郭建中[1]2004年在《基质金属蛋白酶在大鼠心梗模型左心室重塑中的作用》文中认为目的：采用大鼠心梗模型，观察基质金属蛋白酶-2，9(MMP-2，9)和组织金属蛋白酶抑制酶-1(TIMP-1)的变化规律，以及在左心室重塑过程中的作用，并探讨外源性基质金属蛋白酶抑制剂(多西环素，Doxycycline)对心梗后左心室功能的保护作用。方法：通过结扎SD大鼠冠状动脉前降支建立心梗模型。分为对照组、心梗组(I组)和治疗组(D组，术前两天至术后两天，口服Doxycycline，30mg／kg／天)，分别于术后第一天、术后一周、术后两周、术后四周取心肌组织，采用免疫组化测定胶原含量和Ⅰ／Ⅲ胶原比例，酶谱法测定心梗后MMP-2，9活性蛋白的表达规律，Western Blotting进一步确定酶谱法中所消化条带蛋白的属性，逆转录-聚合链反应法(RT-PCR)测定心梗后MMP-2，9和TIMP-1的mRNA的变化规律，运用Acuson Sequoia 512超声心动图机分别测定心梗组、治疗组在两周和四周时左室前壁、后壁厚度以及左心室舒张末内径和左室射血分数。结果：心梗后SD大鼠心肌内胶原含量在心梗后第2，4周增加(P＜0.01，P＜0.005)，Ⅰ／Ⅲ胶原比例同时期下降(P＜0.05)，MMP-2，9蛋白水平和mRNA水平在心梗后活性增强、表达增加，TIMP-1蛋白含量解放军军医进修学院，‘血管外科博士论文基质金属蛋白酶在大鼠心梗模型左心室重塑中的作用减少。而经多西环素治疗后，与同期未治疗组对比，胶原含量明显减少(P<0.05I/川胶原比例下降得以改善(P<0.05)MMP一2，9蛋白和mRNA在心梗后活性减少，TIMP一1蛋白含量和mRNA转录无明显变化。超声心动图显示治疗组心功能在术后四周得以改善。结论SD大鼠心梗后心肌组织内MMP一2，9的mRNA转录增加TIMP一1 mRNA转录减少，MMP一2，9活性增高和蛋白含量增加TIMP一1蛋白表达减少，胶原含量增加，I/111胶原比例下降，是心室重塑机制的重要组成部分。Doxyeyeline治疗组MMp一2，9的mRNA转录减少，MMP一2，9活性降低，胶原含量减少，J/川胶原比例恢复，这些影响可能是其改善心梗后心室重塑的机制之一。
史沛[2]2015年在《MMP-8在心肌缺血再灌注损伤和心室重塑中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨血清MMP-8表达与STEMI患者心功能指标、心室重塑指标的相关性以及在缺血再灌注损伤和心室重塑中的作用和机制。方法:选取经PCI手术的STEMI患者通过超声心动图检查射血分数(EF)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室厚度、左室舒张末期内径(LVEDD)等心功能指标。ELISA法检测MMP-2、MMP-8、MMP-9以及TIMP-1以及I型和III型胶原含量。分析血清中MMP-8与射血分数、心室内径等心室重塑指标的相关性。建立大鼠急性心肌缺血再灌注模型,构建MMP-8 si RNA慢病毒,并分为对照组、缺血再灌注组(I/R)、I/R+control-si RNA组、I/R+MMP-8-si RNA组。观察并记录术后28d各组大鼠生存情况,M型超声评价各组大鼠心功能改变;免疫组化评估各组大鼠心肌纤维化;Western Blot检测在大鼠I/R术后1,7,14,28d心肌中MMP-8的表达。间接免疫荧光定位心肌MMP-8的表达。实时荧光定量PCR检测IFN-r、IL-6、TNF-α和CD163、MRC1和TGFβ的表达情况。分别分离及培养大鼠巨噬细胞和成纤维细胞。分为对照组,control-si RNA,MMP-8si RNA组。Real-time PCR检测M1和M2标记物的变化。采用Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达水平。结果:左室射血分数(EF)在术后出现明显减低(P<0.05);术后左室收缩末期内径(LVESD)和左室舒张末期内径(LVEDD)明显增加(P<0.05),左室前壁厚度(LVAWT)和左室后壁厚度(LVPWT)在术后检测发现厚度减小,室壁变薄(P<0.05)。STEMI发作时MMP-2和MMP-9含量明显增加(P<0.05);在PCI术后,MMP-2和MMP-9含量进一步增加(P<0.01)。与之相反,TIMP-1在STEMI发作时和PCI治疗后检测数值与正常对照组比较显着降低(P<0.05)。STEMI发作时I型胶原含量明显增加,PCI术后,I型胶原含量进一步增加(P<0.01)。III型胶原变化不具有统计学意义(P>0.05)。STEMI发作时MMP-8含量明显增加(P<0.05);PCI术后,MMP-8含量明显增加(P<0.05);术前及术后3个月,MMP-8与左室射血分数呈负相关(r=-0.458,P<0.05)。MMP-8与左室收缩末期内径和左室舒张末期内径的变化呈正相关(r=0.54,P<0.05;r=0.423,P<0.05);MMP-8与左室前壁厚度和左室后壁厚度呈负相关(r=-0.627,P<0.05;r=-0.716,P<0.05)。I/R+MMP-8-si RNA组大鼠生存率达80%,生存率显着提高,与I/R组比较,具有统计学意义(P<0.05)。I/R组和I/R+control-si RNA组左室收缩末期内径(LVESD)和左室舒张末期内径(LVEDD)增加(P<0.05),对I/R组大鼠进行MMP-8-si RNA干预后,可见两个指标减少,与I/R组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。类似变化可见于左心室质量指数(left ventricular mass index,LVMI)。.心肌Ⅰ型胶原纤维在I/R和I/R+control-si RNA组后显着增加(P<0.01);对I/R组大鼠进行MMP-8-si RNA干预后,可见Ⅰ型胶原纤维和Ⅲ型胶原纤维含量显着减少,与I/R组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。I/R术后,MMP-8蛋白表达明显增加,术后14d和28天表达增加明显,与术后1天比较,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.01)。当缺血再灌注之后,可见心肌巨噬细胞出现MMP-8定位。当缺血再灌注时IFN-r、IL-6、TNF-α急剧增加(P<0.05;P<0.01),MMP-8-si RNA干预后,可见IFN-r、IL-6、TNF-α不同程度的减低,与I/R组大鼠比较,差异具有统计学意义(P<0.05);M2巨噬细胞上述变化与M1巨噬细胞相反。在炎症刺激中,IFN-r、IL-6、TNF-α显著多于CD163、MRC1和TGFβ,经MMP-8-si RNA干预后,可见IFN-r、IL-6、TNF-α有不同程度的减低,与对照组细胞比较,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与M1巨噬细胞结果相反,经MMP-8-si RNA干预后,可见到CD163、MRC1和TGFβ不同程度的增加,与对照组细胞比较,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。炎性环境中可见α-平滑肌肌动蛋白表达较多,MMP-8-si RNA干预后,成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白表达明显减少,与对照组比较差异具有显着统计学意义(P<0.05)。炎性环境中可见纤维连接蛋白表达较少,MMP-8-si RNA干预后,纤维连接蛋白表达增加,与对照组比较差异具有显着统计学意义(P<0.05)。结论:1.