2、张3、张4之间可能存在半同胞关系，但是需要进一步佐证。
根据此鉴定意见，通过常染色体STR结果推断张2、张3、张4父母基因型，并与张1比对验证。结果显示，推断的张2、张3、张4父母基因型均符合遗传规律（单个基因座不超过4个基因型）；从推断的父母基因型中，在D3S1358 等16个基因座，张1基因型能找到来源，但在D13S317 、D8S1179 、D5S818 基因座只能找到一个等位基因来源，不符合同父同母遗传规律，支持张1与张2、张3、张4半同胞关系。
3 讨 论
同胞关系鉴定是亲权关系鉴定中检案量仅次于亲子鉴定的项目，但由于技术手段的有限性及实际工作的复杂性，一直是司法鉴定中的难点和研究热点。
《规范》中的IBS法是通过计算两个个体间常染色体STR共有等位基因数来判断全同胞关系，与ITO、判别函数法相比，无需使用等位基因频率数据，计算简单、直观、有效，准确率在99%以上[7]，已广泛用于全同胞关系鉴定[8]，但在使用时要注意两点：（1）适用范围。适用于在双亲皆无情形下甄别生物学全同胞与无关个体关系，若两名被鉴定人之间存在其他亲缘关系（如半同胞、堂表亲等），则本《规范》不适用。（2）系统效能。检测19、29、39个STR基因座时，系统效能分别约为75%、85%、95%；增加STR基因座虽然能提高系统效能，但是要求增加的STR基因座个体识别率（discrimination power，DP）值要大于0.9。笔者在实际鉴定工作中（包括本案例）遇到多起由于当事人隐瞒等原因，误将半同胞作为全同胞鉴定的案例，在客观上违背了《规范》使用前提。根据笔者经验，在增加STR基因座检测时，若选择的试剂盒基因座大部分DP值小于0.9则可能会造成误判，同时由于目前市面上很少有DP值均大于0.9的商品化试剂盒可用，因此，本案例使用必检的19个基因座（准确率依然大于99%），虽然系统效能相对较低，出现对张1与张2、张3、张4是否存在全同胞关系无法给出倾向性意见情况，但错判率极低[9]。因此，在使用《规范》时鉴定人要注意甄别和核实委托方实际情况，注意适用范围及系统效能，并建议同时使用其他方法和增加遗传标记加以相互验证和甄别，以免不当使用试剂盒和方法干扰鉴定意见、甚至错误鉴定。
ITO法是计算个体间某种血缘关系的经典方法，与IBS法相比，可用于全同胞、半同胞、无关个体关系鉴定，适用范围更广，但是需要等位基因频率数据、计算较为复杂，鉴定人较难掌握。陆惠玲等[3]利用日常鉴定累积的1050个样本，通过15个常染色体STR基因分型结果在ITO法基础上建立了一套价值较高的鉴定全同胞、半同胞的方法，指出FSI∶HSI≥1与FSI∶HSI＜1可分别作为全同胞与半同胞的判别标准，交互准确率为87.5%；同时在此基础上建立了全同胞-半同胞等4组判别函数，进一步简化了计算，只需根据分型结果统计等位基因匹配情况，带入相应公式求出D 值，比较D 值高低即可作出判断，准确率在84.4%～97.7%。本案中，IBS法无法对张1与张2、张3、张4间全同胞关系给出倾向性意见，使用ITO及判别函数法计算后，提示张1与张2、张3、张4间存在半同胞关系，初步甄别出本案中隐藏的半同胞关系，但是由于准确率较低，还需其他遗传标记支持。
由于父系及母系遗传特点，性染色体STR以及mtDNA高变区序列多态性检测在同胞鉴定中可作为重要的支持和补充证据。X-STR可作为同父女性间鉴定的遗传标记，若参与鉴定的个体足够多，还可用于家系重建并为同母关系鉴定提供依据[7]；无论性别，mtDNA高变区序列多态性可作为同母关系鉴定的重要参考遗传标记；Y-STR是同父男性间鉴定的可靠遗传标记。本案中，由于参与鉴定人较多，结合性别，综合使用了X和Y染色体STR及mtDNA检测，结合常染色体STR分型结果，支持张2、张3、张4之间存在全同胞关系，支持张1与张2、张3、张4存在同母异父半同胞关系。
基于常染色体STR分型结果的家系重建，在隔代亲缘鉴定中具有重要的参考价值[4]。本案例由于参与鉴定的全同胞个体较多，根据常染色体STR分型结果可推断出父母基因型，根据孟德尔遗传规律，在每一个父母基因座可推断出≤4种基因型，其他存疑的全同胞或半同胞个体可在推断出的每一个基因座找到两个均相同或至少一个相同基因型，比对结果可支持最终的鉴定意见。
随着社会发展，亲权鉴定工作不断增多，案情的复杂性和风险性随之增高，在疑难、复杂、存疑的鉴定案例中要注意甄别和核实，而多种遗传标记的综合应用是鉴定机构和鉴定人降低鉴定风险、获得可靠鉴定意见的有效手段[7]。法医物证学鉴定机构和鉴定人要在实际工作中不断积累经验，正确运用各种遗传标记和计算方法以相互验证、支持，以得到可靠的鉴定意见，提高鉴定意见准确性和鉴定工作质量。
参考文献 ：
[1]中华人民共和国司法部司法鉴定管理局.生物学全同胞关系鉴定实施规范：SF/Z JD0105002-2014[S].2014.
