摘要：目的：探讨人在接触不同检材、时间长短、不同力度所留下的指印中脱落细胞的遗留概率以及实际中手印DNA的检出概率，为侦查提取提供参考。方法：细胞粘取法、苏木精伊红细胞染色观察法、棉签擦拭脱落细胞、在不同客体上接触按不同时间长短遗留下指印，研究不同客体的细胞遗留概率的时间曲线。理念：只要观察得到细胞就证明有DNA的存在。结论：手印DNA为微量接触性生物检材，其遗留概率一般较低且呈随着接触时间越长、力度越大，提取到带核脱落细胞的概率越大；与粘性客体接触的观察到的带核脱落细胞较多；手印DNA的实际提取检出率低，接触DNA的检验成功率与遗留客体有直接相关性，粗糙客体表面比光滑客体表面遗留的DNA多。此外，提取也和PCR扩增条件等对DNA的检测也有影响。
关键词：手印DNA；生物检材；微量物证；接触性；细胞；PCR扩增
1 引言
随着法律的完善和犯罪嫌疑人反侦察能力的提高，为打击犯罪，确保正确的定罪量刑惩罚犯罪保护不犯罪，对犯罪证据的要求也越来越高，如何强有力的证明犯罪分子的犯罪行为与如何避免冤假错案成为我们的研究的对象，新形势下，随科技的发展，生物检材DNA成为了我们认定犯罪的一个强有力的武器。
犯罪现场的手印痕迹是犯罪嫌疑人手印与其犯罪行为有着内在联系的客观事实。手印痕迹[1]是案发现场留下的犯罪痕迹的重要组成部分，在犯罪现场中，手印是出现频率相对较高的一种犯罪痕迹。通过对案发现场手印痕迹的发现、提取以及利用专业技术对印痕进行认真检验分析能够给办案人员提供侦查方向和线索，这样能够有效地将办案部门的侦察范围缩小，通过指纹比对找出犯罪嫌疑人，为案情的侦破提供重要的证据；此外还有一项重要的证据可为侦查提供方向，对犯罪嫌疑人起到认定作用，即与指印相伴的脱落细胞所带的DNA。
在法医的实际检案工作中[2]，分析接触性检材脱落表皮细胞的DNA具有非常重要的意义。在日常生活中只要人体表皮组织与物体紧密、频繁接触，就容易留下脱落表皮细胞。对于这类检材上的DNA，在法医物证检验过程中，在提取处理纯化后进行纯化扩增，STR分析检测[3]等系列操作后可将DNA进行检验比对认定犯罪嫌疑人。
汗潜指印[4]是手指末端汗液与客体接触后形成，由于其特殊的纹路结构，指印鉴定在侦查破案中起着举足轻重的作用。但是在有些刑事案件中[5]，经常会遇到指印残缺不全、特征点少或模糊不清等，难以进行个人识别，此时能否进一步进行检验，获得其它个人生物学特异性的信息非常重要。这方面的研究已经引起人们的重视。指印认定与指印上的DNA认定互补互助，共同认定犯罪，加强物证的证据性。
本实验小组决定以初探细胞遗留概率以证明代表指印DNA的遗留概率为目的，对不同具有代表的客体进行手印的遗留与手印脱落细胞的提取与检验。
2 实验部分
（一）不同客体上手印脱落细胞的提取与观察
1.实验器材、试剂与材料
1.1实验器材
XD-210显微镜、载玻片、盖玻片、得力透明胶带、棉签（正见牌）、乳胶手套、洁净的剪刀
1.2实验试剂
苏木精染色剂（C爱思：517-28-2分析纯AR试剂）、伊红染色剂（上海三爱思试剂有限公司）、硫酸铝钾（福晨精细化工牌）、生理盐水
1.3实验材料
皮带、矿泉水瓶、雨伞硬手把、普通光滑瓷砖、硬纸皮、得力透明胶带、D盾牌棉签
2.实验原理与步骤
（1）探究不同客体上手印脱落细胞提取情况关于时间的变化情况
实验原理
用细胞粘取法，根据透明胶具有的粘性，用其粘取细胞后转移到载玻片；采用苏木精伊红染色法，由于细胞核和细胞质对不同染色剂的亲和力不同，使得细胞染色中细胞结构更为明显，染色后所得细胞颜色为浅红色的细胞质，蓝紫色的细胞核；先用低倍显微镜观察细胞存在情况，再用高倍镜放大观察确认是否为带核的脱落细胞；初步检验指印中的脱落细胞存在情况，以初步判断指印中DNA的价值，因为存在带核脱落细胞即存在脱落DNA；只有能够初步观察检测到手印痕迹中有细胞存在，才能对指印上的遗留DNA进行进一步检测与比对认定。本实验以观察统计探索接触方式对遗留指印中脱落细胞情况为主。