急性ST段抬高性心肌梗死经PCI治疗可发生心室重塑。2.MMP-2和MMP-9含量增加,TIMP-1分泌减少,两者的比例改变可能参与心室重塑。3.心肌重构中,心肌组织细胞外基质的合成分泌以及降解平衡被打破,胶原纤维等细胞外基质增加。4.MMP-8可作为心肌缺血再灌注的心功能检测指标之一。5.MMP-8参与急性ST段抬高性心肌梗死发作以及心室重塑过程。6.缺血再灌注损伤,可引起机体一般状态及体重变化以及心室功能恶化。7.缺血再灌注损伤发生心室重塑,以I型胶原和III型胶原增生为主,其中I型胶原增生为更明显,导致心室功能恶化。8.以MMP-8 si RNA作为靶标可减轻缺血再灌注损伤和心室重构,改善心室功能。9.缺血再灌注损伤和心室重构中巨噬细胞可分泌MMP-8并参与I/R过程。10.缺血再灌注损伤以M1型巨噬细胞为主,在MMP-8 si RNA作用下发生极化,使M1型向M2型巨噬细胞转化;减轻炎症反应,可能对抑制缺血再灌注的损伤,逆转血管重构有较好作用。11.炎性环境中,以M1型巨噬细胞为主,抑制MMP-8,可促进M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞,削弱M1型细胞极化所带来的高炎性反应状态。12.MMP-8si RNA可抑制成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,减轻心室重塑的发生。
郑熙[3]2017年在《联合TK-1和TIMP-1基因过表达对大鼠心肌梗死后炎症因子的影响》文中认为目的本研究通过制备大鼠急性心肌梗死动物模型,观察并比较重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶1基因(TK-1)或人基质金属蛋白酶组织抑制物1基因(TIMP-1)或联合基因(TK-1和TIMP-1)转移对心肌梗死后炎症因子表达的影响,探讨可能的作用机制。方法1、本研究采用经典的冠脉结扎法,结扎冠状动脉左前降支建立SD(Sprague Dawley)大鼠心肌梗死模型,取250-300g雄性SD大鼠随机分为:假手术组,冠脉结扎组。术中记录大鼠心电图,术后7天采用心脏超声检测大鼠心功能,随后处死大鼠取其心肌组织,采用HE染色观察心肌梗死区域炎症情况,TTC染色观察心肌梗死的面积。2、本研究采用经典冠脉结扎法,建立SD大鼠心肌梗死模型,取250-300g雄性SD大鼠随机分为6组:假手术组,PBS组,对照病毒组,TK-1组,TIMP-1组,联合基因组。除假手术组仅用丝线穿过左前降支外,其余五组均用丝线缝扎左前降支以制备急性心肌梗死模型,并分别于心肌梗死交界区注射磷酸盐缓冲液(100μl)、照病毒载体、TK-1载体、TIMP-1载体或联合基因载体(病毒量1×1010pfu/只,保存于100μl的病毒稀释液)。术后28天,采用心脏超声检测大鼠心功能,随后处死大鼠取其心肌组织,免疫荧光共聚焦检测联合基因组的目的蛋白表达,采用HE染色观察心肌梗死区域形态学变化,TTC染色观察心肌梗死的面积,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫组化检测MIF、NF-κB、MMP-2及MMP-9的表达情况,蛋白免疫印迹法检测TK-1、TIMP-1、MIF、NF-κB、MMP-2及MMP-9的蛋白表达水平。结果1、术中大鼠心电图可见,结扎冠状动脉左前降支后心电图上R波和T波融合成帐篷波,ST段弓背上抬,证实成功构建大鼠心肌梗死模型。术后7天,大鼠心肌组织HE染色切片可见假手术组炎症浸润明显少于冠脉结扎组;与假手术组大鼠相比,冠脉结扎组大鼠的左室舒张期内径(LVIDd)升高、左室收缩期内径(LVIDs)升高、短轴缩短率(FS)降低、射血分数(EF)降低(P<0.05),且假手术组大鼠心肌组织经TTC染色示心肌梗死面积小于冠脉结扎组(P<0.05)。冠脉结扎心梗模型的存活率约为80%。2、联合基因组大鼠心肌组织经免疫荧光染色,于共聚焦显微镜下可见红色荧光和绿色荧光,提示TK-1与TIMP-1基因均转染成功。经蛋白免疫印迹法检测各组大鼠心肌组织TK-1与TIMP-1蛋白表达情况,结果提示仅TK-1组及联合基因组有TK-1蛋白表达,仅TIMP-1组及联合基因组有TIMP-1蛋白表达,且单基因组与联合双基因组表达差异无统计学意义(P>0.05),其余各组均无TK-1及TIMP-1蛋白表达。3、经28天干预后,各组大鼠心功能、心肌梗死面积比较:与假手术组相比,PBS组大鼠的LVIDd与LVIDs升高、FS与EF降低(P<0.05),心梗区域有明显的炎症细胞浸润,心肌梗死面积增大(P<0.05),心肌细胞凋亡指数升高(P<0.05)。PBS组与对照病毒组对比各项结果差异均无统计学意义(P>0.05)。与PBS组相比,TK-1组、TIMP-1组或联合基因组大鼠的LVIDd有所降低但差异无统计学意义(P>0.05)、LVIDs降低、FS与EF升高,心肌梗死面积减少,心肌细胞凋亡指数降低(P<0.05)。与TK-1组或TIMP-1组相比,联合基因组大鼠的LVIDd显着降低、FS与EF显着升高,心肌梗死面积进一步减少,心肌细胞凋亡指数显着降低(P<0.05)。4、经28天干预后,各组大鼠心肌组织的炎症因子(MMP-2及MMP-9)和NF-κB、MIF表达水平,结果提示:与假手术组相比,PBS组大鼠心肌组织中炎症因子和NF-κB、MIF的表达水平均明显上升(均P<0.05)。PBS组与对照病毒组相比,各项表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。与PBS组相比,TK-1组、TIMP-1组或联合基因组,均能显着减少炎症因子和NF-κB、MIF的表达(均P<0.05)。与TK-1组或TIMP-1组相比,联合基因组可显着降低炎症因子和NF-κB、MIF的表达水平(均P<0.05)。结论1、成功构建大鼠心肌梗死模型,携带人TK-1或TIMP-1基因的重组腺病毒载体转染心梗大鼠心肌组织后,且TK-1或TIMP-1基因均获得稳定表达。携带联合基因(TK-1和TIMP-1)的重组腺病毒载体转染后,目的蛋白TK-1和TIMP-1均在心肌组织获得共同稳定高表达。2、联合基因(TK-1和TIMP-1)过表达后可缩小大鼠心梗后心肌梗死面积,抑制心肌细胞凋亡,改善心功能。与单基因(TK-1或TIMP-1)过表达相比,联合基因显着减少心肌梗死面积,抑制心肌细胞凋亡,改善心功能。3、联合基因(TK-1和TIMP-1)过表达后,相比单基因过表达,可显着下调炎症因子(MMP-2、MMP-9)和MIF、NF-κB的表达水平,这可能与TK-1和TIMP-1都部分通过抑制MIF/NF-κB/MMP-2、9炎症通路有关,可能呈现协同或迭加效应,从而更好地改善心梗后的心室重塑过程。
