（无锡市中医医院 江苏 无锡 214000）
基金支持：江苏省第十三批“六大人才高峰”高层次人才选拔培养资助项目（WSN-242）；江苏省中医药科技项目（编号LZ11125）；无锡市卫生局卫生科技项目(MD201211)
第一作者简介:王继红，女，1973年生，辽宁省锦州市人，汉族，医学博士，主任医师。研究方向糖尿病视网膜病变的分子生物学机制及中西医治疗。
摘要 目的 探讨法舒地尔（fasudil）在高糖条件下对猴脉络膜 -视网内皮细胞 (RF/6As)损伤时的单层通透性及Occludin表达的影响。 方法 体外培养 RF/6As,分为等渗葡萄糖处理组 (对照组 )、40mmol/L葡萄糖处理组 (高糖组 )及 fasudil +40mmol/L葡萄糖处理组 (fasudil +高糖组 )。各组分别培养 1、3、5、7 d,应用倒置显微镜观察培养的 RF/6As形态 ,以辣根过氧化物酶 (HRP)作为示踪剂用二室弥散系统检测 RF/6As单层通透性的变化 ,采用 Western blot法检测Occludin在 3 d、7 d各组细胞中的表达量。 结果 第 3、5、7天 ,高糖组 RF/6As随时间延长逐渐变形 ,正常细胞数量明显减少 ,单层通透性逐渐增加 ;3个时间点 HRP的 A值分别为 0.058±0.015, 0.116± 0.027, 0.217 ±0.036明显高于对照组 ,差异均有统计学意义 (P < 0101)。fasudil +高糖组仅于 7 d时细胞形态略有改变 , 5 d及 7 d时 HRP的 A值分别为 0 .067±0.004和 0.113±0.008,较对照组有所增加 ,差异均有统计学意义 (P < 0.01) ;但明显低于高糖组 ,差异均有统计学意义 (P < 0.01)。Western blot检测显示 , 7 d时 fasudil+高糖组Occludin灰度值为0.69±0.14，,高糖组为0.45±0.13差异有统计学意义(P <0.01)。 结论 高糖可引起 RF/6As单层通透性增加及 Occludin的表达降低 ,而 fasudil可通过上调Occludin的表达,从而减轻高糖引起RF/6As的损伤，对糖尿病视网膜病变起到预防和保护作用。
关键词：法舒地尔、高糖、RF/6As、Occludin、通透性
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR) 糖尿病的主要微血管并发症之一[1]。临床流行病学统计在发病15-20年的糖尿病患者中的DR发病率高达62.5%,成为致盲的主要原因[2]。糖尿病患者视网膜微血管细胞长期处在高糖的环境下。导致细胞壁通透性增加，脆性加大，过度增殖、出血、血管闭塞等病理变化，终末致使视网膜微血管细胞结构完全丧失，进而导致患者出现不同程度的视力下降，严重者出现是失明[3]。血－视网膜屏障稳定的稳定，有赖于血管内皮细胞、周细胞、基底膜结构和功能的完整性。Occuldin是一种重要的跨膜蛋白作为内皮细胞间紧密连接的主要成分，是导致细胞收缩,内皮细胞裂隙形成,通透性增高的重要原因。Rho/ROCK信号通路在细胞连接 、肌动蛋 白细胞骨架重组 、细胞迁移等方面均起到重要 作用 ，并可通过磷酸化肌动蛋白轻链(m yosin light chain ，M LC )影 响应力纤维和黏着斑的形成[4]。随着对 R ho／R O CK 通路研究 的深入 ，逐渐发现 R O CK 与血糖 的重 要关系。机体 内高浓度的葡萄糖水平可以上调 RO C K 的表达 ，从而激活体内多个 ROCK 的下游信号通路，导致平滑肌功能异常、炎症反应、蛋白合成异常等，而这些均与糖尿病的多项并发症密切相关。而在高糖环境下视网膜内皮细胞的损伤是否有该通路的参与国内外相关的报道还较少。而盐酸法舒地尔作为ROCK特异的抑制剂，可用于治疗 心力衰竭 、心肌梗死等多种疾病 。但在糖尿病视网膜病变治疗的应用还比较少。因此通过本研究探讨高糖条件下猴脉络膜 - 视网膜内皮细胞(RF/6As)损伤时的单层通透性、Occuldin的变化及法舒地尔对上述变化的影响及机制 ,现报道如下
