何文喜[1]2003年在《Smads信号分子在成牙本质细胞分化中作用的研究》文中指出转化生长因子β1(Tansforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种多功能的生长因子，参与调控细胞许多生理活动，包括细胞增殖、分化、凋亡、基质分泌和免疫反应。TGF-β1通过细胞膜表面Ⅰ、Ⅱ型丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶受体发挥其生物学效应，TGF-β1结合到细胞膜表面引起Ⅰ型受体被Ⅱ型受体活化，活化后的Ⅰ型受体作用于下游的途径限制性Smads，Smad2或Smad3，使其磷酸化。磷酸化后的Smad2或Smad3与一种共同中介型Smad，Smad4，形成异源寡聚物，转位至细胞核内。在细胞核内，Smad2／4或Smad3／4异源寡聚物，或者通过结合DNA结合蛋白，或者通过直接结合基因启动子上DNA序列，调控目的基因的转录。Smad7属于抑制性Smads，它可能通过竞争结合Ⅰ型受体或Smad4，从而抑制TGF-β1信号转导。 研究表明TGF-β1参与调控成牙本质细胞分化和牙本质形成。前成牙本质细胞和成牙本质细胞均表达TGF-β1 mRNA，分化成熟的成牙本质细胞表达并分泌TGF-β1沉积在牙本质基质中，当牙髓损伤时，牙本质内的TGF-β1可以被释放出并参与第叁期牙本质形成。研究认为TGF-β1是牙本质基质中的活性成分，参与调控细胞生长、分化和基质合成。研究牙本质形成和牙釉质形成时TGF-β1作用时发现，在牙发生早期，TGF-β1 mRNA表达量较低，当基质开始形成时，TGF-β1 mRNA表达量上调。体外培养牙乳头器官发现TGF-β1影响成牙本质细胞分化。基因敲除TGF-β1发现TGF-β1(-/-)小鼠磨牙咬合面出现牙釉 第四军医大学博士学位论文 质和牙本质明显的磨损。TGF仔 过表达的转基因小鼠发现 TGF6调控牙本质 涎磷蛋白（DSPP）的表达，而后者在正常牙齿矿化过程中发挥关键的调控作用。 尽管有关 TGF乃 的研究取得如此多的进展，但是目前尚未阐明 TGF乃 在成 牙本质细胞分化和细胞外基质生物合成中作用的分子机制。 本课题研究的目的是观察 Smads信号分子在 TGF印调控成牙本质细胞分 化和细胞外基质蛋白合成中的作用，探讨 TGF6在成牙本质细胞分化和细胞 外基质合成中的作用机制。本研究包含叁个部分： 第一部分Smads在MDPC毛3细胞中的表达、调控及其在TGF个1信号途 径中作用的研究 在这个部分，首先对从 Dr．Jacques E．Nor获得的成牙本质细胞样细胞系 MDPC－23的生物学特征进行了研究。结果表明MDPC－23保持了其原有的特性， 主要包括1）上皮样细胞形态，有多个细胞膜突起；2）易形成细胞结节，细胞 倍增时间少于 24h；3）表达 1型胶原、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、 骨桥素（OPN）和牙本质涎磷蛋白（DSPP）。 其次，对Smads分子在MDPC工3细胞内的表达、调控及其功能进行了研究。 半定量RT－PCR方法发现SmadZ、3、7均在MDPC－23细胞内表达石madZ mRNA 表达不受 TGF卡 刺激的影响，Smad3 mRNA表达在 TGF仔 刺激 4h后开始下 调，Smad7 mMA的表达则受 TGF6快速诱导而上调，在 90 ruin达到最高峰， 以后逐渐下降。免疫组化法发现SmadZ和 Smad3在TGF乃 刺激 lh后从胞浆 向胞核转位，而Smad7在细胞浆的表达虽然明显增加，但细胞内定位未见任何 变化。通过共转染一个TGF6反应性报告基因载体，p3TPLux，研究Smad 在 TGFf 诱导的转录调控中的功能。结果表明 Smad3，而不是 SmadZ，增强 TGF仔l诱导的转录调控，Smad7则抑制TGF乃l诱导的转录调控。 第二部分Smads在TGF个1调控MDPC－23细胞分化中作用的研究 在这个部分，为了观察Smads分于在MDPC上3 细胞中的作用。用 LipofectAMINE法分别将SmadZ、Smad3及它们的突变体稳定转染至MDPC上3 细胞内，用 300卜g／Inl G418筛选 2周后得到阳性克隆。阳性克隆用 amFlag单 D幼artment Of枷eranve Dent。叩。＂dEn砌加ti。5 第四军医大学博士学位论文克隆抗体通过Western免疫印迹杂交进一步鉴定。 利用这些稳定转染Smads的细胞系，首先观察Smads是否参与TGF扒对MDPC23的生长抑制作用。MH法和 FCM发现 TGF乃 显着抑制 MDPC上3细胞增殖。过表达SmadZ或SmadZAC均中度抑制MDPC－23细胞生长，但SmadZAC的作用较SmadZ弱。增强Smad3表达产生比SmadZ过表达更强的生长抑制效果，但是 Smad3D对细胞增殖无明显影响。在 10ng／ml TGF个作用下，SmadZ或Smad3过表达都明显增强TGF仔l的生长抑制效果，但是Smad3的效果较SmadZ强。TGFpl存在时，表达SmadZAC或Smad3D均显着抑制了TGF乃l的生长抑制作用，只不过SmadZAC 的作用较Smad3D弱。这些结果表明MDPC－23细胞内 SmadZ和 Sma3都是 TGFf 生长抑制作用的信号分子，但是Smad3比SmadZ更有效。 接着，研究了 Smads是否参与 TGF刊对牙本质细胞外基质蛋白的调控。结果表明TGF－pl抑制OC和DSPP的表达，但是却增强COLIAZ和O地的表达。无论是否存在TGF＊ 刺激，SmadZ和SmadZAC 对COLIAZ、OPN和DSPP的表达无明显影响。SmadZ过表达造成OC表达
