武汉钢铁（集团）公司第二职工医院感染科 湖北武汉 430085
摘要：目的：探讨产气荚膜梭菌与食物中毒之间的联系。方法：采集腹泻病人的粪便样品，进行生化鉴定和细菌分离培养，设计针对cpa、cpb、etx、iA、cpe及cpb2序列的6对特异引物，并采用多重PCR方法，对产气荚膜梭菌进行基因分型。结果：50份样品中，分离出10株产气荚膜梭菌，且均为A型，其中5株扩增cpb2基因。结论：产气荚膜梭菌是导致人类发生腹泻的主要病原菌，而重要的致病因子可能是其β2毒素。
关键词：致人腹泻；产气荚膜梭菌；多重PCR；基因分型
气荚膜梭菌在自然界中广泛存在，其是人兽皆可感染的病原菌[1]。由于气荚膜梭菌是人与动物肠道内的常见菌，因此其为引发人类腹泻与食物中毒的一个重要诱因。为了对气荚膜梭菌进行深入的研究，我们对腹泻病人的临床样品进行病原的分离鉴定与基因分型，以对引起食物中毒和腹泻的状况进行分析。现报道如下。
1.资料和方法
1.1 一般资料
采集腹泻病人的临床粪便样品共计50份，不同个体的粪便样品分开收集，并标注编号以区分不同病患的样品。
1.2气荚膜梭菌的分离鉴定
取6g粪便样品，加入灭菌生理盐水50mL，以1000r/min速度搅拌充分后，离心10min，取上清液1mL接种10mL的紫牛乳培养液，送入厌氧培养罐进行43℃厌氧培养9-12h。对出现爆裂发酵的培养液，划线于TSC平板后，进行43℃厌氧培养24h，挑选疑似菌落进一步分离纯化。挑选平板上黑色菌落接种接种鲜血琼脂平板，经厌氧培养24h后，挑选出现双环溶血的菌落，进一步采用标准化试剂盒进行生化鉴定。
1.3菌株的基因分型
1.3.1PCR引物设计
根据产气荚膜梭菌毒素基因序列设计的引物序列见表1。
1.3.2多重PCR扩增
在反应体系中加入缓冲液、混合引物、灭菌超纯水，DNA模板10μL，TaqDNA聚合酶1μL，以 50μL灭菌石蜡油覆盖。反应程序：94℃变性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后 72℃延伸 10min。待PCR 反应结束后，取8μL PCR 产物经40min电泳后，观察扩增片段的大小。
2.结果
通过细菌分离鉴定，鉴定出的产气荚膜梭菌有10株。经电泳鉴定，这10株产气荚膜梭菌出现大小为324bp的特异性条带，未扩增cpb、etx和iA特异性条带，说明10株均为A型。10株细菌均未扩增出CPE的特异性条带，但有5株扩增出针对cpb2的特异性条带。
3.讨论
产气荚膜梭菌是人与动物肠道内的常驻菌种，其毒力主要取决于其产生毒素的能力。由于产气荚膜梭菌作为导致人类发生腹泻的病原菌，因此其作用不容忽视。
产气荚膜梭菌的CPE和β2毒素与致腹泻具有显著相关性。因此，在本次研究中，不仅设计针对四种分型毒素的引物，还增设针对CPE和β2毒素引物。在10株分离株中，有5株扩增cpb2基因，表明β2毒素在导致人类发生腹泻的过程中产生一定作用，但其致病机理尚不明确，需进一步深入探讨。据相关研究报道[2]，产气荚膜梭菌导致人类腹泻的主要毒素是CPE，但经本次研究发现，所分离的10个菌株均未扩增CPE基因，这表明，除CPE外引起腹泻的毒素另有他物，如β2毒素。
为有效的控制腹泻的发生，需从病因着手。第一，加强食品安全检查，阻止产气荚膜梭菌的污染，对其可能发生大规模繁殖的环节，采取相应控制措施。第二，慎用抗生素[3]。滥用抗生素，不仅导致耐药菌株的产生，还可能造成产气荚膜梭菌的大量繁殖，致使腹泻的发生，因此使用抗生素须遵照医师的建议。
综上所述，产气荚膜梭菌是导致人类发生腹泻的主要病原菌，而重要的致病因子可能是其β2毒素。
参考文献：
[1]胡贺，覃宗华，王艳华等.不同地区鸡源产气荚膜梭菌的毒素型鉴定和药敏试验[J].畜牧与兽医，2015，47（10）：28-34.
[2]张艳，李兰兰，黄艺华等.鸡产气荚膜梭菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国兽医杂志，2015，51（4）：73-76.
[3]冶贵生，马玉花，张爽等.A型产气荚膜梭菌tetB（P）耐药基因核苷酸序列与蛋白结构分析[J].甘肃农业大学学报，2015，50（4）：160-164.
论文作者:胡毅
论文发表刊物:《健康世界》2016年第8期
论文发表时间:2016/7/13
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