徐丽昕[1]2004年在《GADD45基因表达作为生物剂量计的可行性研究》文中指出准确估算电离辐射作用于机体的剂量是核辐射损伤诊断和防治的关键，现有的生物剂量估算方法都存在一些不足如特异性差、本底高、维持时间短及检测方法复杂费时等。随着辐射诱导细胞生长阻滞的分子调控机制的研究成为放射生物学研究的热点课题，辐射后基因在转录水平的变化也就成为研究的焦点。 GADD45基因(生长阻滞和DNA损伤基因45，Growth arrest and DNA damage gene 45)是目前研究比较多的基因，该基因位于p53下游，与辐射诱导细胞周期阻滞关系密切。近年来国外相继有电离辐射诱导GADD45基因表达变化的文献报道，2002年2月，美军放射生物研究所生物剂量小组首次发表了将GADD45基因表达变化用作辐射生物剂量计研究的文献。 为了研究GADD45基因在转录水平表达变化和受照剂量之间的关系，本实验选取健康人外周血单个核细胞为实验对象，应用逆转录半定量PCR的实验方法，测定该基因mRNA的相对量。首先根据文献选择特异性引物，在genbank上进行核实，扩增GADD45基因片段。选择在人体内稳定表达的β-actin为内参，合成引物序列并与GADD45进行同管扩增，产物电泳后在凝胶成像仪上用PCR分析软件分析条带的灰度及密度等因素，两者比值(GADD45/β-actin)表示GADD45基因的相对量。 将100ml健康献血员外周血平均置于6个40ml培养瓶中，分别给予0、1、2、3、4、5Gy X射线照射，提取单个核细胞，加入含10％胎牛血清的1640液后置于37℃培养箱中培养，在培养0h、4h、8h、16h、20h和24h的6个时间点测定GADD45基因的含量。 实验采用6×6析因设计，每交叉点重复测量4次，实验结果(基因mRNA相对量)用平均数±标准差表示，用SARS软件分析数据，比较照射后不同时间点之间、不同照射剂量之间、以及不同照射剂量的各个时间点之间是否有统计学差异；作照射后各时间点GADD45表达量与照射剂量的直线相关分析；作不同照射剂量下GADD45表达量与照射后时间的非线性曲线拟合。军事医学科学院硕_l:论文摘要 实验结果显示，照射后各个时间点上GADD45基因表达量间有统计学差异(P<0.05)。观察照射剂量与基因表达量的关系可看出，在所观察的各时间点上，基因表达量随照射剂量增加而增加，存在直线关系，得出直线回归方程。 观察每个剂量组的基因表达量和时程之间的关系，得出1一SGy的5个剂量趋势一致:照射后基因表达增加，在照后4小时GADD45基因相对量达最高峰，此后下降，在观察到的最长时间点上(24h)该基因量仍未降至初始水平。 本次实验结果表明，X线照射可诱导GADD45基因表达照射随剂量增加而增加，具有较好的线性关系。这与国内外关于X线照射诱导Gl期阻滞及相应基因表达变化的实验结果一致，也再次证明了作为P53下游基因的GADD45基因在辐射诱导的细胞Gl期阻滞中所起的重要作用。因此我们得出初步结论:GADD45基因可以作为一个新的电离辐射生物标志，本实验中建立的Rl’- PCR检测技术快速、简便，有希望成为一个新的生物剂量测定方法。
蒋亚齐[2]2007年在《基于辐射诱发染色体和DNA损伤的生物剂量计可行性研究》文中指出目的:为解决辐射生物剂量学的难点问题,如剂量率效应、快速剂量估算和低剂量估算等,比较不同剂量率60Co-γ射线照射人外周血淋巴细胞诱发的双着丝粒染色体畸变率,分别拟合剂量效应曲线,准确估算受不同剂量率照射病人的生物剂量;探讨单细胞凝胶电泳(SCGE)用于辐射损伤快速剂量估算的可行性;筛选DDB2和IER5两个辐射敏感基因并观察受60Co-γ射线照射后的表达变化,探求其作为新型分子辐射生物剂量计的可行性。