高杰[2]2005年在《Smad3对牙本质涎磷蛋白基因表达调控的研究》文中进行了进一步梳理牙齿的发生源于上皮-间充质细胞的相互作用和相互诱导,从而激发成牙本质细胞和成釉细胞的分化、成熟、合成和分泌细胞外基质,然后羟基磷灰石晶体沉淀,矿化开始。牙本质形成和矿化是牙齿发育和牙齿损伤修复过程中的重要环节。目前研究证实,成牙本质细胞表达和分泌的牙本质非胶原蛋白,特别是牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein,DPP)被认为是牙本质特异性蛋白,在牙本质生物矿化、维持矿化组织稳定中发挥着关键的调控作用。这两种蛋白是由同一种蛋白—牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因的表达产物裂解而成,而且DSPP基因也是遗传性牙本质发育不全Ⅱ型和Ⅲ型的致病基因,表明DSPP基因的正确表达调控与牙本质形成和矿化密切相关。随着对DSPP基因和蛋白功能研究的进一步深入,DSPP基因的表达调控已经成为目前国内外研究的焦点。 研究表明,DSPP基因的表达调控是一个多因素共同参与的、复杂的过程。其中,TGF-β1作为一种重要的生长因子,在成牙本质细胞分化、牙本质基质形成和矿化过程中均发挥着关键的调控作用,并且可以调控DSPP的表达。现在认为,Smad3是TGF-β1在细胞内的特异性信号分子,主要功能是将TGF-β1信号从胞浆转位至胞核内,调控目的基因的转录。但是Smad3是否能够将TGF-β1信号转位,从而调控DSPP基因的转录与表达,目前尚未见到相关报道。根据Smad3与其它基因的结合元件SBE的序列CAGAC(C/A),或者是其互补序列(T/G)GTCTG,推测其在DSPP启动子上也应该有相应的结合元件。现在已证实,转录因子Cbfal参与了DSPP的转录调控过程,但是Smad3能否和Cbfal协同作用,调控DSPP的表达,也未见到相关报道。因此研究Smad3对DSPP基因表达调控的
臧晓霞[3]2001年在《人牙乳头细胞内Smad5、6在BMP2信号转导中作用的研究》文中研究表明龋病、牙髓病、牙齿发育异常为口腔常见病、多发病，主要的危害是引起牙体牙髓损伤，甚至导致牙齿松动、脱落。因而阐明牙髓组织的损伤修复机制及牙胚发育发生机制是口腔内科学研究的热点问题。成牙本质细胞分化是牙体牙髓损伤修复过程中的关键环节，也是牙胚发育过程中的重要阶段。 骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）属于TGF-β细胞因子超家族，在细胞生长、分化、凋亡和机体各种组织、器官形态发生中起重要的调控作用。在牙髓生物学领域，BMP在牙胚发育、成牙本质细胞的分化和牙髓损伤修复过程中的作用受到国内外学者的关注。研究结果表明，BMP作为上皮释放的一种信号分子参与调控牙胚发育和成牙本质细胞分化。由于成牙本质细胞在牙齿矿化、牙髓损伤修复过程中发挥重要的作用，其分化机制是当今牙髓生物学重要的研究课题之一。牙乳头细胞（humandental papilla cells，HDPC）是牙胚发育过程中具有分化形成成牙本质细胞潜能的间充质细胞群，因此牙乳头细胞常作为研究成牙本质细胞分化过程及机制的实验模型。研究牙乳头细胞内BMP2调控信号转导途径，为阐明BMP在成牙本质细胞分化、牙本质形成和矿化过程中的作用，揭示牙髓组织的损伤修复机制以及牙胚发育发生机制提供一定的理论和实验依据。 1996年，Hoodless克隆发现了Smadl信号分子，并在此基础上成功克隆了Smad5、6，使BMP的信号转导途径获得突破性的进展。研究证实，Smad5是BMP受体下游的信号分子，它能特异的转导BMP的信号至细胞核内，发挥基因的调控作用，Smad6是BMP信号转导过程中的抑制分子，它通过与细胞表面BMPⅠ型受体竞争结合，对Smad5信号转导过程起抑制作用。 第四军 硕士学位论文目前，有掰胚发育过程中和瓜乳头细胞中是否存在Smads、6的表达，及其对BMPZ调控牙胚发育和牙乳头分化过程中的影响，国内外尚未见报道。 本研究目的是鹏大硼厨胚发育腑中是否存在Smads、6的表达及变化；鹏瓜乳头细胞内是否存在Smads、6的表达、及在BMPZ刺激作用下Smads、6能否特异地转导BMPZ信号；以及人牙乳头细胞内Smads、6蛋白表达量与BMPZ的关系，从细胞内信号转导水平删BMPZ调控牙乳头细胞分化机理和钙化的分子机制。本研究分叁个实验： 1．Smads、6在大鼠及人牙胚发育过程中甜的研究 采用连续的大鼠和人牙胚的切片，进行常规兔疫组化染色。结果： Smads在大鼠牙胚发育硼呈现不同时空的越： 帽状期：Smads在成釉器内釉上皮细胞呈强阳性表达，外釉上皮星网 状层细胞呈阴性表达，牙囊、牙乳头细胞呈阳性表达。 钟状早期：内釉上皮细胞呈强阳性表达，中间层细胞阳性表达，牙乳 头细胞呈弱阳性表达。 钟状晚期：成釉细胞、成牙本质细胞呈强阳性表达，牙乳头细胞呈阳 性表达。 Smads在人牙胚发育各期呈现不同时空的表达 蕾撇：在牙板和翩器为阳性表达。 钟状早期：内釉上皮细胞呈强阳性表达，中间层细胞阳性表达，牙乳 头细胞呈弱阳性表达。 钟状晚期：成釉细胞、成牙本质细胞呈强阳性表达，牙乳头细胞呈阳 性表达。 Smad6 t鼠和人牙胚发育溯的表达部位与Smads相同，侄Q臼良达 均弱于s——ds。 3 第四军医大学硕士学位论文 工BMPZ作用下瓜乳头细胞内Smads。6的转位变化的研究 贻5代Il3PC，制备细娜片，分为叁组，100ng／Inl BWZ刺激组，2．sng／ml TGF下 刺激组和对照组，刺激培养 lh，4％多聚甲醛固定 30min后，常规免疫组化染色。