陆巍[1]2004年在《病毒肿瘤靶向治疗应用性研究》文中提出病毒靶向肿瘤治疗是近年来出现的肿瘤生物治疗中较有希望的治疗方法之一。腺病毒由于具有：低致病性，不整合到宿主细胞基因组，可感染细胞谱广，病毒基因结构稳定，可以方便生产高滴度的病毒而且相对稳定等优点，是目前在病毒肿瘤治疗中研究最多的病毒。另外人群中野生型腺病毒的感染率相当高，而腺病毒也有较长的研究历史，因此以腺病毒作为治疗肿瘤的工具也具有较高的安全性保证。 研究发现腺病毒感染宿主细胞须要通过其E1B区早期转录蛋白作用于宿主细胞的P53蛋白，并使其失活，从而避免P53蛋白对其转录抑制作用，使病毒得以在宿主细胞中进一步复制。以往的研究表明，大部分人类肿瘤中均存在p53基因突变，因此E1B55kD蛋白缺失的重组病毒只能在P53功能异常的肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中该重组病毒由于缺乏对抗P53蛋白的病毒产物，不能有效复制，因此具有肿瘤靶向治疗的特点。另外E3基因编码的数种蛋白使腺病毒具有免疫逃避能力如：gp19KD蛋白可抑制细胞表面MHC-Ⅰ型抗原表达；10.4／14.5KD和14.7KD蛋白可抑制FasL或TNFα介导的淋巴细胞毒作用，因此可以通过删除E3区增强被感染宿主细胞被免疫识别能力，来增强治疗效果。 但是经改造后的腺病毒其治疗的安全性、有效性和临床适用性需要在进一步的人体试验中进行观察。细胞实验和动物试验初步验证了E1B缺失重组腺病毒治疗具有一定的肿瘤特异性，并且显示了一定的抑瘤率。动物毒理学研究显示，E1B缺失重组腺病毒对试验动物的急性、长期毒性实验无明显毒性反应和过敏反应。因此E1B缺失重组腺病毒被国家药品食品管理局批准进行人体试验研究。我们通过对肿瘤患者的试验性治疗观察E1B缺失重组腺病毒人体应用的短期安全性并对环境的安全性进行评价，在获得基本肯定后进一步对其治疗的有效性进行观察。 通过此次E1B缺失重组腺病毒人体治疗的观察，结合国外病毒治疗的经验，我们发现，通过重组腺病毒治疗肿瘤具有很高的安全性，也出现了一定的疗效，浙江人学博「研究生学位论文并发现疗效的出现与免疫因素可能有关，但同时治疗作用仍不够理想，因此有必要对其作进一步的改进。 目前增强病毒治疗效果的策略主要有:1.通过对病毒自身结构的改进，如鞭毛修饰等，以增强其靶向性和治疗效果;2.使病毒携带特定的治疗基因，增强其效果;3.研究病毒增强化疗、放疗效果的机制，降低化疗和放疗的剂量，减少它们的副作用;4.继续寻找安全且更具溶瘤效果的病毒用以治疗。 我们认为结合基因治疗将有助于发挥病毒治疗的优势，首先可复制病毒携带治疗基因可以大大增强所携带基因的表达，其次通过肿瘤特异性启动子启动所携带治疗基因可以增强肿瘤基因治疗的靶向性。 M记kine是属于肝素结合因子的一种多肚，对细胞的生长和分化起重要作用，出生以后仅存在于肾脏。研究发现Midkine在肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、食道癌、膀肤癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、脑肿瘤等多种肿瘤组织中均有表达，与肿瘤的发生和生长密切相关。而且Midkine的表达与肿瘤发展的进程及恶性程度密切相关，在癌前病变、低度恶性和高度恶性肿瘤组织中表达量依次增高。肿瘤坏死因子a(TNFa)是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，具有确定的杀伤或抑制肿瘤细胞的生物学效应，但是体内研究发现其抑制肿瘤的起效剂量要高于毒性剂量，因此利用TNFa蛋白治疗肿瘤存在很大的危险性。但是通过采用MK启动子启动TNFa的表达，可以使治疗具有肿瘤靶向性。 为此我们通过在细菌内同源重组的方法构建了携带以Midkine启动子(MK)启动人rrNFa基因的重组腺病毒载体:Ad一MK一TNFa，研究代号ZUCIO08，试图以此为研究对象验证该设计原理。 