苏福娣[4]2014年在《抑制核因子-κB信号通路对大鼠心梗模型心功能的作用研究》文中研究指明背景和目的：心肌梗死（myocardial infarction，MI）后，机体神经体液调节机制激活，炎症反应、细胞因子等引起心肌细胞及其间质形态结构的改变，导致心室重塑，进而发展为心脏形态结构和血流动力学异常，即心力衰竭（heart failure，HF）。如何延缓、逆转心肌梗死后心室重塑，是临床防治心肌梗死后心力衰竭的关键。虽然心室重塑的机制是多因素的，目前研究认为炎症是心室重塑的重要环节。核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是一种具有多向性调节作用的核转录因子，研究表明心肌梗死后NF-κB激活，可使炎性细胞因子表达增加，从而加重炎症反应，同时NF-κB激活还可能参与心肌细胞外基质改变等过程。但是抑制NF-κB活化对心肌梗死后心功能和心室重塑的影响方面的研究较少。本实验通过结扎大鼠冠状动脉左前降支建立心梗模型，采用NF-κB信号通路抑制剂—吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）抑制心肌梗死后NF-κB激活，研究大鼠心肌梗死后抑制NF-κB活化对心室重塑及心功能的影响，并探讨其作用机制。方法：通过结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死模型（简称心梗模型），将造模成功且术后24小时仍存活的大鼠分为两组：心梗对照组（MI组）和实验组（PDTC组）；同时建立假手术组（Sham，SH组）作为空白对照。术后第二天开始实验组腹腔注射PDTC100mg/kg每日一次，SH组和MI组腹腔注射同等剂量生理盐水每日一次，连续给药至实验观察终点。在饲养过程中观察大鼠一般情况及心衰发展情况。取模型建立后1周、2周、4周3个时间段进行后续研究。后续实验研究包括：采用超声心动图方法检测左室大小（左室舒张末期内径和左室收缩末期内径，即LVEDD和LVESD）、左室射血分数（EF）和舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）。称取大鼠体重、心脏、左心室重量，计算心脏质量指数及左心室质量指数， HE染色观察心肌组织病理形态，Masson染色观察非梗死区心肌组织纤维化情况，检测非梗死区转移到细胞核内的p65水平以反映NF-κB的活化情况。结果：1.心肌梗死后NF-κB被激活，在1周时活化程度最高，之后逐渐下降，4周时仍明显高于SH组；各时间点PDTC组NF-κB的活性较MI组明显下降。2.超声心动图结果显示：与SH组相比，MI组1周时即出现心功能受损、心室重塑，4周时情况加重；PDTC组指标优于同时期MI组。3.4周时与SH组比较，MI组的左心室质量指数明显增高，而PDTC组左心室质量指数较MI组降低。4.1周、2周时与MI组相比，PDTC组心肌梗死区炎症反应受抑制，肉芽组织生长延迟；2周、4周时与SH组比较，MI组及PDTC组心肌梗死区组织变薄，逐渐为纤维瘢痕取代，非梗死区心肌细胞肥大，排列紊乱，基质纤维化增加，PDTC组非梗死区结构较MI组有改善。5.4周时MI组非梗死区心肌间质胶原沉积较SH组明显增多，同时使用PDTC抑制NF-κB活化可以减少非梗死区心肌间质胶原沉积。结论：1.通过结扎冠状动脉左前降支成功制作心梗模型，心肌梗死后NF-κB活性明显增高，1周时最高，之后逐渐下降，4周时仍高于正常水平。使用PDTC可以抑制心肌梗死后非梗死区组织NF-κB活化。2.心肌梗死后存在心室重塑，表现为心室腔明显扩大、后壁增厚、心肌细胞排列紊乱、基质纤维增生，其程度随时间延长而加剧。运用PDTC抑制NF-κB活化可以减轻大鼠心肌梗死后心室重塑。3. PDTC抑制心肌梗死后心肌组织NF-κB活化，可以改善心功能。该效应考虑与减轻心肌梗死后炎症反应和降低心肌间质胶原沉积进而延缓心室重塑有关。
贺轶宇[5]2013年在《温度敏感性水凝胶携带HMGB1治疗大鼠心肌梗死的实验研究》文中提出背景：近几年心肌梗死后心衰的发病率和死亡率持续升高,严重危害着人类的健康。心肌梗死后心室重塑是导致心功能恶化的重要原因,该病理过程主要表现为梗死区心肌细胞坏死、非梗死区心肌细胞肥大及心肌间质纤维化。严重损害了心脏的收缩和舒张功能,导致心力衰竭的发生。因此,延缓,逆转心梗后心室重塑是防治心衰的重要靶点。高迁移率族蛋白(High-mobility group box1, HMGB1)是一种DNA结合蛋白,存在于体内各种细胞中,调控细胞基因的转录。在病原体刺激或组织损伤后,HMGB1被分泌至细胞外,发挥化学趋化因子和促炎症因子的作用,诱导炎症反应,如：脓毒血症,自身免疫疾病及多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)等。近年来研究发现HMGB1对心梗后心肌再生、血管形成及减轻心肌重塑有重要作用。鉴于HMGB1的多种生物学作用,越来越受到关注。但对于HMGB1改善心梗后心室重塑的机制还不明确。以往研究表明TGF-β/Smads通路参与了心梗后心室重塑的发生、发展过程。转化生长因子(Transforming growth factor-beta, TGF-β)参与调节心肌成纤维细胞的增殖和细胞外基质的生成,是影响心室重塑的重要因素。而TGF-β超家族细胞内信号转导过程主要是通过Smad蛋白介导的,TGF-β与细胞表面的特异性受体TβRⅡ结合后,使TβRⅠ磷酸化,磷酸化的TβRⅠ使R-Smads聚集、磷酸化,形成同源寡聚体并迅速地与Co-Smads形成异源寡聚体,然后移位到细胞核内,介导TGF-β的生物信息,引起心室重塑。TGF-β1/Smads通路是否介导了HMGB1改善心梗大鼠心室重塑及心功能的作用,有待进一步探讨。目的：1.探讨注射外源性的HMGB1治疗是否改善了大鼠心梗后的心室重塑及心功能。2.探讨HMGB1改善心梗大鼠心室重塑及心功能的作用是否通过TGF-β/Smad通路。方法：建立SD大鼠急性心肌梗死模型,将60只大鼠分为以下各组;假手术组15只(Sham组,开胸后仅在大鼠心脏左冠状动脉处穿线,不结扎冠脉)；余45只随机分为心梗对照组(control组,心梗3周后梗死边缘区注射磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline, PBS)100μL,分四点注射,每点注射25μL); HMGB1治疗组(HMGB1组,心梗3周后梗死边缘区注射含2.5μgHMGB1的生理盐水100μL,分四点注射,每点注射25μL)。治疗一个月后,每组各取15只进行超声心动图检测。检测左室射血分数(LVEF%),左室舒张末内劲(LVEDD),左室收缩末内劲(LVESD),评定心功能。每组各取8只进行Masson染色检测心梗面积,比较各组心梗面积大小；Real Time-PCR和Western-blot检测TGF-β、Western-blot检测Smad2、Smad3、pSmad2、pSmad3、Smad7、MMP2、MMP9、TIMP2、TIMP3、胶原I(collagenl)和胶原Ⅲ(collagenⅢ)蛋白表达。培养心肌成纤维细胞,观察HMGB1对TGF-β1诱导下心肌成纤维细胞胶原和Smad7表达的影响。敲除心肌成纤维细胞中Smad7基因,观察HMGB1对心肌成纤维细胞中胶原合成的影响。结果：(1) HMGB1能降低大鼠心梗后LVESD和LVEDD,提高LVEF,上述指标与对照组相比有明显差异(P<0.05)。(2) HMGB1明显减少心肌collaagenⅠ、collagenⅢ、TIMP2的表达量,增加了MMP2, MMP9的表达量。与对照组相比上述指标有显着差异(P<0.05)。(3) HMGB1明显减少了心梗后心肌pSmad2的表达,增加了Smad7的表达。与对照组相比上述指标有显着差异(P<0.05)(4) HMGB1明显减少了TGF-β1诱导下心肌成纤维细胞胶原的合成。(5)在敲除了Smad7基因的心肌成纤维细胞中,HMGB1对其胶原合成的抑制作用明显减弱。结论：(1)注射外源性的HMGB1可以改善心梗后心功能,减轻心肌纤维化,逆转左室重构；(2) HMGB1可以减少心梗后梗死边缘区TGF-β1、p-Smad2的表达,增加Smad7的表达。(3) HMGB1对TGF-β诱导的心肌成纤维细胞的胶原合成有抑制作用,而对Smad7的表达有上调作用；(4)在敲除了Smad7基因的成纤维细胞中,HMGB1对胶原合成的抑制作用明显减弱。(5) HMGB1逆转左室重构,改善心功能是通过抑制TGF-β1/pSmad2信号通路,增力Smad7的表达实现的。背景：心肌梗死后由于心肌细胞大量死亡、心脏自身的再生修复能力有限,引发心室重构并最终导致心力衰竭。近年来,外源性干细胞(间充质干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞等)移植治疗心梗取得了一定的疗效。