1 材料与方法
1. 1 材料
RF/6As(中国科学院上海细胞库 ) ;MEM培养基(美国 Gibco公司 ) ;胎牛血清 (美国 Hyclone公司 ) ;D2葡萄糖、HRP、罗丹明标记毒伞素 (美国 Sigma公司 ) ;fasudil (天津红日药业股份有限公司)。Transwell培养板 (美国Corning公司 ) ; Power Pac 3000型电泳仪、680型酶标仪 (美国 B IO2RAD公司 ) ; 922Ⅱ型超声波细胞粉碎机
(宁波新芝科器研究所 )。
1. 2 方法
1. 2. 1 细胞培养及实验分组 RF/6A细胞在 MEM完全培养基中于 37 ℃、体积分数 5%CO2、饱和湿度孵箱中培养 ,按照 1∶2～1∶4传代培养 ,传 3代以上的细胞用于实验 ,待细胞生长至 70%融合时换以 MEM完全培养基为基础的条件培养基 ,分为 3组。对照组:MEM培养基中含葡萄糖 5.5 mmol/L;高糖组:MEM培养基中含葡萄糖 40 mmol/L; fasudil +高糖组:MEM培养基中含葡萄糖 40mmol/L +fasudil (10μmol/L)。分别于 1、3、5、7 d进行观察并拍照。
1. 2. 2 致密 RF/6A单层通透性的检测 参照 Essler等[5]的 方 法 , 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 ( horse radishperoxidase, HRP)作示踪剂 ,检测血管内皮细胞单层的通透性变化。将 RF/6A 细胞接种在 Transwell小室(直径 12 mm,孔径 3μm)多聚碳脂滤膜的弥散模型中 细胞接种密度为 3 ×105/小室 , 24 h后细胞基本贴壁并融合为致单层 , PBS液洗涤 3遍 ,并分组加入条件培养基 ,培养至 1、3、5、7 d时进行检测 ,检测前 4 h换成相应的无血清培养基 ,用 PBS冲洗 3遍整个体系均换成 PBS,每孔加入 0134 g/L HRP溶液 100μL,作用 5 min后 ,取下室液 50μL与 850μL HRP反应液混合 (0.05 mol/L PBS,体积分数 013%H2O2, 012%愈创木酚溶液 ) ,室温下反应 15min,加入 2mol/L H2SO4100μL终止反应。用酶标仪检测 HRP在 470 nm处的吸光度 (A)值。HRP的 A值是反映 RF/6As单层通透性的指标 ,A值越大 , RF/6As单层通透性越强。
1. 2.3 Western blot检测 Occludin的表达 细胞分组培养后 3 d、7 d,弃培养液 ,用温 PBS冲洗 2～3遍 ,加入适量预冷裂解液置于冰上裂解 15min,用细胞刮刀刮下细胞 ,收集于 EP管内 , 200W超声裂解细胞 3 s ×2次 , 4 ℃、1 000 g离心 2 min。采用考马斯亮蓝法 ,测定上清蛋白浓度 ,将所有蛋白样品调至等浓度上样(上样前 100 ℃水浴 3 min) ,以 80 V电压常规 SDS2PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上 ,用封闭液 (1 ×TBST, 5%脱脂奶粉 ) 4 ℃封闭过夜 ,再用抗体稀释液(1 ×TBST, 1%脱脂奶粉 ) 1∶250稀释一抗 ,与经封闭液处理的 PVDF膜置于小封口塑料袋内 37 ℃孵育2 h。1 ×TBST液洗膜 3次 ,每次 20 min。然后以同样方法 , 1∶4 500稀释二抗 , 37 ℃孵育 1 h, 1 ×TBST液洗膜 30 min ×3次。将膜置于 10 mL含 BCIP (33μL) /NBT(66μL)的染色液中 ,于室温下轻轻振摇 ,使蛋白条带逐渐显影、定影 ,胶片洗涤干燥 ,利用 Kodak电泳图像分析系统对图片各电泳条带亮度进行扫描 ,以 β2actin为对照 ,对显影相对强度进行统计分析。