通过在HEK293病毒包装细胞中扩增最终获得了目的重组腺病毒载体rAd一MK一TNFa，同时我们通过相同的方法构建了对照空载体病毒、和CMV启动子启动TNFa的阳性对照病毒，代号分别为ZUCI006、ZUCIO07。通过对叁者对肿瘤细胞系和正常细胞系的不同作用，来比较它们的差别。 实验表明，不同肿瘤对ZUCI008的反应存在着很大的不同，有较敏感的细胞系如HL60，也有极不敏感的细胞系如K562。我们发现ZUCI007和ZUCIO08在100MOI以匕时对多种肿瘤细胞系均有确切的抑制生长作用，而且呈现一定的量效关系，其中ZUCI007对成纤维细胞具有明显的抑制作用，P<0.05，而ZUCIO08浙江人学博卜旬.究生学位论文对正常细胞系没有明显的抑制作用，提示ZUCI008具有一定的肿瘤选择性，可能是通过MK启动子启动TNFa来实现，而ZUCI007由于采用的是CMV启动子，因此不具有选择性。在I000MOI时空载体ZUCIOO6对Smml7721、RKO细胞没有抑制作用，P>0.5，而ZIJCIOO7和ZUCIO08对Smml7721、RKO细胞贝IJ有显着的抑制作用，P<0.肠，但是两者的抑制作用没有显着性差异，P>0.05，说明TNFa是Z[JCIOOS发挥其抑制肿瘤生长作用的重要因素。比较ZUCIOO7和ZU C1008对肿瘤细胞的作用发现，ZucI007对HePGZ的抑制作用要显着强于ZUCI008，而对HL60的抑制作用也强于ZUCI0
钱其军, 张琪[2]2006年在《肿瘤靶向治疗的现状和展望》文中指出攻克癌症一直是医学界面临的重大挑战。尽管对癌症的基因组学及表观遗传学进行了大量研究,在肿瘤的基因突变、表达谱及信号转导基础研究领域取得了重大进展,但在临床上,自从50年前Burchenal等开创癌症化疗以来,癌症患者的生存期并未见显着增长。近年来,针对肿
李泽[3]2013年在《大肠癌KRAS基因遗传变异的研究及靶向治疗预后评估》文中研究表明背景：大肠癌在世界上发病率第叁，死亡率第二，每年增加一百二十万患者。在中国，大肠癌已经一跃成为第叁位肿瘤导致死亡的疾病。大肠癌的治疗是以手术为主的综合治疗，选择手术可以切除病灶，解除肿瘤造成的梗阻症状。手术后化疗近年来发展迅速，辅以基因靶向治疗、免疫制剂治疗、中医中草药治疗，近年兴起的靶向治疗发展迅速。大肠癌的发生是细胞在多种复杂环境、多步骤、多种癌基因及抑癌基因共同作用的结果。全身化疗会提高晚期大肠癌的预后，但患者对化疗药物耐受的情况经常发生，转移性大肠癌如果出现对化疗药物耐药的不良事件后，预后生存期会明显缩短。在针对大肠癌发生阶段进行研究，行基因遗传变异的检测，找到适合转移性大肠癌个体化治疗方案将提高转移性大肠癌的预后、最大限度的减少耐药不良事件的发生，为晚期大肠癌的个体化治疗提供新方案。研究发现原癌基因KRAS是EGFR下游信号通路中重要的分子，KRAS基因2号外显子的突变可以诱导肿瘤细胞的无限制增殖，从而摆脱正常EGFR信号通路的调控。KRAS基因的突变会影响EGFR抑制剂的效果。目前NCCN指南已经推荐西妥昔单抗联合化疗用于晚期大肠癌KRAS基因野生型患者的一线治疗，同时也推荐KRAS基因突变型晚期大肠癌一线治疗应用贝伐单抗联合化疗。大肠癌KRAS基因遗传变异特点、靶向治疗药物西妥昔单抗及贝伐单抗治疗转移性大肠癌患者的安全性及疗效数据多来源于西方文献报道，国内研究甚少。目的：大肠癌患者行KRAS基因遗传突变检测，明确大肠癌KRAS基因遗传变异特点、KRAS基因遗传变异与大肠癌临床病理学因素之间的关系，KRAS基因遗传突变与大肠癌预后关系、不同突变亚型之间预后的关系。为转移性大肠癌的治疗提供理论依据。为了比较分析靶向药物西妥昔单抗、贝伐单抗两种药物联合化疗治疗转移性晚期大肠癌患者的安全性及疗效情况，排除KRAS基因突变型、野生型对患者预后生存分析的干扰，全部选取KRAS基因野生型患者进行靶向治疗。