但由于单纯干细胞移植在心梗部位的细胞滞留率和存活率低,且不能有效调控移植细胞的增值和分化等问题。如何刺激原位心肌细胞再生修复成为研究的焦点。传统的观念认为,心肌细胞是一种终末分化细胞,人类心肌的再生能力很弱,不足以弥补心肌梗死后心肌的严重损失。然而这一观点近年来己被打破,越来越多的证据表明心脏具有自我更新能力,目前已从人和动物的心脏中分离出了心肌源性干细胞,并且这些细胞在体外可诱导分化成为心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞。目前发现有许多细胞因子在体内可以诱导新生心肌细胞和血管生成,但由于生长因子在体内扩散快和半衰期短而不能保持其生物活性。因此,如何延长细胞因子的作用时间是达到治疗目的关键。温度敏感性水凝胶具有良好的生物降解性,生物相容性、可携带生物活性物质(生长因子、基因、细胞等),为细胞生长提供良好的微环境的同时还可对细胞因子起缓释作用,延长细胞因子的作用时间,受到广泛关注。近年来,温度敏性水凝胶作为载体支架在组织工程领域的研究已取得了明显进展,广泛应用于神经、软骨、肝脏等组织或器官的再造研究。由我们合作单位教育部武汉大学生物医用高分子重点实验室开发的的新型高分子材料Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm是一种温度敏感型水凝胶,具有与细胞外基质类似的多孔网状结构,适合细胞的生长,并且具有良好的生物相容性、体内注射后成胶速度快,便于携带药物,细胞。本实验利用该水凝胶携带HMGB1注射到梗死部位治疗心肌梗死,观察其疗效并探讨其机制。目的：本实验的目的是观察温敏性水凝胶(Dex-PCL-HEMA/PNIPAA)作为载体材料携带HMGB1注射入心肌梗死边缘区后,心脏功能恢复,心室重构,梗死边缘区新生心肌细胞和局部血管生成的情况。方法：90只体重从200到250g的雄性SD大鼠分为5组,假手术组5只(Sham组,开胸后仅在大鼠心脏左冠状动脉处穿线,不结扎冠脉)。剩余85只开胸接扎冠状动脉前降支造成急性心肌梗死模型后,随机分成4组,分别经心肌在心肌梗死边缘区注入下列物质：100μL PBS(PBS组);100μL PBS携带2.5μg HMGB1(PBS+HMGB1组);100μL Dex-PCL-HEMA/PNIPAA温度敏感性水凝胶(Gel组);100μL水凝胶携带2.5μg的HMGB1(Gel+HMGB1组)。注射四周后,进行超声心动图检测心脏的功能,masson染色检测胶原沉积,免疫组化检测新生血管密度,分别与注射24h和1周后免疫荧光检测心肌干细胞及新生心肌细胞数量。结果：超声心动图检测结果：Gel+HMGB1组与其它各组比较,LVESD及LVEDD显着下降,LVEF显着升高,统计学处理有显着性差异(P<0.05)。组织形态学检测结果：免疫组化显示心肌梗死边缘区血管密度,PBS+HMGB1组和Gel+HMGB1组血管密度明显高于其他组,有显着统计学差异(P<0.05)；PBS+HMGB1组和Gel+HMGB1组相比血管密度无显着差异(P>0.05)。同时Masson叁色染色显示Gel+HMGB1组的胶原比例较其它各组明显减小,有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光显示Gel+HMGB1组梗死边缘区新生心肌细胞和心肌干细胞数量较其它组明显升高(P<0.05)。结论：Dex-PCL-HEMA/PNIPAA温度敏感性水凝胶携带HMGB1注射至大鼠心肌梗死边缘区,4周时超声心动图检测显示心脏功能得到明显改善,组织学检测显示胶原比例明显缩小,血管生成明显增加,新生心肌细胞和心肌干细胞数量明显增多,证明温Dex-PCL-HEMA/PNIPAA水凝胶作为载体可保持HMGB1的活性,同时又为细胞生长提供了良好的微环境,注射于心肌梗死区可修复受损的心肌,改善心功能。
赵传艳[6]2012年在《大鼠心梗模型中管家基因的选择及ADAMTSs在心梗后心肌中的表达及机制》文中指出研究背景及目的基因表达分析在许多生命科学研究领域里的重要性日益增加,其研究的深入将为探索疾病相关基因、了解基因表达调控、解析生命奥秘、从而最终为人类服务大有裨益。反转录实时荧光聚合酶链反应是对特定信使RNA进行定量研究的最灵敏方法。为了分析特定信使RNA含量的差别,要用内部参照基因来进行定量。管家基因有几百种,目前,作为内参使用最广泛的管家基因是3磷酸甘油醛脱氢酶、β肌动蛋白、18SrRNA和28SrRNA。教条地使用一种管家基因或盲目参照不同实验对象及条件所使用的管家基因作为内参,一方面可能使基因表达的微小差异难以发现,另一方面可能导致错误甚至相反的结论。大鼠是一种常用制作心梗模型的实验动物,对于冠心病相关基因的研究使用大鼠做动物模型是许多实验室的首选。然而,心梗后大鼠内参基因选择问题还较少研究报道。心肌梗死是威胁人类生命的重大疾病,心肌梗死动物模型对于研究人类冠心病的发病机制、病理生理改变以及对治疗方法的评估都具有重大意义。长期以来实验室研究是用结扎大鼠冠状动脉的方法来制备模型,但在实践中,由于麻醉和人工呼吸的使用不当、肺损伤以及左冠状动脉定位错误等各种原因,造成动物死亡或制模失败。因此提高存活率及制模成功率是解决心肌梗死动物模型的一个核心问题。我们对制作大鼠心梗模型的方法加以改进,明显提高了大鼠的存活率,较好地解决了大鼠心梗模型的制备问题。急性心梗是引起人类死亡与残疾的主要疾病之一。心梗后心室重塑可导致心衰与死亡率的增加。在心室重塑过程中包括细胞外基质(ECM)分子的集聚和降解的动态变化。许多生物物质包括蛋白酶,蛋白酶抑制剂及生长因子等对ECM的重建起作用。其中基质金属蛋白酶(MMPS)表达的增加与激活也牵涉其中。除基质金属蛋白酶外,还有一些蛋白酶家族可降解细胞外基质。ADAMTS是一类分泌性金属蛋白酶,其主要结构包括解聚素,基质金属蛋白酶和血小板反应素基序。在人类中其家族已发现19个成员,涉及裂解多种蛋白聚糖,胶原的代谢,抗血管新生,VWF多聚体的降解,以及胚胎器官发育,生殖等多种功能。其中某些成员可与细胞外基质结合发挥作用。在颈动脉粥样硬化斑块及冠脉不稳定斑块中的富巨噬细胞区域ADAMTS4与8的表达增加,在动脉粥样硬化发展过程中,ADAMTS4的表达上调。Versican是聚集蛋白聚糖家族成员之一,在组织中广泛存在,参与伤口愈合及组织重塑过程。在冠脉结扎致心梗大鼠模型中其在心肌中表达并短暂升高,提示其参与了心梗后的炎症反应。ADAMTS4降解血管壁里的蛋白多聚糖versican,其作用位点在V1/V0versican的Glu1428-Ala1429。ADAMTS4能被内源性的抑制剂TIMPs阻断,ADAMTS4和ADAMTS5均能被TIMP-3有效抑制,而对TIMP-1,2,4却基本上不敏感。近年来ADAMTS在炎症及动脉粥样硬化中的作用得到关注。免疫组化分析示ADAMTS1、4、5、8在人类颈动脉病变及冠脉粥样硬化斑块处表达,ADAMTS4、5、8与巨噬细胞共存而ADAMTS1与内皮细胞及平滑肌细胞共存。Versican在组织中广泛分布,亦存在于心脏中。versican在心梗后心脏中表达增高且其来源于渗出的单核细胞,提示其参与心梗后炎症反应。Aggrecan是一个软骨特异性的硫酸软骨素蛋白多聚糖,是ADAMTS的作用底物。ADAMTS4及5表现为较强的降解aggrecan活性。ADAMTS4在心梗后心脏中的具体表达部位,是否与versican在同一部位表达以及心梗后是否涉及aggrecan的表达,目前尚不明确。在剪切应力作用下,人静脉内皮细胞及心脏微血管内皮细胞的ADAMTS1mRNA表达上调。在动脉粥样硬化斑块内膜及增殖/迁移的主动脉血管平滑肌细胞中,ADAMTS1的mRNA表达增高。应用INF-γ、TNF-α及IL-1β刺激巨噬细胞发现INF-Y刺激后ADAMTS4、7、8、9表达增加,ADAMTS1及17表达下降,而ADAMTS2、5、10不受其影响,TNF-α刺激后ADAMTS4、7、8表达增加,ADAMTS9轻微升高,IL-1β刺激对ADAMTS4、7、8表达无影响,而ADAMTS1及9在早期升高,说明ADAMTS家族中不同成员表达及调控机制存在差异。