实验步骤
A．染色剂配置：称取0.5g苏木精，5.0g 铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸混匀过滤后即成母液。可长保存。用蒸馏水以 1：20稀释即成工作液，可用很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。【鄂征（1995）改良的Mayer法】[4]；伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇即成工作液。
B.将皮带、矿泉水瓶、雨伞硬手把、普通光滑瓷砖水洗干净后用洁净的纸巾擦干；直接用洁净纸巾擦拭干净，以避免客体上原有的接触性细胞影响实验。将皮带、矿泉水瓶、雨伞硬手把、普通光滑瓷砖、硬纸皮等客体表面用马克笔分为不同区域，每个区域为指印大小，共14个区域，标记清楚按压时间，30s、1min、2min、3min、4min、5min、6min各两个。
C.由同一人使用一次性手套捂汗后，用不同手指分别在各个划定区域根据标记时间捺一枚汗潜手印，每次捺指印前都双手摩擦后重新捂汗再捺。
D.穿戴手套，使用透明胶带于手印处重复多次粘取至粘性减弱，转移至载玻片上盖上盖玻片。做好捺印时长标记。
E.先将苏木精染色剂滴于盖玻片一边，用滤纸于另一边吸收引流，待染色剂充满玻片，对所提样本进行染色10分钟，再使用滤纸将伊红染色剂吸取干净，同样操作用70%乙醇伊红染色剂进行染色1分钟。最后使用滤纸洗干净染色剂后将玻片置于显微镜下观察。
F.观察和记录的玻片上的脱落细胞的存在数量情况并拍照记录。
G.统计数据，列出表格，寻找关于时间变化的规律并分析实验结果。
H.于透明胶布粘性面上直接捺手印30s、1min、2min、3min、4min、5min、6min各两个，转移至载玻片上盖上盖玻片，做好捺印时长标记。
I.重复第五步至第七部实验操作。
（2）探究手印上脱落细胞情况与提取间隔的时间长短的关系
实验原理
手印形成后，手印上的物质裸露，随着时间越长，由于种种客观原因，理论上手印物质的量会受影响，其中的脱落细胞亦是如此。因此对皮革上的汗潜手印采用间隔时间不同提取染色观察对比方法，探究手印上脱落细胞情况与提取间隔的时间长短的关系。其原理与方法跟探究不同客体上手印脱落细胞关于时间的变化情况相同。
实验步骤
A.将皮革书本封面洗干净后用洁净纸巾擦干，划分出6个指印大小的区域，，并做好标记。
B.同一人将双手捂汗后，用六个不同手指同时捺印6分钟，共6枚指印
C.将所留指印2枚指印捺印后即刻提取，两枚指印捺印后间隔12小时后提取，两枚指印捺印后间隔24小时后提取，两枚指印捺印后36小时后提取。提取方法为透明胶带粘取法，与探究不同客体上手印脱落细胞关于时间的变化情况时所采取方法相同。
D.先将苏木精染色剂滴于盖玻片一边，用滤纸于另一边吸收引流，待染色剂充满玻片，对所提样本进行染色10分钟，再使用滤纸将伊红染色剂吸取干净，同样操作用70%乙醇伊红染色剂进行染色1分钟。最后使用滤纸吸干净染色剂后将玻片置于显微镜下观察，重复上述步骤。
E.观察和记录的玻片上的脱落细胞的存在数量情况并拍照记录并统计数据，列出表格，寻找手印上脱落细胞情况与提取间隔的时间长短的关系并分析实验结果。
（3）探究手印脱落细胞数与摩擦力度的关系
实验原理
根据牛顿第三定律：作用力与反作用力相等的关系。利用矿泉水瓶的重力获取实验中塑料表面与手的摩擦力的大小情况。通过改变水瓶中水的质量而改变摩擦力大小，探究手印脱落细胞的存在情况进而了解手印DNA的存在情况。