结果：对照组Smads、6位于胞浆，胞核未见阳性染色；TGF下 组与对照组无显着差异，Smads、6位于胞浆，胞核未见阳性染色；BMPZ组胞核Smads强阳性染色，胞浆弱阳性染色，Smad胞浆强阳性染色，细胞核未见阳性染色，。 3．BMPZ作用下厨乳头细胞内Smads、6蛋白质表达变化的研究 取第 5代 HDPC细胞，分另用含有或不含有 100ng／Inl BMPZ刺激培养6h、12h、2奶、48h后，提取总蛋白质。用 Smads（l：200）和 Sm刎6抗体（l：300） 进行Western印迹杂交。结果：HDPC在BMPZ刺激作用48h内，细胞内Smads 的蛋白表达量未见明显变化；Smad6的蛋白表达量在BMPZ刺激作用6h内 可见蛋白量的明显增加，胳时间段内未见明显变化。 本研究观察到Smads、6在大鼠和人牙胚各期的发育同时存在表达，而 且呈一定的时空分布。结果表明Smads、6在牙胚中的肺与BMPs在牙胚 中的分布有相似视，Smads和Smad6的同时出现表明在BMPS、6 调控牙胚发育的过程中可能存在一个完整的反馈系统，B硼可能通过 Smads、6精确地调控下游目的基因的表达。本研究还通过贩组化法，观 察Smads、6在BMPZ和TGF小 刺激作用下，Smads． 6的变化。结果表 明BMPZ，而不是TGF小，ggw导Smads从胞浆转位至核内聚集，颁
朱明慧[4]2004年在《核转录因子激活蛋白-1在牙胚发育中作用的实验研究》文中研究指明转录因子是一类可以通过与下游靶DNA结合，从而调控下游基因转录的分子，它们接受来自生长因子等方面的信号，再将这些指令具体地传递给直接执行功能的蛋白分子。核转录因子激活蛋白-1(AP-1)就是其中一类。近年来国内外学者发现AP-1在牙齿发育过程中有表达，而且牙齿特异性蛋白如牙本质涎磷蛋白(DSPP)、釉原蛋白(Am)、牙本质基质蛋白(DMP1)等基因的启动子上存在AP-1的结合位点。 AP-1最常见、最典型的形式是由c-fos和c-jun组成的二聚体形式，因此本研究从c-fos和c-jun切入，采用免疫组化、蛋白印迹、细胞培养等方法，研究AP-1在牙胚发育过程中的作用，观察人牙乳头细胞内c-fos和c-jun在生长因子BMP2、TGF-β1信号转导中的作用，以及生长因子对二者表达水平的调控方式，旨在从细胞内信号转导水平探讨成牙本质细胞分化和牙本质形成的分子机理，为进一步深入研究AP-1在牙齿发育过程中的分子调控机理提供一定的实验依据。研究内容及结果如下： 1．c-fos和c-jun在鼠牙胚发育过程中的表达第四军医大学硕士学位论文 根据大鼠、小鼠牙胚发育时序，采用免疫组化方法观察大鼠、小鼠牙胚发育不同阶段c一fos和c一jun的表达特性。结果显示:从表达模式来看，大鼠和小鼠没有明显差异，而c一fos和c一jun表达略有不同。c一fos在牙胚蓄状期呈阴性表达，帽状期表达广泛，成釉器各层细胞均有表达，其中以内釉上皮表达最强。c一jun在鼠牙胚蕾状期、帽状期呈阴性表达。钟状期，前成牙本质细胞、前成釉细胞及功能型成牙本质细胞和成釉细胞中c一fos和c一jun均为阳性表达，且随着矿化组织的形成表达逐渐减弱。二者在中间层亦呈强阳性表达，牙乳头细胞和星网层细胞弱阳性表达。总之，c一fos和c一jun的表达随牙胚发育成熟有减弱的趋势，提示二者可能参与了成牙本质细胞、成釉细胞的增殖分化以及上皮一间充质间信号转导过程。2.c一fos和c一jun在人牙胚发育过程中的表达 利用免疫组化技术观察c一fos和c一jun在人牙胚发育不同时期的表达。结果显示，二者的表达与鼠牙胚中的表达相似，但明显滞后于鼠.钟状期以前c一fos、c一jun均为阴性表达。钟状期c一fos和c一jun在前成牙本质细胞和前成釉细胞中呈阴性表达:但随着细胞分化和基质分泌，c一fos和c一jun表达逐渐增强，且阳性部位多集中在成釉器的远中侧。牙本质形成期，二者在成牙本质细胞中强阳性表达。结果提示c一fos和c一jim参与了调控成牙本质细胞、成釉细胞的核内基因表达过程，以及牙本质形成过程中细胞外基质蛋白的合成分泌。3.BMPZ、TGF一pl作用下人牙乳头细胞。一fos和e一jun转位变化 本实验通过免疫组化和图像分析法半定蛋观察特定浓度的BMPZ、TGF-pl在不同时间点对人牙乳头细胞c一fos、c一jun表达的影响。取生长良好的第五代人牙乳头细胞，分为实验组与对照组。对照组人牙乳头细胞胞浆c一fos、c一jun表达阴性，胞核不表达或弱阳性表达。实验组分别以Zoong/mlBMpZ、sng/mlTGF一日1作用于人牙乳头细胞。刺激30min，胞核、胞浆均有阳性着色;lh胞核着色明显加深;2h胞核着色达到最强，随后逐渐渐弱;6h胞核仍呈阳性着色，但较2h弱;至12h胞核着色明显变浅，24h基本已无阳性着色。结果说明BMPZ、TGF一旦1呈时间依赖性诱导人牙第四军医大学硕士学位论文乳头细胞c一fos和c一jun表达，整个过程约持续24小时。4.BMPZ、TGF一pl作用下人牙乳头细胞内c一fos和c一jun蛋白表达水平的变化 本组实验采用We Stern一blot方法，对BMPZ(200ng/ml)、TGF一日1(sng/ml)分别作用于人牙乳头细胞zh、Zh、6h、12h、24h、48h后e一fos、e一jun蛋白水平的表达变化进行研究。结果显示:细胞内c一fos、c一jim蛋白表达水平在BMPZ、TGF一pl作用1h内有显着增加，Zh达峰值，在2h一12h内蛋白表达水平逐渐渐弱，24h表达基本消失。提示:BMPZ、TGF一日1通过增加c一fos和c一jun的蛋白表达数t来发挥作用。 由于蛋白质的表达是其功能的指征，因而牙齿发育过程中c一fos和c一jun蛋白特异性的时空表达模式说明，转录因子AP一在成牙本质细胞和成釉细胞分化、基质分泌及矿化阶段发挥着转录调节作用。BMPZ、TG卜pl可诱导人牙乳头细胞c一fos、c一jun表达。本研究从体内、体外两方面证实了AP一1在牙齿发育中的作用，为在转录水平深入探讨AP一1与牙齿发育密切相关的DSPP、Am等相互作用的分子机理莫定一定的理论基础，为最终实现牙再生提供重要的实验依据。