[2]陆惠玲，杨庆恩.用ITO法计算两个体间的血缘关系机会[J].中国法医学杂志，2002，17（3）：188-191.
[3]陆惠玲，周科伟，吕德坚，等.ITO法和判别函数法在同胞关系鉴定中的应用[J].法医学杂志，2009，25（2）：118-122.
[4]易少华，刘宇轩，胡清清，等.采用家系基因型重建法鉴定半同胞关系1例[J].中国法医学杂志，2015，30（2）：184-187.
[5]中华人民共和国公安部.法庭科学DNA实验室检验规范：GA/T 383-2014[S].2014
[6]LIAN L H，LEK K C.Genetic polymorphisms in mitochondrial DNA hypervariable regionsⅠ，Ⅱ andⅢ ofthe Malaysian population[J].Asia-Pacific J Mol Biol Biotechnol，2005，13（2）：79-85.
[7]阙庭志，赵书民，李成涛.多种遗传标记在同母异父半同胞关系鉴定中的综合应用[J].法医学杂志，2010，26（4）：279-281，300.
[8]赵书民，李成涛，张素华，等.应用常染色体STR基因座共有等位基因数判别全同胞关系[J].法医学杂志，2009，25（4）：267-270.
[9]李燃，李成涛，赵书民，等.IBS评分法鉴定全同胞关系及其临界值查询表的构建[J].法医学杂志，2017，33（2）：136-140.
Application of Multiple Genetic Markers in Determination of Full and Half Sibling Relationship：A Case Report
LIAO Yong1,WU Feng1,HOU Dong-lin1,WU Yan-ling1,TAO Huan1,LI Cheng-tao2,WAN Hua-jing1
（1.Institute of Sichuan Genegle Forensic Identification,Chengdu 610041,China；2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Academy of Forensic Science,Shanghai 200063,China ）
Abstract ：Objective To investigate the application of the comprehensive use of multiple genetic markers in full and half sibling relationship testing through the identification of a case of suspected sibling relationship.Methods Genomic DNA were extracted from bloodstain samples from 4 subjects（ZHANG-1,ZHANG-2,male；ZHANG-3,ZHANG-4,female）.Autosomal STR loci,X-STR,Y-STR loci and polymorphisms of mtDNA HV-Ⅰ andⅡwere genotyped by EX20 STR kit,X19 kit,Data Y24 STR kit,and Sanger sequencing,respectively.Results According to autosomal STR based IBS scoring results,full sibling relationships were indicated among ZHANG-2,ZHANG-3 and ZHANG-4,but those were not indicated between ZHANG-1 and ZHANG-2 or ZHANG-3 or ZHANG-4.According to autosomal STR based FSI and HSI,with ITO method and discriminant function method,full sibling relationships among ZHANG-2,ZHANG-3 and ZHANG-4 were indicated,and half sibling relationships between ZHANG-1 and ZHANG-2 or ZHANG-3 or ZHANG-4 were also indicated.X-STR and mtDNA sequencing results showed that all the 4 samples came from a same maternal line,and Y-STR results showed that ZHANG-1 and ZHANG-2 did not come from a same paternal line,which supported the half sibling relationship between ZHANG-1 and ZHANG-2 or ZHANG-3 or ZHANG-4,verified by parental genotype reconstruction based on autosomal STR genotyping.Conclusion For the identification of sibling relationships,it is effective to have reliable results with the mutual verification and support of multiple genetic markers（autosomal STR,sex chromosomal STR and mtDNA sequence） and calculations（IBS,ITO,discriminant function method and family reconstruction）.
Keywords ：forensic genetics；genetic markers；sibling relations；short tandem repeat；Y-STR；DNA,mitochondrial
中图分类号 ：DF795.2
文献标志码： A
doi： 10.12116/j.issn.1004-5619.2019.03.011
文章编号 ：1004-5619（2019）03-0319-05
作者简介 ：廖勇（1979—），男，博士，主检法医师，主要从事法医物证学鉴定和遗传学研究；E-mail：keaanu@163.com
通信作者 ：万华靖，女，博士，副主任法医师，主要从事发育生物学及细胞生物学研究；E-mail：wanhj@newgenegle.com
（收稿日期 ：2017-10-19）
（本文编辑：张素华）
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