实验步骤
A.将一个容量为2L的塑料饮料瓶用清水洗干净，用洁净的纸巾擦干，避免客体表面原有接触性脱落细胞的影响。
B.用手握装不同量水（0ml、500ml、1000ml、1500ml、2000ml）的瓶悬空静止3分钟，每次重新清洗擦干，标记出指印遗留位置。
C.采用透明胶带提取法与前两个实验操作一样，提取后转移至玻片并做好标记。
D.采用伊红苏木精染色法，与前两个实验一样，将所提样本进行染色后置于显微镜下观察。
E.观察和记录的玻片上的脱落细胞的存在数量情况并拍照记录并统计数据，列出表格，寻找手印上脱落细胞情况与提取间隔的时间长短的关系并分析实验结果。
（二）手印DNA的检测
1.实验器材、试剂与材料
1.1实验器材
喷雾式分装瓶、公安专用细胞粘取器（荣华生物）、FW-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（博坤生物公司）、微量生物物证DNA自动化提取纯化系统（基础版）BK-FW-48（博坤生物公司）、kingfish纯化仪、Qiagen 24plex试剂盒和veriti型扩增仪（ABI，USA）、10 UL扩增体系中引物混合物：模板DNA为6：4/4：6、3500XL型基因分析仪（ABI，USA）、GeneMapper IDX1.2软件
1.2实验试剂
蒸馏水、丙酮、乙醇、DNA检测使用试剂
1.3实验材料
玻璃、纸张、木块
2.实验原理与步骤
实验原理
磁珠法核酸纯化技术[6]采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团使得它能与核酸发生吸附反应，进而对DNA分子进行纯化。
PCR-聚合酶链式反应[8]，能够选择性扩增某一段DNA序列。首先使待扩增的模板DNA加热变性使之成为单链，随后所加入的引物与其互补的序列进行杂交，在dNTPs和Taq酶存在时合成模板，即DNA的互补链。反应完成后，将反应的混合物加热变性，降温使过量的引物又开始合成反应。这样延伸—变性—退火—延伸重复多次循环，便使得所需要的DNA片段得以特异性的扩增。
DNA电泳技术[9]，DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，因此向阳极移动。其迁移速率与其相对分子量成反比。由此达到分离混合物的目的。
STR是由2-6个碱基构成一个核心序列[10]，具有高度多态性。其多态性由核心序列重复数目的变化产生。对于不同的个体，其染色体上同一位置处的核心序列重复次数不可能同的。因此我们可以通过对其DNA进行STR分型分析，进而明确区分个体与个体的不同。美国建立的CODIS系统选定了13个STR基因座，他们在7个群体中平均匹配概率小于亿万分之一，除同卵双生子外，没有两个个体拥有相同的图谱。
实验步骤
A.制作样本，志愿者在玻璃、纸张、木块客体上按压并遗留指印并擦取志愿者的口腔拭子。
B.样本提取，将丙酮提取液装于喷雾分装瓶，控制棉签沾有提取液的量，使用棉签擦拭脱落细胞[15]，用沾有丙酮提取液的棉签和干棉前先后对手印遗留处进行擦拭，擦拭后将棉签头用滤纸折叠包装，装于送检包装袋。
C.将转移了脱落细胞的棉签等物质置于0.5ml离心中，加入裂解液300ul（含PK成分），旋涡振荡混匀后，95℃20min，12000rpm离心2min，取上层清液，加入磁珠封装试剂条（FL与FW超微量，博坤生物）中，加入超纯水30ul，使用kingfish纯化仪，运行53min进行纯化，吸取DNA溶液，4℃保存待用。