姜永[5]2006年在《成纤维细胞生长因子18对成牙本质细胞分化的作用及信号传导通路的研究》文中研究说明成牙本质细胞是牙髓-牙本质复合体的特征性细胞，具有高度分化、极性和分泌的特性，是合成和分泌牙本质基质的唯一细胞。成牙本质细胞可以在牙齿发育期间生成牙本质，也是牙齿损伤修复中起主要作用的细胞。成牙本质细胞分化是牙胚发育的重要阶段，也是牙髓组织自身损伤修复过程中的关键环节。这一过程受多种信号分子的调控，从基因表达水平阐明成牙本质细胞分化的调控规律及其影响因素有助于对牙齿发育、损伤与修复等过程的深入认识。 成纤维细胞生长因子18(Fibroblast growth factor 18，FGF18)是1998年发现的成纤维细胞生长因子家族的新成员，与FGF8和FGF17属于同一亚家族。研究证实FGF18是一种发育组织重要的分泌性信号分子，参与多种组织的发育，尤其在外胚层器官比如脑的发育等过程中起了重要作用。在胚胎的骨和软骨中FGF18可通过MAPK信号转导途径调节细胞的发育，FGF18的缺失就会严重影响成骨和软骨的形成。在同样具有矿化能力并且来源于外胚层的牙齿发育过程中，FGF18存在特异的时空分布特点，且随着成牙本质细胞的逐渐分化成熟，自身表达增强，提示FGF18参与成牙本质细胞的分化和牙本质的形成。但FGF18在成牙本质细胞形成和分化过程中起什么作用?通过哪种途径起作用?至今尚不很清楚。本课题对于这些问题进行了较深入的研究。具体内容如下：
包柳郁[6]2001年在《人牙髓细胞内Smad2、3在TGF-β1信号转导中作用的研究》文中进行了进一步梳理成牙本质细胞的诱导分化是牙髓损伤修复和牙胚发育的关键环节，也是牙髓生物学的一项重要研究内容。许多生长因子参与了成牙本质细胞分化的信号启动过程，其中TGF-β的作用尤为突出。TGF-β不仅可以诱导成牙本质细胞发生功能性分化，而且具有调控其合成和分泌牙本质基质的能力。但TGF-β在牙髓损伤修复和牙胚发育中作用的分子机制，即其在成牙本质细胞和牙髓细胞内的信号转导途径以及对基因表达的调控方式，目前尚不十分清楚。 1996年，有学者从人肾组织cDNA文库中克隆成功一种新基因，称为Smad2。研究证实，Smad2基因所编码的蛋白质可转导TGF-β信号。迄今为止，已克隆成功Smad1-9，形成Smads家族，其中Smad2和Smad3是TGF-β特异的细胞内信号转导分子，该分子在被TGF-βⅠ型受体磷酸化后可将TGF-β的信号向核内传递，调控目的基因的表达。已有研究证实，人牙髓细胞内存在Smad2基因的表达，但有关Smad2和Smad3在TGF-β调控牙髓损伤修复和牙胚发育过程中的作用，国内外尚未见报道。 本研究的目的是观察人牙髓细胞内Smad2和Smad3分子在TGF-β1信号转导中的作用，以及TGF-β1对二者表达水平的调控方式，并检测Smad2和Smad3在牙胚发育的不同时期和正常、龋坏、炎症牙髓组织中的表达及其变化，旨在从细胞内信号转导水平探讨TGF-β调节成牙本质细胞分化和牙本质形成的分子机理，为揭示牙胚发育和牙髓损伤修复过程中基因表达的调控机制提供一定的实验依据。本研究分为四个部分： 1．人牙髓细胞（HDPC）内Smad2和Smad3转导TGF-β1信号的激光共聚焦显微镜（LSCM）观察 取生长良好的第5代HDPC，用5ng/ml TGF-β1或200ng/mlBMP2刺激并培养15min、30min、1h、2h，设对照组（不予刺激）。将各组标本分别进行Smad2 第四军医大学硕士学位论文和Smad3兔疫荧光染色，在LSCM下观察并照相。结果：TGF－pl刺激组可见刺激Zh之内，SmadZ和Smad3在胞浆中的表达不断减弱，而在胞核内的表达逐渐增强，呈现由胞浆向胞核逐步转位的趋势，而BMPZ刺激组及对照组未见此现象。 2．TGF－PI作用下人牙髓细胞内 SmadZ和 Smad3蛋白表达水平的变化 取生长良好的第 5代Il3PC，分为实验组和对照组，实验组用 sghl TGF－el刺激并培养6、12、24、48h，对照组不予刺激。提取各组总蛋白质，分别用SmadZ或Smad3抗体进行Western印迹杂交。结果显示：与对照组相比，Smad3在 TGF卡 刺激后 6h及 12h，其蛋白表达量无明显变化，而在刺激后24h表达量明显下降，刺激48h后表达十分微弱；SmadZ在对照组及刺激后各时间点组，其蛋白表达量无显着变化。 3．SmadZ和Smad3在人牙髓组织中的分布与表达 制备正常、龋坏及炎症人牙髓组织标本，采用免疫组化方法检测SmadZ和Smad3在不同类型牙髓组织中的分布与表达。结果：SmadZ和Smad3在正常和龋坏牙髓的成牙本质细胞层呈强阳性表达，在下方的富细胞区为阳性表达，牙髓中心部细胞内为弱阳性表达，炎症牙髓浸润的炎细胞中SmadZ和Smad3呈强阳性表达。Smad3在各类牙髓中的表达模式与SmadZ基本一致，只是染色浅于SmadZ。 4．人牙胚发育过程中SmadZ和Smad3的表达及其变化 制备不同发育时期的人牙胚标本，运用免疫组化方法观察SmadZ和Smad3在各期牙胚的表达分布和表达变化。结果：SInadZ和Smad3在人牙胚发育的不同时期均有表达，但在各期的分布模式不尽相同，总的趋势是随着成釉细胞和成牙本质细胞的分化成熟，其表达逐渐增强。SmadZ和Smad3在不同发育时期牙胚中的分布与TGF－p有相似之处。各期牙胚中SmadZ和Smad3的表达部位基本相同，但SmadZ着色较Smad3强。 