张桂芝[1]2001年在《单羧酸转运蛋白MCT1基因反义表达重组载体转染人肺腺癌细胞及其生物学效应的研究》文中研究指明由于肿瘤细胞糖酵解酶系的增强以及同工酶谱的改变，而且肿瘤细胞生长在一种相对缺氧的环境，因此它们常常通过糖酵解产生ATP。糖酵解过程中必然产生乳酸，如果要维持细胞内的糖酵解状态，乳酸必须被转运出细胞外。如果乳酸的外运和生成不能同步，乳酸就会在细胞内堆积，从而引起细胞内的pH值下降，导致肿瘤细胞内酸化。通常情况下，肿瘤细胞内乳酸的转运是由一个具有特定组织分布，对底物、抑制剂特异的单羧酸转运泵家族（MCT）来完成。该家族成员可催化乳酸和H~+同向跨膜转运，将大量乳酸排出细胞外，所以乳酸能否从肿瘤细胞外流就成为其生存的关键。如果能选择性地抑制肿瘤细胞的乳酸转运，可能会为肿瘤治疗提供一个新的策略。 本研究在人肺癌细胞MCT1基因序列同源性分析，MCT1mRNA半定量分析及MCT1基因反义重组载体构建成功的基础上，通过电穿孔基因转染方法将MCT1基因反义重组载体转染进入肺腺癌细胞A549中，并对其生物学效应进行了研究，对MCT基因在肿瘤细胞中的功能作用做了初步探讨。方法：（1）用电穿孔基因转染方法转染MCT1基因反义重组载体进人肺腺癌A549细胞，用RT-PCR、PCR方法证实转染的成功。（2）应用荧光分光光度计、紫外分光光度计测定细胞内pH值、乳酸含量、并通过制作生长曲线、测定细胞周期、检测原位细胞凋亡，研究转染细胞生物学效应的变化。（3）用生物发光分析法测定ATP含量的变化，研究转染细胞能量代谢的变化。（4）用裸鼠移植瘤实验，研究转染细胞的体外增殖情况。结果：（1）MCT1基因反义重组载体转染、鉴定分析结果：反义基因转染A549细胞后，经G418筛选，出现阳性克隆；之后用RT-PCR、PCR方法证实MCTI反义重组载体己经与A549细胞基因组DNA成功整合。（2）细胞内pH值、乳酸含量、生长性质测定分析结果：转染反义重组载体细胞与未转染的 A549细胞相比，细胞内 pH值降低…＜0刀of入乳酸含量升高（＜0刀5卜生长速度减弱，倍增时间延长O吻刀 1X 细胞周期受到阻滞，细胞凋亡率增加…功刀 1），差异有显着性。转染空载体细胞也有类似结果，但差异无显着性O＞0．05）。侣）ATP测定分析结果：转染反义重组载体的细胞与未转染的A549细胞相比，细胞内ATP水平明显下降，差异有显着性O＜0刀1＞转染空载体细胞ATP也有相似改变，但差异无显着性O＞0刀5）。O）裸鼠移植瘤实验分析结果：转染反义重组载体细胞较未转染的A549细胞移植瘤潜伏期长、瘤体小、瘤体重量轻，差异有显着性（叩．001卜结论八IM＊TI反义基因转染后，用RTPCR、PCR方法证实，该载体已经与A549细胞基因组DNA成功整合。o转染细胞较未转染A549细胞胞内pH值下降，乳酸升高，生长速度减弱，倍增时间延长，细胞周期受到阻滞，细胞凋亡率增加。（3）转染细胞较未转染A549细胞胞内ATP含量降低。（4）裸鼠接种转染细胞与接种未转染细胞后的成瘤情况相比，前者潜伏期长，肿瘤体积小，瘤体重量轻。这表明 MCT基因在肿瘤细胞的酸碱平衡，乳酸代谢，生长性质，能量代谢及细胞体外增殖能力方面发挥着重要调节作用。