D.采用Profile Plus和Qiagen 24plex试剂盒、veriti型扩增仪（ABI，USA），扩增体系中引物混合物：模板DNA为6：4/6：8，热循环条件：95℃预变性11min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，循环28次/29次，最后60℃延伸45min。
E.分型在3500XL型基因分析仪（ABI，USA）上进行，用GeneMapper IDX1.2软件分析结果。
3 实验结果与讨论
（一）实验结果
不同客体上手印脱落细胞的提取与观察实验结果
本研究对不同客体上遗留手印上的脱落细胞进行提取染色观察，记录不同客体表面上手印脱落细胞的提取情况关于时间的变化；对皮革客体上指印遗留距离提取时间长短对手印脱落细胞提取情况的影响；对手印脱落细胞提取情况与摩擦力度的关系，将细胞提取数分别用：“+++”、“++”、“+”、“-”。其中“+++”表示所提取的手印带核脱落细胞数量很多，手印DNA检测的成功率很高。“++”表示所提取的手印带核脱落细胞数量较多，手印DNA检测的成功率较高。“+”表示所提取的手印带核脱落细胞数量较少，较难进行手印DNA检测。“-”表示无观察到手印带核脱落细胞。具体显现效果如下：
（1）不同客体上手印脱落细胞提取情况关于时间的变化情况
通过HE染色，显微镜观察，我们发现与客体接触时，人们容易将皮肤上皮脱落细胞遗留在各种客体上，且数量也越多。但是脱落的上皮细胞多为角质化的，细胞多为扁平多边形，细胞质染色浅，薄而透明，有的出现角化蛋白；细胞核居中固缩，多数已消失。
根据观察统计可知在粘性面上所提取的脱落细胞数量多，其中带核脱落细胞数量也相应较多，而在非粘性面客体上，表面粗糙的客体，脱落细胞和带核脱落细胞数量多于光滑客体。其中在客体上结果观察到脱落细胞的量均随接触时间的增长而增多。见表1.
表1 不同客体上不同按压时间所提提取手印上带核脱落细胞情况
（2）探究指印上脱落细胞情况与提取间隔的时间长短的关系
通过HE染色，显微镜观察，我们发现皮肤接触皮革客体后所留的指印上，其脱落细胞形状等与其他客体相似。在按压指印后即刻提取观察，其观察到的脱落细胞核带核脱落细胞数量较多；在间隔12小时后提取观察的，其观察到手印脱落细胞核带核脱落细胞数量与即刻提取变化不大；而在间隔24小时后提取观察的手印脱落细胞和带核脱落细胞数量相对较少，再间隔36小时后提取观察的脱落细胞和带核脱落细胞的数量最少。由此可知：随着提取时间隔离指印形成时间越久，手印脱落细胞的数量越少，带核脱落细胞的存在数量也随着减少，见表2。
表2 皮革封面上手印带核脱落细胞观察统计表
（3）探究手印脱落细胞数与摩擦力度的关系
通过HE染色，显微镜观察，在质量为0kg-2kg（以0.5kg递增）的塑料水瓶上所留的指印，由于水瓶的重要等于手与瓶子表面的摩擦力，在所留指印上提取观察到的手印脱落细胞数量和带核脱落细胞的数量随着瓶子质量的增大而增多，但其脱落的上皮细胞多为角质化的，细胞多为扁平多边形，细胞质染色浅，薄而透明，有的出现角化蛋白；细胞核居中固缩，多数已消失。见表3。
表3 不同力度按压指印上带核脱落细胞数量统计表
手印DNA的检测结果
（1）探究实际在玻璃、纸张、木块客体上手印DNA检出结果
通过DNA检测分析发现，实际上手印DNA的完全检出率低。手印DNA的检验成功率与遗留客体有直接相关性，粗糙客体上指印遗留的DNA多，完全检出率高。其中木块上指印DNA的完全检出率大于纸张上的大于玻璃上的。此外通过实验发现FW超微量DNA提取试剂盒的检出效果要好于FLDNA提取试剂盒。图1为口腔拭子、玻璃上指印DNA、纸张上指印DNA、木块上指印DNA的检验图谱，由于遗留DNA的量的差异，检验灵敏度有明显差异，表现在图谱上的相对荧光强度和噪音水平。
图1 DNA检验图谱