方法:(1)分别采用低、中、高剂量率(0.35、1.94和4.4Gy min-1)60Co-γ射线照射人外周血,一步法培养52h收获制片,计数双(多)着丝粒+环数目,比较不同剂量率双着丝粒染色体畸变差异,拟合剂量效应曲线及数学方程;(2)用碱性单细胞凝胶电泳技术检测2Gy 60Co-γ射线照射后不同时间点的小鼠外周血细胞DNA损伤及0～5Gy 60Co-γ射线照射人外周血细胞DNA损伤,并拟合剂量效应曲线;(3)用Northern blot技术检测0～10Gy 60Co-γ射线照射后4h、12h、24h人淋巴母细胞AHH-1细胞中DDB2、IER5基因相对表达量。结果:(1)0.35、1.94和4.4Gy min-1叁种剂量率60Co-γ射线照射人外周血,相同剂量率不同剂量点诱发的双着丝粒染色体畸变率随照射剂量的增加而增加,分别拟合的剂量效应方程符合线性平方模型,相同剂量点不同剂量率诱发的双着丝粒染色体畸变率随剂量率的下降而下降,存在明显的剂量率效应,用低剂量率曲线估算的剂量明显高于高剂量率曲线估算的剂量。(2)小鼠受照后外周血细胞DNA损伤(以彗星尾距TM值表示)在照射后即刻最明显TM值为33.77,照射后2h TM值下降到7.74,照射后24 h与照射前相比无显着性差异( p >0.05)。人离体外周血细胞照射后即刻尾矩TM值随剂量增加而增加,照射组与未照射组之间有非常显着的差异( p <0. 01),剂量效应呈现良好的线性关系Y = 0. 3619 + 2. 1834D( r = 0. 9946);人外周血细胞尾矩TM照射后6 h与未照射组相比已无显着性差异( p > 0. 05)。(3)DDB2基因的诱导表达在照后4h和12h在0.5～4Gy剂量范围内有良好的剂量依赖性;IER5基因mRNA表达水平分别在照后4h 0.5～10Gy范围内、照后12h 0.5～6Gy范围内、照后24h 0.5～4Gy剂量范围内存在明显的剂量效应关系。结论:60Co-γ射线诱发双着丝粒染色体畸变存在剂量率效应,用低剂量率曲线估算的剂量明显高于高剂量率曲线估算的剂量,当对事故病人剂量估算时应根据辐照当时的实际情况选择相近剂量率的刻度曲线估算剂量;碱性单细胞凝胶电泳是一种快速、灵敏检测DNA损伤的有效方法,照后早期具有良好的剂量效应关系,但修复较快,可测时间范围有限;DDB2和IER5基因mRNA表达水平在一定的时间和剂量范围内具有显着的剂量依赖性,具有发展成为分子生物剂量计的潜能。
王平, 韩林, 姜峰, 吕玉民[3]2013年在《GADD45A和NM23-H1组合检测作为电离辐射生物剂量计可行性研究》文中指出目的探讨生长抑制和DNA损伤诱导基因45A(GADD45A)与转移抑制基因23-H1(NM23-H1)作为X射线电离辐射生物剂量计的可行性。方法采用0、1、2、3、4、5 Gy剂量(设为相应的剂量组)X射线离体照射周围血样本,分别于照射后0、6、12、24 h时间点收集细胞,采用实时定量聚合酶链式反应法检测GADD45A和NM23-H1的相对表达水平,采用两因素重复测量资料的方差分析、多元线性回归与曲线拟合分析分析2者表达情况以及单独和联合应用预测照射剂量的结果。结果不同剂量组间、不同时间点间GADD45A相对表达水平分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01);剂量与时间之间存在交互作用(P<0.01)。不同时间点间NM23-H1相对表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.01);不同剂量组间NM23-H1相对表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);剂量与时间之间不存在交互作用(P>0.05)。照射后12和24 h,采用GADD45A相对表达水平预测照射剂量的回归模型决定系数(分别为0.198,0.393)与联合以GADD45A和NM23-H1相对表达水平预测的回归模型决定系数(分别为0.144,0.347)相近。结论电离辐射可诱导人周围血GADD45A和NM23-H1表达的改变;GADD45A和NM23-H1组合检测作为电离辐射生物剂量计的应用尚有待进一步研究。