本研究运用LSCM观察到TGF－pl作用下SmadZ和Smad3在人牙髓细胞内的定位变化过程，结果表明，Smad和Smad3能特异地转导TGF－61信号 ·4· 第四军医大学硕士学位论文至核内而发挥作用，是TGF－PI信号转导机制中的关键分子，TGF－PI可能是通过SmadZ或Smad3信号转导途径实现对牙髓细胞分化的调节。同时，采用Western blot方法观察 TGF－pl作用下人牙髓细胞内 SmadZ和 Smad3蛋白表达水平的变化，结果提示，TGF－pl在刺激初期并不引起SmadZ和Smad3表达量的变化，可能主要通过使二者发生磷酸化而启动其胞内信号转导过程，末期TGF．pl又通过下调Smad3的表达水平，及时终止自身的信号转导，此时SmadZ的表达仍无变化。推测Smad3可能在TGF．p用MAD信号转导途径的负反馈调节中起重要作用。本文还采用免疫组化方法检测SmadZ和Smad3在不同发育时期的牙胚和正常、龋坏、炎症牙髓组织中的表达及其变化，结果提示SmadZ和Smad3可能在TGF－p调节牙胚发育和牙髓损伤修复的信号转导机制中起一定的作用。本研究为阐明TGF－e调控成牙本质细胞分化和牙本质形成的分子机制提供了可靠的实验依据，并为深人研究TGF p在牙?
逄键梁[7]2006年在《人牙本质基质蛋白1基因转录调控机制的研究》文中指出牙本质形成和矿化是牙齿发育和牙齿损伤修复过程中的重要组成部分。近年来，牙本质非胶原蛋白(Non-collagenous proteins，NCPs)在成牙本质细胞诱导分化和牙本质形成中作用的研究已成为牙齿发育生物学和牙髓生物学研究的热点。到目前为止，大多数的研究集中于牙本质特异性蛋白，而关于矿化组织特异性蛋白在牙胚发育中作用的研究较少。牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein 1，DMP1)是一种重要的矿化组织特异性蛋白，在成牙本质细胞诱导、分化和牙本质形成中的作用越来越受到关注。但是DMP1在牙本质形成和牙髓损伤修复中的功能和调控的分子机制报道甚少。成牙本质细胞是如何形成DMP1?在形成时受哪些因子调控?它们间存在什么样的相互作用?其作用机制又是如何?这些问题亟待解决。 DMP1是一种主要表达于牙本质和骨等矿化组织的基质蛋白，是一种新的富含丝氨酸的酸性磷酸化蛋白，组成中有1／3为门冬氨酸和谷氨酸，等电点为3.68。在不同的物种中，DMP1的基因结构相似，具有高度同源性，并有一些高度保守区。现有的研究表明：DMP1在体内发挥多重功能，既作为矿化调节蛋白，又作为一信号分子；过表达DMP1的细胞能够诱导分化和促进矿化结节的形成；能够结合钙离子和胶原组织，在矿化过程中发挥启动矿化的作用。DMP1基因敲除小鼠已经建立，并且表现出牙髓腔增大，前期牙本质带增宽，牙本质层变窄和矿化不全等症状。鉴于DMP1在牙本质矿化中的重要作用，研究其在牙本质形成中的具体作用机制，明确DMP1基因表达的调控方式，对深入了解牙胚发育和牙髓损伤修复机
张菁[8]2013年在《转录因子NFIC在人根尖牙乳头干细胞分化中的作用及其机制研究》文中研究说明干细胞在组织工程学中的运用将为牙髓/牙本质再生和生物性牙根的形成提供广阔的运用前景。根尖牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla，SCAPs）位于未发育完成的年轻恒牙的根尖部，是一种取自正在发育组织的成体间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。SCAPs具有多向分化的潜能，在特定培养液诱导下可形成类牙髓/牙本质，且被认为是牙根部成牙本质细胞的来源，最终形成牙根部牙本质。SCAPs与牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）相比，具有较强的成牙分化能力和较低的免疫原形，此特性被认为更适合运用于骨/牙体组织再生领域。核转录因子NFIC（nuclear factor I-C）在调控牙根的发育中发挥了重要作用。敲除NFIC的小鼠，形成短小的磨牙牙根，而牙冠发育正常。鉴于NFIC是特异性调控牙根发育的信号分子，而SCAPs是牙根成牙本质细胞的来源，那么，NFIC在调控SCAPs分化中的作用及其机制如何，目前尚不清楚。牙齿的发育是由一系列上皮和间充质相互作用而形成，众多的细胞因子参与了牙齿发育的调控。转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，包括TGF-βs，骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）和激活素类等相关蛋白，参与调节细胞增殖、分化及上皮间充质转换和胚胎发育等。研究发现NFIC通过抑制TGF-β1调控的基因表达，影响皮肤伤口的愈合；敲除NFIC后，小鼠异常的成牙本质细胞中TGF-βⅠ型受体和磷酸化的Smad2/3显着上调，提示，NFIC可能参与TGF-β信号通路，但是两者是在调控SCAPs分化中的作用机制尚不清楚。本课题首先成功分离、培养和鉴定人根尖牙乳头干细胞。随后分别转染所构建的慢病毒NFIC真核表达载体或沉默NFIC的siRNA。通过体内、外实验观察NFIC对SCAPs增殖、分化的影响。最后，研究TGF-β1对SCAPs生物学特性及分化的影响，讨论NFIC与TGF-β1信号通路在SCAPs分化中的相互作用。为将来SCAPs在牙髓牙本质再生和生物性牙根方面的应用提供新的思路。结果如下：1.人根尖牙乳头感干细胞的分离、培养及鉴定选取因正畸原因而拔除的年轻患者第叁磨牙，分离培养人原代SCAPs,有限稀释法纯化获得单克隆的细胞；免疫组织化学染色及流式细胞仪鉴定间充质干细胞标记物STRO-1等；成骨诱导、成脂诱导实验证实细胞的多向分化能力。