（江西省妇幼保健院检验科；江西南昌330006）
【摘要】非小细胞肺癌NSCLC是常见恶性肿瘤，严重危害人类健康的。近年来，随着靶向治疗的发展，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKI为NSCLC的治疗带来新的曙光，但用药前必须依据表皮生长因子受体EGFR的基因突变检测结果选择治疗对象。因此EGFR基因突变成为肺癌患者应用TKI有无疗效的关键因素。探索和建立快速准确检测NSCLC患者EGFR基因突变的方法，有助于筛选出适合治疗的人群，具有较好的临床意义。
【关键词】癌,非小细胞肺;EGFR;突变;检测
Detection of EGFR gene mutation in non-small cell lung cancer
Abstract：Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a common malignant tumor, which seriously endangers human health. In recent years, with the development of targeted therapies, epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKI) bring a new dawn for the treatment of NSCLC, but the treatment must be on the basis of the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation detection results before the medication. Therefore, EGFR gene mutation has become a key factor in lung cancer patients with TKI’s effect. Objective to explore and establish a rapid and accurate method to detect EGFR gene mutations in NSCLC patients, which is helpful to screen the suitable treatment population, and has good clinical significance.
Key words：cancer, non-small cell lung; EGFR; mutation; detection
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，恶性程度高。目前，肺癌发病率和死亡率明显上升，已成为全球及我国死亡率最高的恶性肿瘤，其总体5年生存率约为10%~15%。其中非小细胞肺癌约占肺癌的80%~85%，且超过一半的患者在确诊时已属晚期[1]，失去了手术机会，而化疗则是晚期NSCLC重要的治疗手段，但是作用已达到平台。在尚无分子靶向治疗的时代，传统含铂双药化疗作为晚期NSCLC的标准一线化疗，其有效率仅为17%~32%，疾病进展时间为3~6个月，总生存期为7~11个月[2]。近年来针对EGFR为分子靶点的癌症治疗的地位越来越受到国内外的重视。其中以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)为代表的EGFR-TKI取得一定的疗效。许多研究发现EGFR基因突变与TKI的疗效密切相关。由于基因检测技术、组织标本获取困难等多种原因，致使大约70%以上的晚期非小细胞肺癌患者不能够接受基因靶向治疗，本文就非小细胞肺癌EGFR基因突变进行综述。
1.EGFR生物学特征
正常情况下，EGFR的胞外配体结合区与配体结合，使受体二聚化，形成同源二聚体或与其他家族成员形成异源二聚体。受体二聚化后构象发生改变与ATP分子结合，激活胞内的酪氨酸激酶活性，导致自身磷酸化，从而为多种下游分子提供停泊位点，启动下游信号转导通路，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。
2.EGFR基因突变
EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18~21)，目前发现的TK区域突变有30多种[3]。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是delE746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子19的缺失突变(delE746-A750)和外显子21上的替代突变(L858R)又叫经典突变或热点突变，约占突变的90%。研究还发现有L858Q、D761Y、T854A等耐药突变。
3.EGFR突变检测的方法
3.1 PCR-直接测序法
PCR-直接测序法，分析测序图谱，判断EGFR基因第18、19、20、2l外显子突变区域是EGFR突变检测的金标准[4]。多用于手术组织标本的检测，需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，费用昂贵，且对取材和技术要求比较高，更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高，只能对含量大于30%的突变基因进行检测[5]，对环境和操作者有危害，不适于大量临床样品分析。
3.2 聚合酶链式反应-单链构象多态性法(PCR-SSCP)
PCR-SSCP是一种经典的检测基因突变的方法。仅见到用于肿瘤组织检测，不能得出具体的突变类型且PCR-SSCP法的敏感性为10%[6]。PCR-SSCP法电泳时间较长，操作步骤比较繁琐，且只能进行定性分析，操作时间长。