1. 3 统计学方法
采用 SPSS 1310统计学软件进行统计分析。实验测试指标以用均数±标准差（mean ± S D )表示,采用 Levene检验证实各组数据资料方差齐。不同时间点各组 HRP A值的差异比较、不同时间点各组表达量的差异比较均采用单因素方差分析 ,组间的多重比较采用 LSD2t检验。P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 各组 RF/6As形态的变化对照组 RF/6As呈单层扁平上皮状 ,多数为椭圆形 ,少数呈梭形 ,细胞界限清楚 ,呈典型的鹅卵石样外
观 (图 1A)。高糖组随着时间的变化 RF/6As形态则明显不同 : 3 d高糖组 RF/6As胞体边缘出现收缩 ,部分细胞变圆 ,部分形态不规则; 5 d高糖组 RF/6As大部分伸出突起 ,形态呈不规则形 ,且细胞边界略显模糊 ,细胞间隙增大; 7 d组 RF/6As收缩明显 ,部分伸出长伪足 ,胞体变形 ,边界模糊 ,细胞间形成明显的裂隙 ,细胞生长数量较对照组明显减少 (图 1B)。fasudil +高糖组 3个时间点细胞形态变化不大 ,仅 7 d时细胞略变圆 ,细胞数量略减少 (图 1C)
2. 2 RF/6As单层通透性的变化
细胞培养 1 d时 ,对照组、高糖组、fasudil +高糖组 A值分别为 0.009 ±0.001、0.032 ±0.032、0.010 ±0.001,组间比较差异无统计学意义 ( F = 1.380, P >0.05) ,高糖组 RF/6As的通透性随着时间的延长而逐渐增强。7 d时对照组、高糖组、fasudil +高糖组 A值分别为 0.013 ±01002、0.217 ±0.036、0.113±0.008,组间比较差异有统计学意义 (F = 56.877, P <0.01)。LBP +高糖组在培养 5 d及 7 d时的 A值较相同时间点高糖组低 ,差异均有统计学意义 ( t = 5.064,P <0.01; t =4.933, P <0105) (表 1)。
表1 各时间点不同组别间EC单层通透性的变化比较( ,n=3)
注 ★p<0. 01vs对照组; ▲p<0. 01vs高糖组；
2. 3 Western blotting检测Occludin蛋白表达量
Western blot检测结果显示 ,在高糖条件下Occludin的表达量随间的增加而升高 , 3 d、7 d时高糖组与对照组比较 ,差异均有统计学意义 ( t = - 8.543, t =- 20.143, P <0.01) ,而这种增高趋势可被fasudil抑制 ,
7 d时fasudil +高糖组、高糖组0.45±0.13的表达量分别为
0.69±0.14、0.45±0.13、,组间差异有统计学意义 ( t =13.380, P <0101)
Western blot检测Occludin表达的结果
A组:对照组；B组：高糖组3天，C组：高糖组7天；D组：fasudil +高糖组3天
E组： fasudil +高糖组7天
讨论
早期的糖尿病视网膜病变是以毛细血管形态和功能改变为典型特征，内皮细胞对血管通透性的调节与其表面结构、细胞与基底膜之间的黏附和细胞与细胞之间的连接有密切关系。血－视网膜屏障的完整性是由紧密连接(tight junction，TJ)和黏附连接构成的密封的连接复合体决定的。紧密连接负责细胞之间的屏障功能，跨膜蛋白、胞质附着蛋白及细胞骨架蛋白共同组成了TJ，Occuldin是一种重要的跨膜蛋白。Occuldin在脑血管内皮中表达最高。其作用（1）紧密连接的重要结构蛋白；（2）调节功能，Occuldin是紧密连接中关键的一个调节蛋白；（3）信号传导，Occuldin蛋白的C末端同时还有信号传导功能，调节Occuldin蛋白的二聚体(4)协同作用，Occuldin与另一种跨膜蛋白Claudin的共聚作用对紧密连接的稳定方面起到重要的作用[6]