以往研究提示,在动脉硬化发展及动脉粥样硬化斑块不稳定的过程中,ADAMTS4扮演着重要角色；ADAMTS4可以作为一种预示斑块不稳定及急性冠脉综合征严重程度的指标。经皮冠脉介入治疗(PCI)过程可以看作为机械挤压诱导斑块破裂的模型,因此研究PCI过程中的炎症反应或许可以为斑块不稳定机制提供线索。许多临床研究报道了冠心病患者PCI后的炎症反应。既然ADAMTS4已被证明是炎症调节酶且与动脉硬化的发展及斑块不稳定相关,我们猜测在冠心病患者冠脉循环中ADAMTS4水平可能升高且受PCI手术影响。本研究用反转录实时荧光聚合酶链反应方法比较了四种管家基因在心梗大鼠心脏中的表达情况,采用GeNorm算法分析了哪些管家基因最适于心梗后大鼠基因表达研究。改进了大鼠心梗模型的制作方法,提高了手术成功率及大鼠存活率。探讨了ADAMTS4、ADAMTS8、versican、TIMP3在大鼠心梗后心脏中表达的动态变化、分布区域及可能机制,进一步认识急性心梗后局部ECM分子的变化及相互作用,为治疗提供新的理论依据。检测了IL-1β刺激内皮细胞后ADAMTSs的表达趋势。通过从冠状静脉窦取血检测了冠脉ADAMTS4及hs-CRP水平,并评估了PCI对ADAMTS4及hs-CRP水平的影响。本学位论文的主要研究内容及实验结果如下：一、大鼠心梗模型中管家基因的选择我们采用结扎冠脉前降支的方法制作心梗模型,结合实际工作,分析并挑选出使用广泛的4个标准管家基因：3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L13A(RPL13A)、β-肌动蛋白(ACTB)和结合区连接蛋白(ARBP),用反转录实时荧光聚合酶链反应方法比较了它们在心梗大鼠心脏中的表达情况,采用GeNorm算法分析哪些管家基因最适于心梗后大鼠基因表达的研究。结果示RPL13A、GAPDH、 ARBP及ACTB基因的M值分别为0.812、0.721、0.812和1.2,分析得出GAPDH及ARBP是在心梗模型中表达最稳定的基因。二、大鼠心肌梗死模型制备的改进选取健康雄性Wistar大鼠100只(体重230-270g),分为模型组(n=80)和假手术组(n=20)。3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,气管切开,小动物呼吸机辅助呼吸,采用容量控制模式,潮气量3ml/100g,呼吸频率60-70次/min,吸呼比1：1。左侧胸部开胸,由第4肋间入胸,用乳突牵开器牵开肋骨,暴露心脏。在肺动脉圆锥和左心耳之间距主动脉根部约3mm处结扎左冠状动脉前降支。观察心电图变化,以肢体导联2个以上导联ST段抬高,或者肉眼观察结扎处下方大面积心肌表面变得苍白,周围瘀血征出现,室壁搏动减弱为结扎成功标准。假手术组大鼠只穿线不结扎。逐层关胸,撤除呼吸机,拔除气管插管。为防止气道狭窄及分泌物导致窒息,不缝合气管及颈部切口。术中至术后12h采用40W灯泡照射保暖,术后4h内注意观察气管切口处分泌物,及时用吸痰管清除。结果示心肌梗死模型制作的成功率为98.6%。模型组术后3周成活率为88.75%,假手术组存活率为100%。通过对大鼠心梗模型制作方法的改进,提高了手术成功率及大鼠存活率。叁、大鼠心梗后心肌中ADAMTS4、ADAMTS8、versican、TIMP-3基因表达的动态变化选择250-300g雄性Wistar大鼠。按前述方法制作心梗模型,设假手术组。分别于手术后0、3、6、12、24小时及3、7、14、21天(n=5)过量麻醉处死大鼠,迅速开胸摘取心脏,将结扎点下方梗死部位心肌分离切割,放入-70℃冰箱备用。用实时荧光定量RT-PCR方法分析梗死心肌中ADAMTS4、ADAMTS8、versican及TIMP-3mRNA表达,ELISA法检测(?)ADAMTS4的蛋白表达。结果示ADAMTS4表达在心梗后6及12小时明显升高(p<0.05),随后快速下降。而ADAMTS8则在心梗后6小时开始升高,至24小时达峰值,3天时仍持续在高水平(p<0.05),然后缓慢下降。心梗后versican mRNA水平显着增高,至3天时达峰值,且升高持续时间较长。TIMP3表达水平降低。ADAMTS4蛋白水平在心梗后6小时(p=0.026)、12小时(p=0.003)、24小时(p=0.002)及3天(p=0.009)显着增高。ADAMTS4、ADAMTS8, versican及TIMP-3在心梗大鼠心脏中表达,且表现为不同的动态变化趋势。ADAMTS4、versican及TIMP-3的表达之间存在相互关系。四、AAMTS4在梗死大鼠心脏血管内皮细胞及心肌细胞中表达选择250-300g雄性Wistar大鼠制作心梗模型,设假手术组。手术后3天处死大鼠,取左心室制作冰冻切片。切片厚度为5um。免疫组织化学方法检测ADAMTS4、versican及aggrecan蛋白表达。对于阴性对照组,我们以等比稀释度用兔IgG处理切片。结果示ADAMTS4在梗死边缘区域心肌细胞中表达,在梗死区域及远离梗死区的正常心肌未见ADAMTS4表达。在梗死周围区域毛细血管内皮细胞ADAMTS4有弱表达,versican强表达。Aggrecan在心梗组及假手术组的心肌组织及血管内膜均未见表达。ADAMTS4与versican共同表达于内皮细胞提示二者存在某种联系,其动态变化可能在心梗后基质重塑中起作用。五、白介素1β刺激内皮细胞后ADAMTSs的表达选取人脐静脉血管内皮细胞,以传代培养法培养细胞。分别以2.5ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml浓度的IL-1β刺激内皮细胞,24h后收集细胞提取总RNA及蛋白。用10ng/ml IL-1β刺激内皮细胞,分别于刺激后2hh、6h、12h、24h、48h收集细胞提取总RNA及蛋白,设空白对照组,每组5个样本。RT-PCR测定ADAMTS1、4、8、9、15mRNA表达,Western-blot测定ADAMTS4蛋白表达。结果示IL-1β刺激内皮细胞后ADAMTS1、4、8、9、15mRNA表达均增高,但随时间变化趋势不同,ADAMTS4蛋白表达增高。此结果提示ADAMTSs参与炎症反应,具体机制有待进一步阐明。六、冠心病患者冠脉血中ADAMTS4水平的变化及经皮冠脉介入治疗对冠脉ADAMTS4水平的影响根据冠脉造影结果,将81例患者分为对照组、简单病变组及复杂病变组,其中35例患者接受了PCI治疗。血液检测标本从冠状静脉窦获得。ADAMTS4及hs-CRP值分别通过ELISA及免疫浊度法检测。结果示复杂病变组ADAMTS4及hs-CRP值明显高于对照组及简单病变组(P<0.001)。所有研究对象及冠心病患者的ADAMTS4水平均与hs-CRP水平相关(r,=0.73, r2=0.763, P<0.01)。接受了PCI治疗的患者ADAMTS4值高于未接受PCI者(P<0.001), hs-CRP亦表现出相似结果(P=0.025)。冠心病患者冠脉ADAMTS4及hs-CRP水平升高,且随病变复杂程度增加而升高。PCI后冠脉ADAMTS4及hs-CRP升高,其可能由PCI过程中球囊扩张或支架植入的机械挤压导致冠脉斑块破裂释放而出。