（1：口腔拭子2：玻璃上手印 3：纸张上指印 4：木块上手印）
（2）检材的预处理结果
图2为玻璃上按压30s，使用丙酮提取液二次提取法所提取DNA的检验图谱、玻璃上按压2min，使用蒸馏水提取液二次提取法所提取DNA的检验图谱和玻璃上按压2min，使用乙醇提取液二次提取法所提取DNA的检验图谱。实验发现使用丙酮当提取液的提取效果相对于蒸馏水和乙醇效果较好，在按压时间较短的情况下，其所提取的DNA检测图谱中所检测出的等位基因座数量高于蒸馏水和乙醇作为为提取液所提取的DNA检测图谱中所检测出的等位基因座。此外使用提取液的量对DNA的提取检测有极大影响，实验中第一次使用两滴提取液对指印DNA进行提取，DNA检测则无结果，故没有谱图。第二次则是控制提取的量的结果，使用喷雾分装瓶距离棉签10厘米喷两次，其提取后可检测结果，如下：
图2 DNA检验图谱（左：30s，丙酮；中：2min，水；右2min，乙醇）
（3）DNA的扩增结果
图3是在采用条件为：体系中引物量：DNA模板量为6：4，循环28次和体系中引物量：DNA模板量为6：8，循环29次，PCR扩增后的DNA检测图谱，从图谱中可看出，提高DNA模板量和循环次数会使得DNA的STR分型图谱中的相关荧光度增强，其中条件6：8，循环29次的PCR扩增后，其DNA检测图谱中的相关荧光强度可高达700，远高于条件为6：4，循环28次的PCR扩增检测结果。此外增加DNA模板量和循环次数会使得缺失等位基因位点会出现增加，但有的也会发生错乱和缺失，因此对于PCR扩增的操作与条件设置需谨慎处置。
图3 DNA检测图谱（左图：6：4，循环28次；右图：6：8，循环29次）
（二）实验讨论
1.不同客体上手印脱落细胞的提取与观察实验结果讨论
（1）在皮带上，虽然表面粗糙，但由于皮带为软客体，观察到的手印带核脱落细胞数量不多；在矿泉水瓶上，由于其具有凹凸花纹且较硬，观察到的手印带核脱落细胞数量较多；在雨伞把柄上，由于其光滑有硬，在其表面上提取观察到的手印带核细胞数量最少且不稳定；在光滑瓷砖上，虽然看着光滑，由于其表面某种物质，在瓷砖表面按压留样时感觉手指对其表面粘性大，故其表面所提取观察的手印带核脱落细胞异常多，带核脱落细胞也随之增多；在硬纸皮上，由于客体成分特殊，纸皮成分容易随着胶带被粘起与细胞混合，在细胞观察中有影响，显微镜观察中可发现纸张纤维，其中手印带核脱落细胞数量不多；在透明胶粘性面，由于粘性较大，在其表面提取观察到的手印脱落细胞数量多，且在按压1-6分钟的指印上均可发现有带核脱落细胞的存在，且数量较多。实验中在客体处理时，无法将瓷砖表面清洗干净，导致表面粘性影响实验结果。
（2）手印形成后对其手印脱落细胞即刻进行提取观察的，由于时间间隔时间短，细胞降解和因为其他方式而丢失的几率变小。手印脱落细胞较多和带核脱落细胞较多。而随着间隔时间越长，由于细胞发生了降解，受污染或者掉落等因素，其提取观察的手印脱落细胞随之减少。
（3）第三个实验中由于接触时摩擦越大，使得手部皮肤表面的细胞非自然脱落的概率越大，所以随着水瓶中水的质量的增加，即手与瓶身的摩擦力越大，所以所提取观察到的手印脱落细胞数量越多。但实验过程中利用瓶子中水的重力等量于手与瓶子的摩擦力，但忽略瓶子自身重力；在实验中只采用了量筒测量水的体积，没有实验电子秤对瓶子和水的重量进行测量，这样将到导致扩大实验误差。
2.手印DNA的检测结果讨论