糖尿病视网膜病变中最早出现的临床可检测的表现之一为血管渗漏，提示血－视网膜屏障功能的异常是一种早期事件。可能与Occludin 蛋白和Claudin家族蛋白存在着密切的联系，葡萄糖，可以激活Na+与葡萄糖的共转运系统。在上皮层顶端表面加入葡萄糖会导致细胞旁通透性增加和TER值降低，伴随着许多形态学变化，如TJ向内膨胀和ZO-1与TJ分离，Ocucldin和Z0-2重新分布，肌球蛋白轻链磷酸化和连接周围肌动蛋白和肌球蛋白环收缩导致TJ开放。
在本实验证明高糖组随着时间的延长视网膜内皮细胞的通透性增强，说明明 ,高糖环境可以诱导 RF/6As的通透性增强并呈时间依赖关系与刘学政等[7]的研究相一致。与此同时Ocucldin的表达与随着高糖的损害而不断的较少。跨膜蛋白Occludin的低表达恰恰证明了通透性的增强是紧密连接蛋白功能下降的重要因素，这点充分说明了，高糖引起的渗漏性增强的机制中，Ocucldin蛋白的表达降低，导致紧密连接的破坏很可能就是其中的重要机制之一。
R ho／R O c K 信号通路是 真核细胞 内一类非常重要 的信 号转 导途径 。 目前 已有 大量 研究关 注，R ho／R O C K 信 号通 道 是 否 参 与多 系统病理生 理 过程 ，及 该 信 号 通 道 失 调 与 细 胞 增 殖 、迁移 、存活 及凋 亡 的关 系。近期 研究 发 现，R ho／R O CK 信号通道在 中枢神经系统损伤后 被异常激活 ，抑 制通 道可 以通 过 多 种机 制 改 善 神 经功 能 的恢复。而 目前其在临床上的应用多基于抑制平滑肌 收缩 而扩张血 管 的机 制 ，如 蛛 网膜 下腔 出血后脑血管痉挛 、冠状动脉狭窄等缺血症状 的改善[8]。然而 R ho／R O c K 信号 通路作用十分广 泛，在糖尿病视网膜病变中发挥作用 的具体机制不完全清楚 ，因此 ，实验着眼于调节 R ho／R O c K 信号通路是否可以视网膜内皮细胞的紧密连接 ，为DR患者的临床干预提供新思路 。
酸法舒地尔(hydroxyfasudil)，是法舒地尔的主要代谢产物，对Rho激酶具有更特异的抑制效应。它们与BA竞争Rho激酶催化结构域的ATP结合位点从而抑制了Rho激酶的活性。肌球蛋白磷酸化酶通过肌球蛋白结合亚基与磷酸化的肌球蛋白轻链(MLC)相结合，并使其脱磷酸。Rho激酶可磷酸化肌球蛋白结合亚基，从而导致MLCP失活[9]。法舒地尔于1999年在日本上市，临床用于改善和预防蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛及引起的脑缺血症状。
而本实验中法舒地尔作为Rho信号通路的抑制剂，正是因为其抑制了高糖激活的Rho/ROCK信号通路，抑制ROCK的活性，使肌球蛋白轻链去磷酸化，从而抑制了紧密连接蛋白的构型的改变，稳定了紧密连接，当然也保护了视网膜血管内皮细胞的通透性，综上所述法舒地尔可以抑制高糖条件下血管内皮细胞Occludin蛋白的低表达的，从而降低了血管内皮细胞的通透性，对高糖损害下的视网膜内皮细胞有较好的保护作用。
参考文献
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附图
论文作者:王继红、王科蕾、唐颖、周倩倩
论文发表刊物:《医师在线》2018年2月上第3期
论文发表时间:2018/5/4
标签：细胞论文; 视网膜论文; 通透论文; 内皮论文; 蛋白论文; 单层论文; 统计学论文; 《医师在线》2018年2月上第3期论文;