顾水明[7]2004年在《肿瘤坏死因子和基质金属蛋白酶在心衰和心室重构中的变化及药物干预的影响》文中研究表明目的 1．研究显示炎症在心力衰竭发生发展中起重要作用。有关血浆细胞因子水平(主要为TNF-α、IL-1、IL-6)与心力衰竭关系研究较多，而对其它细胞因子家属成员及循环血白细胞中细胞因子的变化研究很少。本研究应用cDNA表达谱芯片研究慢性心力衰竭(CHF)患者和健康对照组外周血单核细胞基因表达谱差异，细胞因子网络和其它炎症介质的基因表达。 2．肿瘤坏死因子α在心室重构及心功能异常中起重要作用。基质金属蛋白酶(MMPs)是心室重构过程中心脏基质降解的主要因素。己有报道大鼠心梗后不同时期基质金属蛋白酶变化规律，但对心室重构进展中不同时期心肌MMPs活性情况报道不一，对心肌TNF-α基因表达时间序列，TNF-α表达量与MMPs活性水平关系少见研究报道。本研究探讨了大鼠心肌梗死后心室重构进展中肿瘤坏死因子α表达及MMPs活性的变化，两者相关性及与心室重构及心功能的关系，以进一步探讨它们在心室重构中的作用。 3．他汀类药物能防治心肌缺血再灌注损伤、抑制心衰患者单核细胞炎性细胞因子表达、抑制血管内皮细胞MMPs表达、下调血管平滑肌细胞血管紧张素1(AT1)受体，具有抗炎等调脂之外的其它心血管保护作用。但他汀类药物对心力衰竭及心室重构的作用少见报道，他汀类药物与ACEI合用对改善心室重塑及心功能是否有协同作用尚未见报道。本研究在大鼠心肌梗死模型上应用他汀类药物普伐他汀及合用ACEI福辛普利，与单用ACEI福辛普利对比，观察它们对大鼠心肌梗死后心室重构、心功能、TNF-α表达、基质金属蛋白酶活性等的影响。 方法 1．入选8例CHF患者，8例年龄性别相匹配的健康者作为对照组。收集CHF第二军医大学博士学位论文中丈摘要患者和对照组外周静脉血并分离单个核细胞。分别抽提两组单个核细胞总RNA，反转录合成单链、双链cDNA后，体外转录合成cRNA。分别用cy3一dCTP和cys一dCTP标记对照和CHF组cDNA。将基因芯片和杂交探针变性后杂交、洗涤。用基因芯片扫描仪进行图像扫描，ImaGene 3 .0软件分析cy3、cys两种荧光信号的强度和比值。 2.雄性SD大鼠45只，结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型。随机分为心梗后1、7、14、28、42天组，另取45只SD大鼠作为相应时间点的假手术组。应用超声心动图仪测定心脏结构和功能，MPA一2000多导生理仪测定血流动力学参数，反转录聚合酶链反应检测心肌TNF一。mRNA的表达，酶谱法测定左室心肌MMPs活性。 3.雄性SD大鼠50只，建立心肌梗死模型后，随机分为急性心肌梗死组，福辛普利组(IOm叭留d)，普伐他汀组(20m叭留d)，普伐他汀(20m叭酬)加福辛普利组(l0m叭酬)。另随机抽取10只大鼠作为假手术组。术后24h开始直接灌胃给药，AMI及假手术组大鼠灌等量生理盐水，用药42d后测定上述指标，并用免疫组织化学法测定I、m胶原表达及班n型胶原比例。 结果 1.在13824个基因点中，与正常对照组比较，鉴定出123个表达差异相关基因，其中有102个基因表达上调(cys/cy3比例>2.0)，21个基因表达下调(cy5/cy3比例<0 .5)。涉及粘附分子、热休克蛋白、信号传导、细胞周期、凋亡、细胞信号/传递、离子通道、细胞受体、转录因子、防御/免疫蛋白及炎性细胞因子。另未知基因功能的表达序列标签伍ST)ll个，其中上调9个，下调2个。其中炎性细胞因子中的TNF超家族和趋化因子及其受体两个基因族差异表达较明显。TNF超家族成员中，翎F超家族成员3(淋巴毒素p，LTB)，TNF超家族成员5、7、10(CD40L、CD27L、FasL)，翎F受体超家族成员1 lb，翎F受体超家族成员13b(妙班L)，TNF相关凋亡诱导配体受体4(TRA1LR4)，TNF受体相关因子5(TRAFS)，INF一Q在CHF组均上调。而INF受体超家族成员10c(TRAILR3)在CHF显着下调。多个趋化因子及趋化因子受体在CHF上调。其中，巨噬细胞炎症蛋白1a(MIP一la)和相应受体CCRS在CHF显着上调。 2.大鼠心梗后14d起左室舒张末期直径(LvEDD)逐渐增加、左室射血分数第二军医大学博士学位论文中文摘要(LvEF)及左室短轴缩短率(Fs)逐渐降低，至42d最明显，与相应假手术组及术后ld组比较有显着差异(P均<0.01)。心梗后ld起左室舒张末压(LVEDP)逐渐升高、左室压力上升最大速率(dP/dtlnax)及压力下降最大速率(dP/d trnin)逐渐下降、以术后42d最明显，分别与相应假手术组及术后ld组比较有显着差异(P均<0.01)。心梗后ld TNF一。即表达，7d表达达高峰，其后逐渐下降，术后第42d仍有较高表达。心梗后1、7、14、28、42天各时间点INF一。表达量分别是相应假手术组的2.3、4.7、4.2、3.3、2.9倍(P均<0.01)。心梗后第l天MMPZ和MMpg活性即升高，至7天活性最高，其后逐渐下降。心梗后1、7、14、28、42天各时间点MMPZ活性水平分别是相应假手术组的2.4、6.4、4.8、3.8、3.4倍(P均<0.01):而MMpg活性水平分别是相应假手术组的2.5、5 .7、5 .4、3 .2、2.7倍(P均<0.01)。将心梗后翎F“表达量及MMps活性峰值(心梗后7d)与心梗后42d的超声指标及血流动力学参数作直线相关分析显示，TNFQ表达量与LVEDD呈正相关(r=0.94，p<0.01);与FS、LVEF、dPldt max呈负相关(r==- 0.91、一0
白秀萍[8]2013年在《3D类心肌组织与ALGINATE水凝胶用于大鼠心肌梗死修复的研究》文中研究说明心肌梗死是由于心血管局部堵塞导致心肌局部供血不足而引发的心肌坏死，由于心肌组织的再生潜能极其有限，而且用于心脏移植的供体器官严重缺乏，心肌梗死和相关的心血管疾病是全世界最首要的死亡原因。目前对心肌梗死的治疗手段包括再灌注心肌、缓解疼痛、抗心律失常、抗休克、并发症治疗等，尤其是介入治疗技术的突飞猛进使很多急性心肌梗死患者避免了死亡，但临床治疗对心肌梗死后的心力衰竭仍力不从心，原因是心梗诱发的心室重构过程中心肌细胞的缺失和细胞外基质降解，心室壁变薄，室壁的力学性能下降，导致心功能降低，甚至心力衰竭的发生，因此研究用于心肌梗死治疗的新策略具有重要意义。大量研究表明，利用组织工程的方法将由生物材料与心肌细胞研制的组织工程心肌或活细胞移植或注射到受影响的心肌组织中，对于改善受损心肌的功能具有重要意义，为心肌梗死的治疗开辟了新的途径。然而这种治疗方案目前仍然处于动物实验的尝试阶段。本研究针对心梗诱发的心室重构过程中心肌细胞的缺失和细胞外基质的降解，以海藻酸钠水凝胶为基本材料，分别设计体外心肌组织工程构建3D类心肌组织和注射水凝胶的原位心肌组织工程的方案对心肌梗死的损伤进行修复治疗，取得了较好的结果，为心肌梗死的治疗开辟了新的途径。海藻酸钠是一种多糖类的高分子材料，因其有良好的生物相容性和抗凝血性，故在组织工程和心肌组织工程中具有广泛的应用，尤其作为支架材料在骨组织、心肌组织中应用较多。鉴于心肌梗死的病理过程中心肌细胞的缺失和常规叁维支架材料难以在体外构建高密度的类心肌组织的难点，本研究采用微囊化技术在体外构建结构致密的叁维类心肌组织。首先利用不同比例的胶原研制海藻酸钠/胶原复合微囊，该复合微囊的细胞相容性得到显着改善，适于原代大鼠心肌细胞的贴附和增殖。二维培养的心肌细胞通常增殖能力较弱，而且容易失去心肌细胞特征，而包覆于该微囊内的心肌细胞能够持续处于增殖状态，且无需传代，并维持典型心肌细胞的特征。因此，该复合微囊技术具有维持乳鼠心肌细胞持续增殖的独特优势。利用该复合微囊对大鼠乳鼠原代心肌细胞进行叁维培养，可以持续培养长达3个月时间，在微囊内形成了高细胞密度、有持续搏动功能的叁维类心肌组织。为了进一步验证该类心肌组织在体内的活性，将该类心肌组织植入大鼠心肌梗死的模型，6w后检测大鼠的心功能证实，该叁维类心肌组织能够显着改善心脏的射血分数和梗死部位的血管再生。心肌梗死引发的心肌细胞外基质的缺失是导致心功能降低的一个关键问题，可注射凝胶的局部注射能改善心肌梗死区的力学性能，减少心衰的发生。由于目前多用钙离子交联的海藻酸钠水凝胶，虽然有功能改善，但是钙离子交联的水凝胶存在着力学性能差，体内不易降解，细胞亲和力差等不足。本文采用将海藻酸钠进行部分氧化，得到具有活性的醛基，进而与明胶分子中的游离氨基发生反应形成共价交联的水凝胶。将化学交联的可注射的海藻酸钠水凝胶与离子交联的水凝胶进行了系统的对比研究，共价交联的凝胶系统的力学性能、降解性能和细胞亲和力明显优于钙离子交联的水凝胶，从而总体上提高了心肌功能的恢复，该凝胶力学性能达到106Pa，凝固时间可调控于30-40min，孔隙率达到70%。化学交联的凝胶在体外、体内降解率加快，植入大鼠心肌梗死模型后，心功能恢复增强。组织学研究表明，化学交联的可注射凝胶在体内增加左心室室壁厚度，促进血管再生，并能抑制基质金属蛋白酶的活性。总之，本论文针对心肌梗死的病理过程中心肌细胞损伤和细胞外基质损伤两个基本问题进行了研究。针对心肌细胞的损伤设计了海藻酸钠水凝胶叁维微囊化技术成功构建了具有持续搏动功能的类心肌组织，而针对细胞外基质流失设计了化学交联的可注射凝胶，并应用于大鼠心肌梗死模型，实验证实：叁维类心肌组织和可注射凝胶均能改善梗死区的心肌功能，为心肌梗死的治疗提供了新的途径。