2.转录因子NFIC促进SCAPs分化能力构建NFIC慢病毒真核表达载体plenti-NFIC后，与沉默NFIC的siRNA分别转染SCAPs。过表达NFIC还促进SCAPs的增殖能力、ALP活性和成骨/牙分化能力。此外，NFIC还不同程度地增强矿化基因标记物ALP、OCN和Col.I的mRNA；蛋白质印迹免疫检测技术也证实NFIC上调DSP蛋白水平。而沉默NFIC,则明显抑制SCAPs矿化能力及矿化基因ALP、OCN和Col.I的表达。此外，过表达NFIC增强脂滴的形成和成脂标记物CCAAT增强结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein）C/EBP-β、C/EBP-δ和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor-y，PPAR-γ）的表达。体内研究进一步证实：过表达NFIC的SCAPs细胞复合胶原/煅烧牛骨(calcinedbovine bone，CBB)材料植入免疫缺陷型小鼠的皮下12周后，可促进形成类成牙本质细胞和牙本质样结构。3.转录因子NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的调控不同浓度TGF-β1均抑制SCAPs增殖和体外矿化结节形成，并下调矿化基因的表达，而分别应用TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂SB431542和Smad3的抑制剂SIS3阻断TGF-β信号通路后，可部分逆转TGF-β1对SCAPs增殖和分化的抑制作用。TGF-β1抑制NFIC蛋白的表达，过表达NFIC减弱TGF-β1对SCAPs矿化能力的抑制作用，而沉默NFIC则增强了TGF-β1对SCAPs成牙/骨的分化能力。实验结果显示NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的生物学调控。综上所述，本研究通过体内/外实验证实NFIC可以促进根尖牙乳头干细胞的增殖和分化能力；而TGF-β1则起抑制作用；且NFIC参与了TGF-β1对根尖牙乳头干细胞分化特性的调控。本实验结果为阐述NFIC在调控SCAPs定向分化中的重要作用；同时为进一步研究SCAPs在牙髓牙本质再生和生物学牙根的组织工程研究提供了新的研究思路。
陆彦玲[9]2017年在《BMP2与DXM对人牙髓细胞增殖和分化的影响》文中指出牙髓细胞(hDPCs)具有自我复制更新和多向分化克隆的潜能,可在生物因子的作用下可以向成牙本质细胞分化。骨形态发生蛋-2(BMP-2)和地塞米松(DXM)是常见的成骨诱导因子,可以使牙髓细胞向成牙本质样细胞诱导分化。在成牙本质细胞形成过程中亦发挥着重要作用。本研究的目的为探讨BMP-2和DXM在诱导牙髓细胞增殖和牙向分化的作用以及两者联合运用是否能增强诱导效果,为牙髓细胞分化的实验提供生物因子优化组合的实验依据。目的:1、建立hDPCs培养模型,体外分离并培养hDPCs,鉴定细胞来源。2、探讨BMP-2和DXM以及两者联合作用矿化及诱导hDPCs体外增殖及向成牙本质细胞分化的影响。方法:1、hDPCs的体外分离、培养及鉴定:收集我院外科门诊15-30周岁患者无牙体牙髓牙周疾病的正畸牙或智齿,半小时之内迅速至无菌条件下劈开牙体取出髓腔中牙髓组织,并将其剪成1mm3小块,置于培养瓶中,加入含20%优质胎牛血清的高糖DMEM培养液,于恒温培养箱中培养,设置条件为37℃、5%CO2浓度。待细胞生长融合至25cm3培养瓶瓶底80%后,用无菌巴氏吸管加入0.25%胰酶,消化传代细胞。取生长状态良好的第3-5代细胞行波形蛋白和角蛋白免疫化学染色鉴定。冻存稳定传代的3-6代hDPCs待用。2、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs增殖的影响:用浓度为BMP-2(100ng/ml)、DXM(1×10-8mol/l)、BMP-2(100ng/ml)+DXM(1×10-8mol/l)诱导稳定传代的hDPCs,与对照组比较(仅含10%FBS的高糖DMEM培养液),在1day、3day、5day、7day消化细胞,制成细胞悬浊液,计数,绘制各组细胞生长曲线。3、BMP-2和DXM分别及联合作用对h DPC向成牙本质细胞分化的影响:诱导步骤同上,利用RT-PCR检测BMP-2和DXM分别及联合作用5day、7day后成牙本质标记基因DSPP、ALP、DMP-1的表达。作用14day后进行碱性磷酸酶染色检测ALP活性。作用21day,进行茜素红矿化结节染色,定量检测矿化结节分析成牙本质分化情况。结果:1、hDPCs的体外分离、培养及鉴定:(1)培养3-5天后,可见有梭型纤维状细胞爬出,7天左右细胞密集生长融合至瓶底的80%,可稳定传代,保持一定生长能力。(3)经波形蛋白、角蛋白免疫化学染色可见,细胞波形蛋白阳性表达,角蛋白阴性表达,说明培养的细胞来源于间叶组织中胚层,符合牙髓细胞的生物学特征。2、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs增殖的影响:随培养时间延长,各组细胞数均逐渐增加,5 d时达峰值,后逐渐下降,7 d降至3 d时水平。培养1d时,各组细胞数无明显差异(P>0.05);培养3 d时BMP-2组、BMP-2+DXM组细胞数显着高于DXM、对照组(P<0.05)BMP-2组、BMP-2+DXM组间无明显差异,DXM组、对照组间无明显差异(P>0.05);5 d时BMP-2、DXM、BMP-2+DXM组细胞数显着高于对照组,BMP-2+DXM组>BMP-2组>DXM组>对照组(P<0.05);7d时细胞数下降,BMP-2+DXM组>BMP-2组>对照组>DXM组(P<0.05)。