分别比较西妥昔单抗一线、非一线治疗的疗效；贝伐单抗一线、非一线治疗的疗效。比较西妥昔单抗、贝伐单抗治疗晚期大肠癌的疗效性及安全性。材料与方法：第一部分：78例大肠癌石蜡包埋标本，通过HE染色挑选癌组织丰富的蜡块，用PCR-SSCP方法对大肠癌标本进行KRAS基因2号外显子上的12、13号密码子遗传突变检测。应用SPSS19.0软件，确切概率法检验进行统计学分析，分析临床病理学因素与KRAS基因突变之间的关系，应用Kaplan-meier、Log-rank法分析KRAS基因遗传变异与预后的关系、KRAS基因不同突变亚型与预后之间的关系。应用Cox回归分析影响患者预后的因素。第二部分：回顾性分析本院72例KRAS基因野生型晚期大肠癌患者应用靶向药物西妥昔单抗、贝伐单抗联合化疗治疗情况。探讨两种药物各自用于一线治疗与非一线线治疗之间的疗效情况，同时比较西妥昔单抗、贝伐单抗药物近期疗效、远期疗效。应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，确切概率法检验比较组间差异。Kaplan–meier生存曲线是评价晚期大肠癌患者生存期之间的关系。显着性检验采用Log-rank检验分析，Cox回归模型进行多变量生存数据分析，研究各种因素对大肠癌预后影响。P<0.05定义为有统计学意义。结果：第一部分：78例结直肠癌患者中，KRAS基因2号外显子12、13密码子突变共有26例，突变率33.3%（26/78）。KRAS基因突变均为单个碱基的点突变，未检测出两个或两个以上的碱基突变或者其他形式的突变。G-A突变发生频率最高，共20例（20/26，76.9%）；G-T突变5例（5/26，19.2%）；G-C突变仅1例（1/26，3.9%）。KRAS基因12号密码子突变19例（73.1%，19/26），共有3种突变方式：GGT-GAT突变13例（13/26，50%），甘氨酸Gly替换为天冬氨酸Asp；GGT-GTT突变5例（5/26，19.2%），甘氨酸Gly替换为缬氨酸Val；GGT-GCT突变1例（1/26，13.9%），甘氨酸Gly替换为丙氨酸Ala。13号密码子突变7例（26.9%，7/26），均为GGC-GAC突变（7/26，26.9%），甘氨酸Gly替换为天冬氨酸Asp。在氨基酸替换中，Gly替换为Asp发生频率最高，占76.9%（20/26）；其次Gly替换为Val占19.2%（5/26）；Gly替换为Ala发生频率仅占3.8%（1/26）。KRAS基因突变与临床病理学因素之间的关系：KRAS基因突变与结直肠癌分化程度（低分化52.6%vs中分化27.1%，P<0.05）、肝转移（肝转移46.7%vs无肝转移25%，P<0.05）有关。78例患者追踪随访发现：KRAS基因野生型患者平均生存时间35.05月，KRAS基因突变型患者平均生存时间是25.72月，有统计学意义(P<0.05)。KRAS基因12号密码子突变患者平均生存时间是25.69月，13号密码子突变患者平均生存时间是20.67月，无统计学意义（P>0.05）。单变量分析显示KRAS基因遗传变异与大肠癌患者预后不良有关（P<0.05），多变量分析则显示KRAS基因突变、肝脏转移、肿瘤低分化是大肠癌预后的独立危险因素（P<0.05, P<0.05, P<0.05）。第二部分：回顾性分析本院收治krs基因野生型晚期大肠癌患者72例。西妥昔单抗联合化疗治疗38例，总体有效率34.2%，疾病控制率63.2%。一线治疗的有效率50%，疾病控制率87.5%。非一线有效率为22.7%，疾病控制率45.5%。一线治疗疾病控制率优于二线治疗，有统计学意义（P<0.05）。一线治疗有效率虽高于二线治疗，无统计学意义（P>0.05）。贝伐单抗联合化疗治疗34例，总体有效率29.4%，总体疾病控制率64.7%。一线治疗有效率42.9%，疾病控制率92.8%。非一线治疗有效率为20%，疾病控制率45%。一线治疗疾病有效率优于二线，有统计学意义（P<0.05）。