刘斌[4]2007年在《辐射可诱导基因Gadd45和p21～（WAF1）作为辐射生物剂量计的实验室评估》文中研究说明辐射生物剂量计在核事故受害者受照剂量估算及辐射生物学效应研究中具有重要的应用价值。在半个多世纪的研究中，被筛选过的指标有近百种，但经实践验证具有实用价值的却不多。理想的电离辐射生物剂量计应具备的特点包括，①具有电离辐射可诱导性；②与照射剂量显示有较好的剂量—效应关系；③取样方便，如人外周血、尿、头发等；④方法简便，测定快速等。迄今为止尚没有一种现有的生物剂量计能完全符合这些要求。电离辐射诱发的基因表达变化与被照细胞的生物学反应密切相关。其中辐射可诱导基因Gadd45(growth arrest DNA damage inducible)的剂量效应尤为引人关注。美国陆军放射生物研究所的体外研究工作表明，受电离辐射照射后，人外周血中Gadd45 mRNA水平迅速升高，且mRNA水平与照射剂量存在较好的剂量—效应关系。尤其是Gadd45 mRNA在电离辐射后变化速度快、易于检测，这一特点正是现有的生物剂量计所欠缺的。而在受照早期对照射剂量进行快速估算对于照射受害者的诊断和治疗至关重要。由此，Gadd45能否发展成为一种新的GEC型(Gene Expression Changes)电离辐射生物剂量计成为生物剂量领域追踪的热点。迄今为止，关于Gadd45剂量—效应关系已有的研究，都是基于对单个血液样本所做的检测。而要将Gadd45最终发展为成熟的生物剂量计，个体间的Gadd45 mRNA水平的差异是必须要考察的一个因素。同时，已有研究所使用的方法也都要求有未照射样本作为对照来评价照射样本中Gadd45 mRNA水平的变化幅度。但通常照射事故的病人是小可能留有自身未照射的血液样本。所以建立一种能够在电离辐射后无需对照，而能准确、快速通过检测受照样本Gadd45 mRNA水平估算受照剂量的方法也是亟需解决的难题。针对上述两个问题，本研究首先建立了相对标准曲线法类型的实时定量PCR方法，用β-肌动蛋白(β-actin)作为内对照基因，对电离辐射后Gadd45的变化规律进行研究。建立了Gadd45 mRNA水平变化最明显的照射后4小时0-2.5Gy范围内的剂量—效应回归方程(y=0.216+0.258x，R~2=0.650)。统计学分析表明，由此剂量—效应回归方程推算照射剂量时的精确性尚不能达到令人满意的水平。为了寻找新的GEC观测指标，以期得到精确性更高的剂量—效应曲线，我们在进一步研究中改用电离辐射后基因表达升高幅度更为明显的p21~(WAFI)作为研究对象，并且由照射后表达下降的c-myc替代传统的内对照基因β-actin。建立了照后4小时p21~(WAFI)／c-myc组合0-2.5Gy范围内的剂量—效应回归方程(y=0.482+0.773x，R~2=0.855)，此回归方程显示出比Gadd45／β-actin回归方程更好的精确度。此前，关于p21~(WAFI)作为辐射生物剂量计的可行性研究尚未见报道。总结上述研究，我们建立了相对标准曲线法类型的实时定量PCR方法，并由这一方法建立了Gadd45／β-actin和p21~(WAFI)／c-myc的剂量—效应刻度曲线。应用此方法和剂量—效应刻度曲线，成功地解决了照射事故的病人缺乏自身未照射血液样本的问题。此外，我们对使用Gadd45／β-actin和p21~(WAFI)／c-myc作为生物剂量计时个体差异所产生的影响进行了评估。应用我们建立的剂量—效应标准曲线和相对标准曲线法类型的实时定量PCR大致能够对实验条件下0-2.5Gy范围内的血液照射样本的剂量进行估算。将Gadd45和p21~(WAFI)发展为可实用的生物剂量计向前推进了一步。