（1）提取DNA后对DNA进行检测分析的时间对结果有所影响，即刻提取可避免DNA在分析前发生DNA模板的降解和污染上PCR反应的抑制物[11]。这两个因素会导致PCR反应彻底失败或者对大片段PCR产物检测时的灵敏度大大降低，因此实验中提取后隔两天在检验，其完全检出率低的原因很可能是因为进行DNA分析的时间距离提取时间太长，期间发生了DNA模板的降解。其中使用滤纸包装保护，也可能使得部分DNA转移至滤纸上，故此降低DNA的检出率。因此在现实刑事案件勘查中，需要注意对微量生[12]物检材的提取与保护，避免酶、真菌、细菌、昆虫、血色素、靛青染料等对DNA造成降解和抑制PCR反应影响，现场勘查需要谨慎操作。
（2）不同提取方法的提取效率不同，生物检材DNA的提取方法有多种，通常有用棉签擦拭脱落细胞、吸附法提取、脱落细胞粘取器粘取或者直接原物提取（剪取法）。不同的提取方法对于类似手印DNA等量微的检材，因为其量微，所以较为容易丢失。其中在使用棉签提取时，一般采用的是二次提取方法，即用两根小棉签，先用第一根湿棉签的顶端在客体表面轻轻擦拭，同时边擦拭边旋转，再用第二根干棉签重复上述动作，对细胞进行提取。其中湿棉签所用的提取液，其种类与量的不同，对提取DNA的效率也有影响，进而影响到手印DNA的提取检出率。况且基本上各种提取方法均无法百分百将客体表面的手印DNA完全提取；
（3）在检测DNA时，选择扩增体系中引物混合物：模板DNA的量和热循环次数对DNA检测分析结果也有较大影响，提高DNA模板量和循环次数会使得STR分型图谱中的相关荧光高度增大，其缺失等位基因位点会出现增加，但也会使得有的出现基因位点错误或者缺失，因此在选择体系模板量和循环次数对DNA进行STR分型分析时需要谨慎处理。
（4）从图谱中可知，大多DNA检测结果都为部分检出，大多基因座的等位基因与口腔拭子相符合，说明手印脱落细胞中核DNA可能为完整的，检测率低也可能是由于PCR扩增时其引物与DNA模板量匹配不上的原因。
（5）由于客体表面的光滑程度会影响遗留脱落细胞的数量，粗糙客体表面比光滑客体表面的摩擦力大，遗留的DNA多，导致木材上指印DNA的完全检出率高于纸张，而纸张上手印DNA的检出率高于玻璃。
4 小结：
以上几项研究是结合公安基层工作的情况，探讨如何有效将手印DNA检测分析技术应用于实际案件侦查中。在粘性客体表面上的手印，其DNA遗留的几率很大。现场勘查中除了提取粘性客体上面的手印进行鉴别侦查外，手印上的DNA物质也有助于侦查。若为非粘性粗糙客体，其手印DNA也相对含量较高，在显现提取到残缺手印后可以提取其上面的DNA物质进行鉴别作为普通。如果是光滑客体表面上的手印，其手印DNA的遗留概率较低，在现场勘查中应重点放在指印的提取与鉴别，如果同时为陈旧的手印痕迹，则无必要浪费人力物力。
现场勘查中是否提取手印上的DNA物质，可以根据常识判断犯罪嫌疑人使用工具的力度和与工具的接触时间，进而判断手印DNA的遗留概率。一般需要较大力度进行使用的工具，如：螺丝刀把柄，铁锤把柄，刀把等，其上面遗留的手印上，DNA遗留的概率越高。而且随着使用工具的时间越长，犯罪嫌疑人于工具上遗留的手印上的DNA含量会越高。
在进行PCR扩增时设置其DNA模板量比例和循环条件时，随着模板量的增加或循环次数的增加，DNA检出结果其基因座上的相关荧光度会增强。
在进行DNA检测分析时，使用二次提取法加磁珠法的提取检出效率相对较高。其中二次提取法中使用丙酮当提取液，其效果会相对于蒸馏水和乙醇较好。
手印DNA的最佳检测时间是提取后即刻进行检测分析，随着置放时间越长，检测效果越差，因此物证鉴定分析时要注重检测顺序和效率。
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论文作者:黄焕新,黄小殷,刘桂华,邓宗钧
论文发表刊物:《基层建设》2019年第10期
论文发表时间:2019/7/24
标签：手印论文; 细胞论文; 指印论文; 客体论文; 时间论文; 染色剂论文; 棉签论文; 《基层建设》2019年第10期论文;