一线治疗疾病控制率虽高于二线治疗，无统计学意义（P>0.05）。两种靶向治疗药物在有效率及控制率上比较均无统计学意义（P>0.05, P>0.05）。西妥昔单抗组与贝伐单抗组在常见不良反应方面出现频率无明显区别。西妥昔单抗联合化疗一线治疗组的中位生存期是16月，非一线治疗的中位生存期是12月，有统计学意义（P<0.05）。贝伐单抗联合化疗一线治疗组的中位生存期是24月，非一线治疗的中位生存期是17.5月，有统计学意义（P<0.05）。西妥昔单抗联合化疗组中的中位生存期是14月，贝伐单抗联合化疗组中的中位生存期是18.5月，贝伐单抗联合化疗组的中位生存期略高于西妥昔单抗联合化疗组，但两种靶向药物治疗在预后生存时间比较无统计学意义（P>0.05）。单变量分析显示：晚期大肠癌患者肿瘤所在的部位与预后不良有关（P<0.05）。多变量分析显示晚期大肠癌患者肿瘤所在部位及是否在初诊时候一线接受靶向治疗是预后独立的危险因素（P<0.05，P<0.05）。结论：KRAS基因突变在结直肠癌患者中普遍发生，且突变频率符合目前国际报道，突变频率较高33.3%。KRAS基因突变与结直肠癌低分化、肝脏转移关系密切。多变量分析显示肝脏转移、KRAS基因突变、肿瘤低分化是预后的独立危险因素。KRAS基因遗传变异结直肠癌患者预后不良。转移性大肠癌患者接受靶向治疗联合化疗，一线治疗的疾病控制率、有效率及生存期均优于非一线治疗。晚期大肠癌患者肿瘤所在部位与预后不良有关。多变量分析显示肿瘤部位及是否在初诊时候一线接受靶向治疗是预后独立危险因素。两种靶向治疗药物西妥昔单抗及贝伐单抗在疗效性、安全性对比无明显差异，应用晚期结直肠癌患者安全、有效。
姚航, 黄宗海, 厉周, 苏国强, 贺蓉[4]2007年在《联合基因靶向治疗对乳腺癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用》文中进行了进一步梳理目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动的双自杀基因(CDglyTK)联合 survivin 反义寡核苷酸(ASODN)对乳腺癌细胞(MCF-7)及血管内皮细胞(ECV304)的特异性杀伤作用。方法将质粒 pAdEasy-KDR-CDglyTK 在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR 的 MCF-7和 ECV304细胞株,同步用 survivinASODN 转染已感染腺病毒的 MCF-7和 ECV304细胞株,观察腺病毒的感染效率和 survivinASODN 的转染情况,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot 免疫印迹法检测 CDglyTK 和 survivin 基因在转基因 MCF-7和 ECV304细胞中的表达,MTT 法测定两者联合应用对细胞的杀伤效应和旁观者效应。结果 SurvivinASODN 可转染重组腺病毒感染的细胞,并且 survivinASODN 的转染率及重组腺病毒的感染率均不受影响,CDglyTK 可在两种细胞中高表达,survivinASODN 可明显降低 survivin 蛋白表达。单一 survivinASODN 基因转染 MCF-7和 ECV304细胞后,细胞存活率为56.4%±3.8%和55.9%±3.6%,与 AdKDR-CDglyTK 基因联用后,随着丙氧鸟苷(GCV)和5-氟胞嘧啶(5-FC)浓度的增加,细胞存活率迅速下降,两者联合作用与单一基因作用相比,差异有统计学意义(P<0.05)。但在 GCV 100μg/ml、5-FC 2000μg/ml 时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用 AdKDR-CDglyTK 组,两者差异无统计学意义(P>0.05)。SurvivinASODN 和 AdKDR-CDglyTK 联合作用在 GCV、5-FC 浓度较低时表现为协同效应,并具有更明显的旁观者效应。结论 KDR 启动子调控的 CDglyTK 融合基因体系和 survivinASODN 基因联合应用对乳腺癌细胞及血管内皮细胞具有显着的特异性杀伤作用。