倪骋[9]2018年在《FMO2通过结合CYP2J3减轻心梗后SMAD2/3磷酸化介导的心脏纤维化》文中指出研究背景:含黄素单氧化酶2(FMO2)是通过以NADP+和FAD为辅酶和辅基实现异种物质代谢的含黄素单氧化酶(FMO)家族中的一员,且具有不同于家族其他成员的特点,即高表达在与纤维化密切相关的肺,而非在与药物代谢密切相关的肝脏。然FMO2在非代谢领域相关的作用、功能和具体机制e仍有待进一步阐释。在前期实验中,通过对叁组SD大鼠(sham组,心梗组,心梗+人经血干细胞移植组)的基因芯片分析及验证,发现FMO2表达在心梗后显着下调,而在经血干细胞移植后心功能改善的同时FMO2表达也明显提高。而在大鼠的心脏组织中,我们发现FMO2于心脏成纤维细胞中的表达远超过其在心肌细胞中的表达。因此,我们推测FMO2可能在心梗后的纤维化过程起重要作用,但具体的作用及机制尚不明确,有待进一步深入研究。研究方法及结果:我们在心梗后的SD大鼠中通过注射过表达FMO2的慢病毒上调FMO2,发现心梗后14和28天的心功能相较于对照组有显着的改善。同时,将病理切片经天狼星红和MASSON染色后结果显示,在FMO2过表达后,大鼠心脏的梗死区域纤维环周长、非梗死区纤维化面积均显着小于对照组,而心梗区段的心肌细胞存活数显着多于对照组。我们还通过在FMO2片段后加入在心肌细胞中高表达的miR133a与miR1a的互补链构建了对成纤维细胞的靶向FMO2过表达病毒,并同样对心梗后的SD大鼠进行心肌内注射,心超和取材方式与前述实验相同。结果显示,经过靶向性FMO2过表达病毒注射的大鼠心功能亦在心梗后14和28天相对阴性对照组有所改善,病理结果也显示在靶向性FMO2过表达病毒注射的大鼠中,心梗后瘢痕周长以及非梗死区的纤维化面积要显着小于阴性对照组的大鼠,同样的,梗死区段的心肌细胞存活也显着多于阴性对照组。此外,利用CRISPR-cas9技术构建的FMO2-/-大鼠的心功能也显着低于与其同周龄同性别的正常SD大鼠,病理结果也显示FMO2-/-大鼠心脏相对于正常SD大鼠具有更严重的纤维化。而在体外实验中,我们利用差速贴壁的方法从新生乳大鼠中分离得到心脏成纤维细胞(NRCF),并给予24小时TGF-β因子刺激,以此模拟体内纤维化过程。研究发现,在过表达FM02的成纤维细胞中,Periostin,Collagen1等代表纤维化激活的蛋白表达要显着低于对照组。进一步实验表明,FMO2的过表达主要抑制了 SMAD2/3促纤维化位点的磷酸化。为了探究其抑制SMAD2/3磷酸化的机制,我们将注射FMO2-over病毒后再经TGF-β处理的NRCF进行质谱检测,发现FMO2能与细胞色素p450超家族成员之一-CYP2J3结合形成复合物,此结果也由免疫共沉淀实验得到验证。此外,我们发现单独过表达CYP2J3也能抑制纤维化相关基因及其下游信号通路的表达,而在FMO2过表达且CYP2J3被敲减的情况下,下游的纤维化基因表达被抑制的表象会被逆转,SMAD2/3的磷酸化抑制也会消失。上述结果证明了 CYP2J3是FMO2抑制纤维化的过程中必不可少的条件。结论:FMO2在心梗以后的补偿能显着减轻重塑期的纤维化过程,此作用是通过结合CYP2J3引起磷酸化的SMAD2/3被抑制而介导的,为心梗以后抗纤维化的治疗提供了极具潜力的新靶点。
李清[10]2017年在《药物提高心肌干细胞治疗急性心肌梗死疗效的实验研究》文中认为目的:心肌干细胞(cardiac stem cells,CSCs)移植治疗急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的疗效受到存活率低和归巢细胞数量少的限制。基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)与其特异性受体趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)构成的SDF-1/CXCR4轴在CSCs迁移的过程中发挥重要作用;而PODXL(podocalyxin-likeprotein1,podocalyxin)是CSCs细胞膜上的一个表面标记,被证实在细胞粘附和细胞间相互作用中发挥重要作用。本研究在体外缺氧无血清条件下模拟心肌缺氧微环境,研究阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)对小鼠CSCs的抗凋亡作用及可能发挥作用的分子机制。此外,本研究旨在探讨ATV预处理能否增加CSCs表面CXCR4和PODXL的表达,并提高其迁移能力及与内皮细胞的粘附、穿越作用,进而改善AMI后心功能。方法:首先,分离培养小鼠CSCs,在缺氧无血清条件下用ATV处理12小时,应用流式细胞术和Hoechst 33342荧光染色观察细胞凋亡,并利用Western blot方法检测通路蛋白AMPK、mTOR的磷酸化水平。其次,设置不同ATV浓度梯度组及时间梯度组,通过流式细胞术检测CSCs细胞表面CXCR4和PODXL的表达比例,确定ATV促进CSCs细胞表面CXCR4和PODXL表达的最佳浓度及时间。通过加入CXCR4的中和抗体及转染PODXL-siRNA阻断PODXL的表达进行机制研究,进行细胞迁移实验,细胞粘附实验和跨内皮迁移实验评价各组CSCs细胞迁移能力,与内皮细胞的粘附和穿越能力。最后,在体实验中将320只雌性C57小鼠随机分为sham组,AMI组,口服强化ATV组,移植CSCs组,移植ATV预处理的CSCs(ATV-CSCs)组,口服强化ATV联合移植ATV预处理的CSCs组(ATV+ATV-CSCs组),ATV预处理的转染si-PODXL的CSCs 组(ATV-PODXL-SiRNA-CSCs)组、ATV 预处理的转染 si-CXCR4 的 CSCs 组(ATV-CXCR4-SiRNA-CSCs)组。采用结扎冠状动脉前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后1周经颈静脉注射各组处理的CSCs(2×105细胞/只),对照组动物注射等体积PBS。在干细胞移植后3天(基线)及4周(终点)分别行心脏超声检测、病理组织学及分子生物学检测。结果:缺氧无血清条件引起明显的细胞凋亡,ATV处理组细胞凋亡率显着降低,且呈一定的浓度依赖性。ATV处理组AMPK磷酸化水平明显升高,加入AMPK阻断剂compound C可以显着阻断这种效应。ATV可以剂量依赖性促进CSCs表面CXCR4和PODXL的表达,在1μM ATV处理组和预处理12小时组表达比例最高。细胞迁移实验显示,加入CXCR4的中和抗体后CSCs的迁移能力明显下降,ATV促进CSCs迁移的作用也被显着抑制。细胞粘附实验发现,ATV可以提高CSCs的粘附能力,而阻断PODXL的表达,会显着降低CSCs与细胞外基质成分的粘附能力,同时也会明显抵消ATV促进CSCs细胞粘附的作用。