张桂芝, 黄桂君, 郭先健, 钱桂生[2]2001年在《单羧酸转运蛋白反义基因转染人肺腺癌细胞对其生物学特性的影响》文中认为目的 研究单羧酸转运蛋白基因第一亚型 (MCT1)反义表达载体转染肿瘤细胞对其细胞内pH(pHi)调节、乳酸转运及生长性质的影响。方法 通过电穿孔法将单羧酸转运蛋白MCT1基因反义表达重组子pLXSN MCT1转染于肺腺癌细胞系A5 49中 ,经G418筛选转染细胞阳性克隆。用PCR方法鉴定MCT1反义表达重组载体在基因组的转染整合 ;以分光光度法测定pHi及乳酸含量变化 ,并以细胞生长曲线研究细胞的生长情况。结果 与未转染的A5 49细胞比较 ,转染MCT1反义表达重组载体的细胞pHi降低、乳酸显着升高 (P <0 .0 0 1) ;且细胞的生长受到明显抑制。结论 单羧酸转运蛋白MCT1基因在肿瘤细胞pHi调节、乳酸转运及细胞的生长中起着重要的调节作用。
李劲东[3]2010年在《MCT1、CD147在人肝癌中的表达及其反义RNA表达载体对肝癌细胞的影响》文中进行了进一步梳理目的：在体外试验中使用CD147及MCT1反义RNA表达载体影响肝癌细胞表面MCT1的表达,观察它对肿瘤细胞内环境的干扰、对糖酵解代谢影响和抑制肿瘤细胞生长的作用。通过免疫组化方法检测人肝癌中MCT1和CD147的表达,探讨其表达与肿瘤临床及病理学的关系。方法：体外实验采用HEPG2人肝癌细胞株进行实验。同时构建MCT1及CD147的反义RNA表达载体,用于转染HEPG2细胞株,HEPG2细胞分为未转染组,转染空质粒组和转染组,用western-blot方法检测MCT1及CD147质粒转染后对MCT1蛋白表达的影响,并用检测各组细胞内pHi及乳酸含量,绘制叁组细胞的生长曲线并记录各组生长数据,以上资料均作统计学分析。收集湘雅医院2002年-2008年间60例肝癌手术切除标本,对照组50例为正常肝组织。将肝癌标本和对照正常肝组织标本制成石蜡切片并进行免疫组化染色,检测不同病理级别及临床分级肝癌组织标本和对照标本MCT1和CD147的表达水平。结果：在细胞水平研究中,MCT1反义表达载体可抑制MCT1在细胞膜的表达,而CD147反义表达载体则可抑制MCT1在肿瘤细胞的功能,两种载体转染肝癌细胞后,均可引起肿瘤细胞pHi下降,细胞内乳酸堆积,细胞的生长受到抑制。肝癌标本中均有MCT1和CD147高表达,且临床病理级别高的肝癌组中二者表达水平低于于临床病理级别低的肝癌组,差异有统计学意义。结论：运用MCT1及CD147反义RNA表达载体转染肝癌细胞,可影响MCT1的正常表达或功能,使得肿瘤细胞pHi降低、细胞内乳酸堆积、生长受到抑制。肝癌中存在MCT1和CD147的高表达,且MCT1及CD147表达水平与病理分级程度密切相关。MCT1及CD147与肝癌患者临床预后相关,两者表达水平高,更易复发,且生存期较短。
参考文献：
[1]. 单羧酸转运蛋白MCT1基因反义表达重组载体转染人肺腺癌细胞及其生物学效应的研究[D]. 张桂芝. 第叁军医大学. 2001
[2]. 单羧酸转运蛋白反义基因转染人肺腺癌细胞对其生物学特性的影响[J]. 张桂芝, 黄桂君, 郭先健, 钱桂生. 第叁军医大学学报. 2001
[3]. MCT1、CD147在人肝癌中的表达及其反义RNA表达载体对肝癌细胞的影响[D]. 李劲东. 中南大学. 2010
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