孟政雷[5]2014年在《Kim-1特异性siRNA对肾癌细胞株786-0细胞增殖及细胞周期的影响》文中指出目的观察肾损伤分子-1(Kim-1)特异性小干扰RNA（siRNA）沉默Kim-1基因后，对肾细胞癌细胞株786-O细胞的细胞增殖和细胞周期的影响。探讨Kim-1作为肾细胞癌靶向治疗的新靶点的可能。方法采用脂质体介导方法将3条对人Kim-1基因序列特异的siRNA序列(50nmol/L)转染进入肾细胞癌786-O细胞中，转染后24h在荧光显微镜下观察转染效率。转染后48h采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测Kim-1基因的沉默效果，选取沉默效果较好的一组进行后续检测。采用噻唑蓝（MTT）比色法检测不同时间点（转然后24h，48h，72h，96h）细胞增殖的情况，转染后48h采用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。结果1.脂质体介导的转染能有效地将siRNA序列转染进入786-O细胞中，转染有效率为（94.36±2.57）%。2. Kim-1-siRNA能有效下调786-O细胞中Kim-1基因的表达水平，叁个不同序列的Kim-1-siRNA的沉默效果分别为（72.47±5.91）%、（12.98±2.21）%、（29.56±3.88）%；而阴性对照组的相对表达量为（96.56±3.47）%（P<0.05）。3.在肾细胞癌中沉默Kim-1基因的表达后，细胞的增殖受到抑制，3组转染后96h的增殖抑制率分别为空白对照组0%、阴性对照组(3.80±1.24)%、实验组(54.31±3.82)%（P<0.05）。4.在肾细胞癌中沉默Kim-1基因的表达后使细胞周期阻滞在G0/G1期，转染48h后检测各组细胞G0/G1期所占的比例分别为空白对照组（38.44±1.82）%、阴性对照组（42.06±2.15）%、实验组（63.69±2.87）%（P<0.05）。结论1. Kim-1特异性siRNA可有效沉默肾细胞癌细胞株786-O中Kim-1的表达。2.在肾细胞癌细胞株786-O中沉默Kim-1分子的表达，可使细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖。3. Kim-1分子在肾细胞癌的发生和发展中可能具有重要的作用，可作为肾细胞癌治疗潜在的特异性靶点。
张远起, 李建文, 陈小东[6]2011年在《乳腺癌干细胞的研究进展》文中研究说明干细胞是一群具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体,在特定的微环境下,可以分化成多种组织和器官,理论上一个干细胞可以发育成为完整的生物个体或组织器官。肿瘤干细胞理论在一定程度上解释了乳腺癌的形成,局部、远处转移及治疗抵抗等生物学行为。乳腺癌干细胞是当今科研领域的一个热点,有关乳腺癌干细胞理论及其在临床防治中的应用尚存在诸多问题。该文综述乳腺癌干细胞的研究进展。
李月明, 姚登福[7]2008年在《缺氧诱导因子-1分子组成、活化机制及肝癌靶向治疗》文中研究指明肝癌是世界常见恶性肿瘤之一,其发生是多中心,多病因和多基因参与的复合过程.其目前的治疗仍以手术切除为主,而肝癌确诊时大多已属中晚期,治疗效果很差.因此开发新的分子标志物早期诊断肝癌和寻找新的基因治疗靶点成为肝癌研究的热点.缺氧诱导因子-1(HIF-1)参与肝癌发生、发展、转移及术后复发的多个环节,对肝癌的早期诊断和分子靶向治疗具有潜在的应用前景.本文就HIF-1的分子组成、活化机制以及与肝癌靶向治疗相关进展作一综述.