李孝鑫[5]2016年在《辐射敏感基因作为潜在生物剂量计的实验研究》文中提出电离辐射能够导致DNA断裂引起基因表达发生变化,推测电离辐射敏感基因可能发展成为辐射损伤生物标志物,用于生物剂量的估算。现有的生物剂量计存在耗时耗力的问题,不能满足大批量受照人群的快速检测,因此需要建立一种快速、高通量的生物剂量估算方法应对大批量受照人群的剂量估算。本文将在前期基因芯片研究的基础上,对筛选出的辐射后差异表达、具有一定的剂量依赖性、本底值相对均一的TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、SPIB 5个辐射诱导上调基因和TCL1A 1个辐射诱导下调基因,利用实时荧光定量PCR进行深入研究,探索这些基因作为新型分子辐射生物剂量计的可行性。目的:研究辐射敏感基因照射后的时间效应和剂量效应关系以及健康人的本底水平,探讨其作为辐射损伤早期生物标志物应用于生物剂量估算的可行性。方法:1通过对TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A、SPIB 6个辐射敏感基因和β-actin 1个内参基因的引物特异性检测、探针非特异性排除、反应温度的优化、质粒标准品的构建和标准曲线的建立,建立实时荧光定量PCR检测方法。2采用不同剂量(0Gy、0.5Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy)的60Coγ射线照射正常人外周血,在照射后培养不同时间(0h、2h、4h、8h、12h、24h)收集,提取全血总RNA,采用实时荧光定量PCR的Taq Man探针两步法检测照射后TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A、SPIB 6个辐射敏感基因的m RNA表达水平,观察其随受照剂量和培养时间的表达变化,筛选具有辐射损伤生物标志物潜力的基因。3采集29名健康志愿者的外周血进行TRIAP1、RPS27L、AEN 3个基因本底水平的分析(男性15名,女性14名;年龄组分别为21-30岁组10人,31-40岁组10人,41-50岁组9人),提取全血总RNA,采用实时荧光定量PCR的Taq Man探针两步法检测辐射敏感基因m RNA的本底表达水平。4采用6-8周龄体重18-22g的雄性C57BL/6小鼠,进行不同剂量(2Gy、8Gy)的γ射线整体照射,未照射样0Gy为对照组;照射后不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h)采集血样提取总RNA,利用实时荧光定量PCR的Taq Man探针两步法检测照射后TRIAP1、RPS27L、AEN 3个辐射敏感基因和18S RNA 1个内参基因m RNA随剂量和时间的表达变化,研究辐射敏感基因在小鼠的整体照射后的表达效应。结果:1通过对6个辐射敏感基因和β-actin内参基因引物特异性的检测、探针非特异性排除、反应温度的优化、质粒标准品的构建和标准曲线的建立,建立了实时荧光定量PCR的检测方法。2在对外周血进行不同剂量照射培养不同时间后,与对照组相比,TRIAP1基因在2h、4h开始增加,8h达到峰值10.44,12h、24h略有下降,在8h、12h和24h呈现出较好的剂量依赖关系;RPS27L在2h各剂量下无明显增加,4h开始逐渐增加,8h达到峰值9.97,12h和24h下降至与4h相近的水平,在4h、8h、12h和24h呈现出较好的剂量依赖关系;AEN基因在2h开始增加,4h、8h和12h持续增加并呈现出一定的剂量饱和效应,24h开始下降但仍高于本底;C12orf5基因在2h各剂量点下均无显着增加,4h开始增加明显,8h、12h和24h表达变化水平相近呈现出一定的剂量依赖性;TCL1A基因在2h各剂量点下均无显着减少,在4h、8h、12h和24h略有减少但未呈现出明显剂量依赖关系;SPIB基因在4h、8h表达水平升高但无显着性差异,在2h、12h和24h在各剂量点下几乎没有响应。