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3.3 聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）
PCR-RFLP仅见到用于肿瘤组织检测[7],是在PCR和DNA序列分析基础上产生的RFLP技术。PCR-RFLP法相对其它方法所需仪器设备比较简单，花费较少。
3.4 PCR-TaqMan法
PCR-TaqMan法根据文献[8]报道，不能像直接测序法那样一目了然地发现EGFR外显子18-21位各种不同类型的突变，同时也存在假阴性的可能。
3.5 变性高效液相色谱法(DHPLC)
DHPLC法19外显子野生型峰明显分离[9]，且需要测序阳性的标本作为阳性对照。
3.6 蝎形探针扩增阻滞突变系统法
蝎形探针扩增阻滞突变系统法用于等位基因的鉴定，Scorpions与ARMS技术联合应用(SARMS)可检测单个突变，对于已知基因的检测，具有高度的敏感性[10]。
3.7 酶切富集PCR法
酶切富集PCR法是进行核酸扩增的有效方法。一般分两步进行，首先利用限制性内切酶去选择性消化野生型的EGFR基因片断，从而使反应体系中突变型EGFR基因片断得到富集，再通过PCR放大和凝胶电泳来进行突变的判断[11]。
4.小结与展望
当取得肿瘤组织时，直接测序法依然是当前EGFR突变检测的金标准。但由于其灵敏度低(只能检测到30%突变拷贝数)，所以当没有获取组织样本时，不推荐使用PCR-直接测序法进行EGFR突变检测。PCR-SSCP法和PCR-RFLP法仅见到用于肿瘤组织检测，未见有在其它标本中检测介绍。PCR-TaqMan法、DHPLC法、SARMS法、酶切富集PCR法均有肿瘤组织标本外样本相关研究介绍。其中DHPLC法、SARMS法和酶切富集PCR法被用于比较配对肿瘤组织和外周血样本EGFR突变比较的研究。
对于晚期NSCLC患者组织标本不易取得，使突变基因检测在临床上无法得到有效的开展，同时由于瘤细胞生长活动的动态性，组织标本在反映手术、放、化疗后一段时间内基因突变情况方面有很大局限性，使得很多基因突变阳性的潜在优势人群失去了治疗机会，因此寻找肿瘤组织替代材料用于基因诊断，寻找更加方便、快捷、准确的检测方法是当前迫切需要解决的问题。
参考文献
[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90. ?
[2]Oh M J，Choi J H，Kim I H，et al . Detection of epidermal growth factor receptor in the serum of patients with cer- vical carcinoma [J]. Clin Cancer Res， 2000， 6 ∶ 4760 - 4763.
[3] 李向莲，唐雪莉等。EGFR_TKI与化疗比较一线治疗晚期非小细胞肺癌有效性和安全性的系统评价。中国循证医学杂志 2016, 16(2): 191~199
[4]Jorissen RN, Walker F，Pouliot ,et a1.Epidermal growth factor receptor: medchanisms 0f activation and signaling[J],Exp Cell Res，2003，284 (1):31.
[5]Dutta P R, Malty A. Cellular responses to EGFR inhibitors and their relevance to cancer therapy [J]. Cancer Letters, 2007, 254 (2): 165-177. ?
[6] Irmer D, Funk J O, Blaukat A. EGFR kinase domain mutations - functional impact and relevance for lung cancer therapy [J]. Oncogene, 2007, 26: 5693-5701. ?
[7] Cao C, Lu S, Sowa A, et al. Priming with EGFR tyrosine kinase inhibitor and EGF sensitizes ovarian cancer cells to respond to chemotherapeutical drugs [J]. Cancer Letters, 2008, 266 (2): 249-262. ?
[8] Sharma S V, Bell D W, Settleman J, et a1. Epidermal growth ? factor receptor mutations in lung cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(3): 169-181.
[9] Yatabe Y. EGFR mutations and the terminal respiratory unit[J]. Cancer and Metastasis Reviews, 2010, 29 (1): 23-36.
[10] Jemal A， Thomas A， et al. Cancer statistics CA [J]. Cancer J Clin，2002，52 ( 1) ∶ 23.
[11] Paez J, Janne P, Lee J, et al. EGFR mutations in lung cancer: Correlation with clinical response to ge tinib therapy. Science, 2004, 304(4): 1497-1500.
论文作者:马增力
论文发表刊物:《医师在线》2018年4月下第8期
论文发表时间:2018/7/8
标签：突变论文; 肺癌论文; 组织论文; 基因论文; 基因突变论文; 标本论文; 细胞论文; 《医师在线》2018年4月下第8期论文;