李思思[8]2011年在《识别白血病干细胞的新单抗3A4的生物学特性及基因改造研究》文中研究说明研究背景及目的急性白血病是一种最常见的血液系统恶性肿瘤,占国内肿瘤发病率的第六位,是35岁以下发病率、病死率最高的恶性肿瘤。小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高,每年至少以1.5万新病人的速度递增。虽然联合化疗和造血干细胞移植大大提高了患者的总体完全缓解率(CR)和五年无病生存率(DFS),但是,仍有相当一部分患者因为不能耐受化疗相关的毒副作用和复发而治疗失败。分子靶向治疗能够特异性杀伤肿瘤细胞,最大限度地减少非靶向组织细胞的毒副作用,因此,成为白血病治疗研究的热点。其中,单抗导向的靶向治疗是分子靶向治疗研究的重要领域。近年,CD20和CD33等单抗已在临床分别广泛应用于B系非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和AML的治疗,取得了一定的疗效。为了更有效地治疗白血病,需要研制和开发更多的能够识别白血病细胞的单克隆抗体(单抗,Mab)药物。白血病干细胞(leukemia stem cells, LSCs)是白血病复发的根源,如果有单抗能够较特异性地靶向白血病干细胞,白血病的治疗和预后将会有新的突破。3A4是本实验室自行研制的鼠抗人CD45RA单抗,前期研究发现,与现有的抗CD45RA抗体(克隆名：L48)相比,3A4能够识别更多的白血病幼稚细胞。并且,3A4能够识别髓系白血病细胞系KG1a中超过99%的白血病干细胞。因此,我们对3A4单抗的生物学性质和功能,3A4基因工程抗体等方面进行了深入和系统的研究,以期发现该新单抗在白血病靶向治疗中的潜在应用价值。研究包括两个部分：1.3A4鼠源性抗体的蛋白性质和功能研究；2.3A4基因工程抗体的制备和活性鉴定。方法1 3A4抗体的蛋白性质和功能研究1.1 3A4抗体的纯化和性质研究：通过有限稀释法对3A4杂交瘤细胞进行亚克隆,获得最高纯度的杂交瘤细胞系；通过流式细胞术(Flow cytometry, FCM)鉴定3A4抗体的免疫球蛋白亚类；通过阻滞实验确定3A4识别的抗原表位；通过SPA Sepharose亲和层析法纯化腹水获得纯化抗体,SDS-PAGE鉴定抗体的分子量。1.2 3A4抗原表达谱的研究：以改良Marshall(?)去制备直标异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate, FITC)抗体3A4-FITC, FCM比较其和美国Becton-Dickinson (BD)公司的CD45RA(克隆名：L48)识别的抗原(Ag)在白血病细胞系、初发白血病幼稚细胞、复发及耐药白血病幼稚细胞上的表达。同时,FCM检测3A4 Ab识别的抗原在CD34+CD38-CD123+白血病干细胞上的表达。1.3 3A4抗体功能研究：通过木瓜酶消化结合FCM检测抗体内化程度；通过补体依赖的细胞毒实验(CDC)了解3A4与抗原的特异性结合及激活补体的能力；通过改良的活泼酯法制备去甲斑蝥素(Norcantharidin)耦联3A4抗体免疫毒素(3A4-NCTD),检测其靶向杀伤功能。2 3A4基因工程抗体的制备和活性研究2.1 3A4重、轻链可变区基因克隆：根据鼠免疫球蛋白重、轻链可变区的恒定区和框架区设计引物,通过RT-PCR扩增3A4重、轻链可变区基因序列VH3A4和VL3A4,并将序列克隆至pGEM(?)-T easy载体。2.2 3A4单链抗体ScFv3A4真核表达载体的构建和表达：设计包括酶切位点和G4Slinker序列的引物,通过SOE-PCR将VH3A4和VL3A4序列相连,获得单链抗体基因序列ScFv3A4,将该序列插入真核表达载体pcDNA3.1,以此转染中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,使之表达单链抗体ScFv3A4。