3、BMP-2和DXM分别及联合作用对hDPCs分化的影响:经诱导后各处组的成牙本质形成标记基因DSPP、DMP-1、ALP均有表达,碱性磷酸酶染色染色阳性,矿化结节茜素红染色阳性,说明牙髓细胞可以在BMP-2、DXM的诱导下分化为成牙本质细胞,RT-PCR检测示,经诱导5d,BMP-2、DXM、BMP-2+DXM组细胞的ALP、DSPP、DMP-1表达较对照组均上调,其中BMP-2+DXM组表达最高。BMP-2组与DXM组无统计学差异(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对两组有差异(P<0.05);DXM组与BMP-2组无统计学差异(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对两组有差异(P<0.05);BMP-2+DXM组、对照组与其他组间均存在差异(P<0.05);提示经BMP-2和DXM诱导后各组hDPCs的分化标志基因强烈表达。经诱导7d各处理组基因表达量趋于同化平稳。DSPP基因表达量BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组大于对照组(P<0.05),但BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组的组间比较无明显差异(P>0.05);同时,ALP、DMP-1基因表达量四个组间无明显差异(P>0.05)。培养14 d,经碱性磷酸酶染色检测,BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组可见不同着色程度的紫黑色沉淀,其中BMP-2+DXM组着色程度最深,表现为强阳性;经半定量测定阳性染色率:BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组依次为0.368±0.004,0.337±0.022,0.849±0.013,0.181±0.008,BMP-2+DXM组>BMP-2组≈DXM组>D组,BMP-2+DXM组、对照组与其他各组均有差异,差异有统计学意义(P<0.05),BMP-2组、DXM组差异无统计学意义(P>0.05),与BMP-2+DXM组、对照组均有差异,差异有统计学意义(P<0.05)。培养21d,茜素红染色示,BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组均出现大小及着色程度不一的橘红色矿化结节,其中BMP-2+DXM组矿化结节呈片状大面积分布,BMP-2组、DXM组呈散在分布;对照组无矿化结节形成。BMP-2组、DXM组、BMP-2+DXM组、对照组A值比较为BMP-2+DXM组>BMP-2组>DXM组>对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、利用组织块培养法分离培养hDPCs,可以成功获得稳定传代的牙髓细胞系,为后续各部分实验提供了基础。2、探究并比较了BMP2和DXM两者联合和单独作用对牙髓细胞增殖和分化的影响,丰富了对牙髓细胞分化机制作用的认识,为研究促进牙髓细胞增殖作用和分化作用的细胞因子组合及作用时间提供了依据。
姚乃晖[10]2011年在《釉原蛋白对MDPC-23细胞分化影响的实验研究》文中指出成牙本质细胞分化是牙髓组织自身损伤修复过程中的关键环节,也是牙胚发育的重要阶段,这一过程受多种因子的调控,寻找诱导成牙本质细胞分化的因子并阐明其诱导机制,一直是牙髓生物学的研究热点,也是认识牙髓损伤修复过程、形成治疗新靶点的关键。目前已发现多种细胞外基质分子及其受体、生长因子及受体、同源异形盒基因、原癌基因及转录因子、维甲酸及其受体、细胞粘附分子等参与成牙本质细胞的分化,其中,生长因子及其受体参与细胞调控、分化的研究始终是生命科学研究的热点。釉原蛋白(Amelogenin,AMG)是成釉细胞分泌的一组同源性的低分子量(20～30KD)的疏水蛋白,富含脯氨酸、谷氨酰胺和组胺酸,是釉基质蛋白的主要成分,约占90%,它在牙齿发育的各个阶段均有表达,以往对于釉原蛋白的研究主要集中于其在牙胚发育中的表达、对釉质发育形成的作用及其在牙周组织再生中的作用。2005年Tompkins等报道纯化的大鼠釉原蛋白可促进体外培养的小鼠牙胚中的成牙本质细胞的成熟,这提示釉原蛋白可能能够促进成牙本质细胞的分化成熟。本研究旨在观察小鼠釉原蛋白对体外培养的小鼠成牙本质细胞系MDPC-23分化的影响及其机制,研究釉原蛋白在成牙本质细胞分化过程中,对细胞存活,增殖和分化的影响,进一步研究其对MAPKs各通路蛋白磷酸化的影响,并应用MAPKs抑制剂和釉原蛋白联合作用,特异性阻断各MAPKs通路,观察釉原蛋白诱导成牙本质细胞分化的影响。为研究牙齿损伤修复过程中釉原蛋白参与成牙本质细胞分化过程的分子机制提供理论依据。研究内容和结果如下:1.首先我们从MDPC-23细胞克隆到了小鼠的釉原蛋白基因,全长591bp,Genbank登录号为NM 009666,同时设计了干涉釉原蛋白的序列,在此基础上,构建了能高效过表达釉原蛋白和干涉釉原蛋白的重组腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及对照腺病毒Ad-EGFP载体,进行病毒扩增和滴度测定,并感染MDPC-23细胞检测其表达及干涉效果,结果表明:构建的腺病毒载体能够正确地表达釉原蛋白或干涉其表达。