3不同剂量照射后,TRIAP1基因在8h、12h和24h拟合0.5-10Gy的剂量效应曲线分别为y=2.663ln(x)+4.3668,R2=0.9969;y=1.6162ln(x)+3.6017,R2=0.9799;y=1.0839ln(x)+2.9733,R2=0.9562;RPS27L基因在4h,8h,12h和24h 0.5-10Gy的剂量效应拟合曲线分别为y=0.7608ln(x)+2.141,R2=0.9594;y=2.1686ln(x)+4.3925,R2=0.9636;y=0.8334ln(x)+2.4676,R2=0.9684;y=0.4786ln(x)+2.023,R2=0.9204;AEN基因在2h,4h,8h进行0.5-6Gy剂量范围的剂量效应拟合曲线分别为y=1.31ln(x)+2.1332,R2=0.9326;y=2.3864ln(x)+5.2762,R2=0.9913;y=4.6111ln(x)+8.4048,R2=0.9829,在12h和24h进行0.5Gy-4Gy剂量范围的剂量效应拟合曲线分别为y=2.5651ln(x)+5.3049,R2=0.9715;y=1.8254ln(x)+4.7758,R2=0.9686。所有曲线方程的R2均大于0.92,说明剂量效应关系显着。4通过29个健康人本底水平检测后的结果得出,TRIAP1基因本底值是0.170±0.031,波动范围0.101-0.248,变异系数18.086%;RPS27L基因的平均值为1.450±0.183,波动范围是1.085-1.775,变异系数是12.641%;AEN基因的平均值为0.056±0.010,波动范围是0.041-0.075,变异系数是18.001%。3个基因的变异系数均在20%以内,波动范围小且相对均一。分别对TRIAP1、RPS27L和AEN基因进行年龄和性别因素的差异性分析,结果显示TRIAP1、RPS27L和AEN均不受年龄因素(P分别为0.732、0.284、0.153)和性别因素(P分别为0.445、0.469、0.278)影响。5 2Gy和8Gy照射小鼠并在照射后饲养不同时间,与对照组相比,TRIAP1基因在照射后0-48h随时间的延长表达水平不断上升,在24h、48h和72h表达水平具有显着性差异(P<0.05),在48h达到峰值15.18,72h略有下降;RPS27L基因在4h和8h表达变化水平较高仅在8Gy剂量下4h与对照比无显着性差异,12h迅速下降,24-72h逐渐恢复至接近本底水平;AEN基因在4h开始逐渐升高,24h达到峰值4.10,随后逐渐下降,在8-72h表现出一定的差异性(P<0.05)。TRIAP1、RPS27L和AEN基因在0Gy、2Gy和8Gy照射下无显着剂量依赖关系。结论:1建立了Taq Man探针两步法的实时荧光定量PCR的检测方法。2γ射线不同剂量照射人外周血后培养不同时间,TRIAP1、RPS27L和AEN在不同的时间点表达水平显着升高并且具有较好的剂量依赖关系,提示这3个辐射敏感基因具有作为辐射损伤生物标志物的潜力,适用于辐射损伤早期生物剂量的估算。TCL1A、SPIB基因时间效应和剂量效应关系不显着,C12orf5基因相对表达变化水平低,这3个基因不具有作为辐射敏感基因的潜力。3通过本底水平的检测,TRIAP1、RPS27L和AEN基因本底波动范围小、本底水平均一且不受年龄和性别因素的影响,满足作为生物标志物的要求。4通过小鼠整体照射的研究发现,TRIAP1、RPS27L和AEN基因在小鼠体内均有响应。
参考文献：
[1]. GADD45基因表达作为生物剂量计的可行性研究[D]. 徐丽昕. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[2]. 基于辐射诱发染色体和DNA损伤的生物剂量计可行性研究[D]. 蒋亚齐. 苏州大学. 2007
[3]. GADD45A和NM23-H1组合检测作为电离辐射生物剂量计可行性研究[J]. 王平, 韩林, 姜峰, 吕玉民. 中国职业医学. 2013
[4]. 辐射可诱导基因Gadd45和p21～（WAF1）作为辐射生物剂量计的实验室评估[D]. 刘斌. 中国人民解放军军事医学科学院. 2007
[5]. 辐射敏感基因作为潜在生物剂量计的实验研究[D]. 李孝鑫. 安徽医科大学. 2016