FCM检测抗体活性,竞争结合实验测定抗体相对亲和力,细胞免疫荧光法检测工程细胞胞浆内重组蛋白的表达,RT-PCR检测目的基因是否整合至宿主细胞DNA。2.3 3A4人鼠嵌合型抗体Hm3A4真核表达载体的构建和表达：设计包括酶切位点的引物,扩增ScFv3A4基因,将单链基因ScFv3A4插入自行改造的嵌合型抗体真核表达载体pHMCH3(具体改造方法正准备申请专利,在此不作详述),以此真核表达载体转染CHO细胞,使之表达人鼠嵌合型抗体Hm3A4。FCM检测抗体活性,滴定实验了解其培养上清中的抗体滴度,竞争结合实验测定抗体相对亲和力,细胞免疫荧光法检测工程细胞胞浆内重组蛋白的表达,RT-PCR检测目的基因是否整合至宿主细胞DNA。2.4嵌合抗体Hm3A4功能研究：以无血清培养Hm3A4CHO,通过SPA Sepharose亲和层析法纯化培养上清,Western-blot鉴定蛋白分子量。通过CDC作用检测Hm3A4是否能够激活补体杀伤靶细胞,通过抗体依赖介导细胞毒(ADCC)作用检测Hm3A4是否具有抗体依赖介导细胞毒性效应。结果1鼠源性抗体的蛋白性质和功能研究1.1 3A4Ab的纯化：亚克隆获得高纯度的细胞系G2。FCM检测免疫球蛋白亚型,3A4和羊抗鼠重链IgG1反应阳性率为99.48%,和羊抗鼠轻链K反应阳性率为99.02%。对CD45RA、CD45和CD45RO的阻滞实验显示,3A4阻滞前后,CD45RA阳性率分别为98.18%和8.15%；CD45阳性率分别为99.96%和99.77%,CD45RO阳性率分别为99.95%和99.96%。SPA Sepharose亲和层析法纯化腹水获得20mg纯化抗体SDS-PAGE鉴定重链分子量为57.9kDa,轻链分子量为30.0kDa。1.2 3A4抗原表达谱的研究：以改良Marshall(?)去成功制备直标抗体3A4-FITC。F/P比值为2.24,与理想比值(1-2)接近,滴定结果显示0.5μg 3A4-FITC直标抗体即可以饱和1×106KGla细胞。3A4抗原和CD45RA抗原(BD公司的CD45RA抗体识别的抗原,下同)在T-ALL的表达差异无统计学意义(P=0.313),3A4抗原在白血病细胞系的表达高于CD45RA抗原(P=0.045),3A4抗原在B系ALL和AML的表达明显高于CD45RA抗原,P值分别为0.009和0.000。3A4抗原在复发和耐药的白血病幼稚细胞上呈高表达,阳性率>90%,高于CD45RA抗原(P=0.016)。3A4抗原在白血病干细胞的表达呈强阳性,阳性率范围：83.33%-100%,中位值：97.83%。1.3 3A4抗体功能的研究：通过木瓜酶消化结合FCM检测发现,37℃孵育0.25h、0.5h、1h、2h、3h和4h,3A4的内化程度分别为5.31%、7.29%、36.91%、69.19%、72.64%和71.81%。4℃孵育抗体不内化。免疫毒素3A4-NCTD作用24h、48h、72h和96h,靶细胞死亡率分别为1.73%、15.27%、25.79%和61.09%。2基因工程抗体的制备及活性研究2.1 3A4重、轻链可变区基因的序列分析：VH3A4基因全长351bps, VL3A4基因全长321bps,分别编码117和107个氨基酸残基。互联网在线分析显示VH3A4含有4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)；VL3A4含有4个FR和3个CDR。2.2单链抗体ScFv3A4真核表达载体的构建和表达：ScFv3A4基因序列大小为763bp,将其插入真核表达载体pcDNA3.1,以重组载体转染CHO细胞,G418加压培养2周、4周和5周的阳性率分别为44.47%、97.80%和99.78%。