在跨内皮迁移实验中,与CSCs组相比,ATV预处理CSCs组穿越内皮细胞层的细胞数量显着增加,而转染PODXL-siRNA的CSCs组细胞数量则显着减少。提示ATV促进CSCs与内皮细胞粘附及变形穿越内皮层的作用至少部分是通过PODXL蛋白介导的。在体实验中,口服强化ATV联合ATV预处理能够促进CSCs的存活及归巢,并从减轻炎症细胞浸润、抑制纤维化、减少心肌细胞凋亡及增加梗死周边区血管新生等多个方面促进心肌修复,进而减小心肌梗死面积,减轻心脏重塑,改善心功能。结论:本研究结果表明ATV具有显着的抗凋亡作用,可明显提高CSCs在缺氧无血清条件下的存活率,其作用可能与AMPK/mTOR通路有关。使用ATV预处理的CSCs进行细胞移植,可以通过提高CSCs细胞表面CXCR4和PODXL蛋白的表达地促进其归巢,改善AMI后心功能,联合口服强化ATV和ATV预处理的CSCs可以进一步提高CSCs移植的疗效,为提高干细胞移植疗效提供了一种新的可能思路。目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后局部心肌微环境恶劣,导致心肌细胞大量丢失,我们课题组的前期研究发现,他汀可以对缺氧无血清条件下内皮细胞及心肌细胞有保护作用。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是调控细胞能量代谢的核心分子,它可以抑制下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性,在调节细胞凋亡和自噬中发挥重要作用。本研究拟应用Wistar大鼠冠脉结扎制作AMI模型,给予AMPK抑制剂compound C和ATV进行干预,对比观察他汀早期干预,对梗死后心肌微环境的影响,明确ATV对梗死周边区心肌细胞的凋亡和自噬的调节作用及相关通路。方法:将100只8周龄200-220gWistar大鼠随机平均分为5组:sham组,AMI组,口服强化ATV组(ATV组),口服强化ATV并注射compound C组(ATV+CC组),注射compound C组(CC组)。sham组手术线穿过前降支,但不结扎;其余各组开胸行前降支结扎,其中ATV(10mg/kg/d)和compound C(20mg/kg/w)从AMI模型制备当天开始给予至取材。为评价大鼠心功能的变化,我们在基线(AMI后3天)及终点(AMI后4周)时两次进行超声心动图检查来检测左室功能。此外,通过ELISA,病理学检测,Western blot等检测炎症因子水平,细胞凋亡,细胞自噬及通路蛋白的表达情况。结果:超声数据显示,与AMI组相比,口服ATV组的左室射血分数(LVEF)有明显提高;组织病理学检测显示,与AMI组相比,口服ATV组的左室纤维化面积和炎性细胞浸润明显改善,炎症因子表达水平降低;此外,口服ATV组凋亡细胞明显减少,自噬阳性细胞明显增加。加入AMPK抑制剂compound C后ATV的这些保护作用均被显着抑制。Western blot结果显示,口服ATV组p-AMPK的表达水平较其他几组明显上调,而p-p53和p-mTOR的水平则明显下调。使用AMPK抑制剂compound C后,ATV+CC组和CC组p-AMPK的表达水平均显着低于ATV组,与此相反的是,这两组p-p53和p-mTOR的表达水平则显着升高。而各组总AMPK,mTOR和p53的表达量却没有显着差异。由此可知,口服ATV可以促进AMPK磷酸化,提高p-AMPK/AMPK的比例,降低p-p53/p53和p-mTOR/mTOR的比例。而加入compound C后,ATV对p53和mTOR磷酸化的调节作用也被显着抑制。结论:本研究发现在大鼠急性心梗后4周,ATV可以通过AMPK/mTOR通路显着促进细胞自噬,抑制细胞凋亡;并且通过激活AMPK/mTOR通路,ATV可以促进心肌存活,减轻炎症反应,改善心功能。目的:在缺血再灌注损伤中,心脏微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)通过微循环控制、旁分泌及近分泌、屏障保护叁大功能在局部心肌组织中发挥保护作用。同时CMECs在缺血再灌注损伤时较心肌细胞更加敏感,更易受到损伤。通心络是一种由12种天然药材构成的中药复方制剂,具有保护内皮和防治心肌缺血再灌注损伤的功能。在本实验中,我们通过CMECs体外缺氧/复氧损伤模型和通心络处理,采取TMT(Tandem mass tag)标记的定量蛋白质谱方法检测内皮细胞中多种蛋白的变化以及通心络的调节作用,以便从整体水平系统研究缺氧/复氧损伤对于CMECs细胞内蛋白表达的影响以及通心络发挥调节作用的相关机制。方法:以不同浓度的通心络处理心脏微血管内皮细胞,缺氧2小时,复氧2小时,流式细胞术分析凋亡率以确定通心络作用的最佳浓度。通过TMT标记的蛋白质谱法检测心脏微血管内皮细胞在缺氧/复氧后细胞内发生变化的蛋白及通心络处理后变化的蛋白,并通过基因本体论分析及文献综述发生变化的蛋白的功能及参与的通路。为进一步验证差异蛋白功能,我们选取在缺氧/复氧和通心络干预下有显着变化的蛋白血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HMOX1)和血管生成素-2(angiopoietin-2 isoform c precursor,ANGPT2),分别进行抑制和过表达,通过细胞迁移实验,成管实验,增殖实验等进行功能学验证。结果:通心络浓度依赖性地减少CMECs细胞凋亡,800μg/mL通心络的抗凋亡作用最明显。我们最终在叁组中筛选出50个差异蛋白,并且进一步分析了这些蛋白的功能及通路。缺氧/复氧显着改变CMECs细胞内蛋白的表达,而通心络的干预会进一步改变细胞内蛋白的表达。与正常组相比,缺氧/复氧组下调了 30种蛋白的表达水平;而与缺氧/复氧组相比,通心络干预组上调了 6种蛋白的表达,下调了 5种蛋白的表达。这些差异蛋白的功能主要包括细胞增殖,应激反应,调节细胞内代谢等。我们选取了一些在缺氧/复氧条件下发挥重要作用的蛋白如HMOX1,ANGPT2等进行进一步分析。在缺氧/复氧条件下,通心络显着抑制CMECs细胞凋亡,促进CMECs细胞增殖,迁移和成管。当同时加入HMOX1抑制剂TiiPPIX或过表达ANGPT2时,细胞凋亡数量明显增加,发生增殖和迁移的细胞数量,成管长度及血管分支数均显着减少。结论:TMT标记蛋白质谱检测帮助我们从分子水平更深入的了解缺血再灌注损伤机制及通心络的调节作用。我们确定了 CMECs细胞内与缺血再灌注损伤相关的50个差异蛋白,并分析了它们可能参与的多种功能调节及通路。缺血再灌注会显着改变CMECs细胞内多种蛋白的表达,而通心络干预会进一步改变这些因子的水平,提示通心络可能通过下调炎症因子的表达,抑制氧化应激因子,调节多种细胞内代谢活动,发挥微血管内皮保护作用。
参考文献：
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[4]. 抑制核因子-κB信号通路对大鼠心梗模型心功能的作用研究[D]. 苏福娣. 暨南大学. 2014
[5]. 温度敏感性水凝胶携带HMGB1治疗大鼠心肌梗死的实验研究[D]. 贺轶宇. 武汉大学. 2013
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[8]. 3D类心肌组织与ALGINATE水凝胶用于大鼠心肌梗死修复的研究[D]. 白秀萍. 哈尔滨工业大学. 2013
[9]. FMO2通过结合CYP2J3减轻心梗后SMAD2/3磷酸化介导的心脏纤维化[D]. 倪骋. 浙江大学. 2018
[10]. 药物提高心肌干细胞治疗急性心肌梗死疗效的实验研究[D]. 李清. 北京协和医学院. 2017
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