2.腺病毒感染MDPC-23细胞后光镜观察表明,过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞形成较长的突起,胞体相对缩小,表明细胞分裂活动变得旺盛,干涉釉原蛋白对MDPC-23细胞形态没有明显影响,通过MTT实验和流式细胞术检测发现过表达釉原蛋白抑制了MDPC-23细胞的生长速度,而干涉釉原蛋白则促进了MDPC-23细胞的增殖,流式细胞术结果表明过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期细胞比例升高,S期比例下降,而干涉釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期比例降低,S期升高。碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ,ALP)是成牙本质细胞分化的一个重要指标,因此,检测ALP活性的变化可以反应细胞的分化状态,通过ALP活性和矿化结节形成检测发现,过表达釉原蛋白后,MDPC-23细胞的ALP活性显着增高,矿化能力增强。RT-PCR结果表明,过表达釉原蛋白后,成牙本质细胞分化标志物DMP-1和DSPP的表达升高。相反,干涉釉原蛋白导致MDPC-23细胞的ALP活性降低,矿化能力减弱,DMP-1和DSPP的表达下降,Western结果表明,釉原蛋白促进MDPC-23细胞分化主要是通过ERK1/2 and p38通路起作用的。3.为研究釉原蛋白诱导MDPC-23细胞分化的分子机制,我们采用了基因表达谱芯片筛选MDPC-23细胞分化的差异基因,如果实验组较对照组荧光染料的cy5/cy3比值在2.0以上,就判断为上调基因;如果实验组较对照组荧光染料的cy5/cy3比值在0.5以下,就判断为下调基因,依此标准共获得上调与下调的基因数目分别为1140和487。其中,有些变化的基因如骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP-7)、神经细胞粘附分子(Neural cell adhesion molecules, NCAMs)、细胞周期依赖蛋白激酶2(cyclin-dependent kinase 2, Cdk2)等都可能与釉原蛋白诱导的MDPC-23细胞分化相关,下一步拟用定量PCR的方法验证差异基因的变化情况,并进行相应的功能学实验,综上所述,我们的结果提示釉原蛋白在体外能够促进成牙本质细胞系MDPC-23的分化成熟,其机制有待于进一步研究。研究结论:1.克隆到了小鼠的釉原蛋白基因,全长591bp,构建了能高效过表达釉原蛋白和干涉釉原蛋白的重组腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及对照腺病毒Ad-EGFP载体,构建的腺病毒载体能够正确地表达釉原蛋白或干涉其表达。2.过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞形成较长的突起,胞体相对缩小,表明细胞分裂活动变得旺盛,干涉釉原蛋白对MDPC-23细胞形态没有明显影响。过表达釉原蛋白抑制了MDPC-23细胞的生长速度,而干涉釉原蛋白则促进了MDPC-23细胞的增殖。过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期细胞比例升高,S期比例下降,而干涉釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期比例降低,S期升高。过表达釉原蛋白后,MDPC-23细胞的ALP活性显着增高,矿化能力增强,成牙本质细胞分化标志物DMP-1和DSPP的表达升高,干涉釉原蛋白后结果相反,釉原蛋白可使ERK1/2和p38的磷酸化增强,对JNK的磷酸化没有影响,采用通路抑制剂U0126和SB203580可显着抑制ERK1/2和p38的磷酸化,同时可阻断釉原蛋白诱导的MDPC-23细胞分化。3.采用基因表达谱芯片筛选MDPC-23细胞分化的差异基因,共获得上调与下调的基因数目分别为1140和487,其中,有些变化的基因如BMP-7、NCAMs、Cdk2等都可能与釉原蛋白诱导的MDPC-23细胞分化相关,下一步拟用定量PCR的方法验证差异基因的变化情况,并进行相应的功能学实验。
参考文献：
[1]. Smads信号分子在成牙本质细胞分化中作用的研究[D]. 何文喜. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. Smad3对牙本质涎磷蛋白基因表达调控的研究[D]. 高杰. 第四军医大学. 2005
[3]. 人牙乳头细胞内Smad5、6在BMP2信号转导中作用的研究[D]. 臧晓霞. 第四军医大学. 2001
[4]. 核转录因子激活蛋白-1在牙胚发育中作用的实验研究[D]. 朱明慧. 第四军医大学. 2004
[5]. 成纤维细胞生长因子18对成牙本质细胞分化的作用及信号传导通路的研究[D]. 姜永. 第四军医大学. 2006
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[7]. 人牙本质基质蛋白1基因转录调控机制的研究[D]. 逄键梁. 第四军医大学. 2006
[8]. 转录因子NFIC在人根尖牙乳头干细胞分化中的作用及其机制研究[D]. 张菁. 第四军医大学. 2013
[9]. BMP2与DXM对人牙髓细胞增殖和分化的影响[D]. 陆彦玲. 广西医科大学. 2017
[10]. 釉原蛋白对MDPC-23细胞分化影响的实验研究[D]. 姚乃晖. 第叁军医大学. 2011