竞争结合实验显示在5×105KGla细胞上,抗体相对亲和力为1.2×1010M-1。细胞免疫荧光染色显示转染细胞胞浆内有重组蛋白的表达。RT-PCR显示,以ScFv3A4CHO细胞cDNA为模板可扩增出目的基因条带。2.3嵌合型抗体Hm3A4真核表达载体的构建和表达：将ScFv3A4基因插入表达载体pHMCH3中。以重组载体转染CHO细胞,G418加压培养2周、4周的阳性率分别为96.51%和98.20%。平均荧光强度指数(Mean Fluorescence Intensity,MFI)分别为86.60和198.23。培养上清滴定实验显示：20μl上清可使1×106个KG1a细胞阳性率达到97.35%,MFI达到47.41,当上清量增至2ml时,MFI达到360.71。竞争结合实验显示在5x105KGl a细胞上,抗体相对亲和力为1.1×1011M-1。细胞免疫荧光染色显示转染细胞胞浆内有重组蛋白的表达。RT-PCR显示,以Hm3A4CHO细胞的cDNA为模板可扩增出目的基因条带。2.4人鼠嵌合型抗体Hm3A4的功能研究：Western-blot鉴定分子量,单体分子量约43 kDa,二聚体分子量约100 kDa。CDC实验发现Hm3A4对KGla细胞的CDC作用随浓度增高而增强,0.05μg/ml、0.1μg/mL、1μg/ml、5μg/ml的抗体对靶细胞的杀伤率分别为：18.4%、48.6%、70.1%、78.3%。Hm3A4通过ADCC作用对KGla的杀伤率达到28.96%。结论1.3A4单抗能够识别KG1a细胞表面的CD45RA抗原,其属于IgGlκ免疫球蛋白亚类。3A4抗体的重链和轻链分子量分别为57.9 kDa和30.3 kDa。2.3A4能够识别比CD45RA更多的B系ALL和AML白血病幼稚细胞,能够有效地识别髓系白血病干细胞和复发难治的白血病幼稚细胞。3A4和抗原结合后能够较快地内化至胞浆,其免疫毒素能够有效地靶向杀伤靶细胞。因此,3A4抗原可以成为靶向治疗的新靶点。3.成功构建3A4单链抗体真核表达载体pcDNA3.1/ScFv3A4和人鼠嵌合型抗体真核表达载体pHMCH3/Hm3A4;通过CHO细胞表达活性良好的单链抗体ScFv3A4和人鼠嵌合型抗体Hm3A4。
参考文献：
[1]. 病毒肿瘤靶向治疗应用性研究[D]. 陆巍. 浙江大学. 2004
[2]. 肿瘤靶向治疗的现状和展望[J]. 钱其军, 张琪. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2006
[3]. 大肠癌KRAS基因遗传变异的研究及靶向治疗预后评估[D]. 李泽. 吉林大学. 2013
[4]. 联合基因靶向治疗对乳腺癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用[J]. 姚航, 黄宗海, 厉周, 苏国强, 贺蓉. 中华外科杂志. 2007
[5]. Kim-1特异性siRNA对肾癌细胞株786-0细胞增殖及细胞周期的影响[D]. 孟政雷. 郑州大学. 2014
[6]. 乳腺癌干细胞的研究进展[J]. 张远起, 李建文, 陈小东. 广东医学院学报. 2011
[7]. 缺氧诱导因子-1分子组成、活化机制及肝癌靶向治疗[J]. 李月明, 姚登福. 世界华人消化杂志. 2008
[8]. 识别白血病干细胞的新单抗3A4的生物学特性及基因改造研究[D]. 李思思. 浙江大学. 2011
标签：肿瘤学论文; 肿瘤论文; 抗体论文; 靶向治疗论文; 化疗药物论文; 抗原抗体反应论文; 抗原表位论文; ras基因论文; 抗原决定簇论文; 突变理论论文; 细胞转染论文; 放化疗论文; 大肠癌论文; 腺病毒论文; 癌症论文; 白血病论文; 干细胞论文;