人钙联蛋白S100A8原核表达载体的构建及表达论文_潘晓彦赵伟李琳刘叔文谭穗懿

潘晓彦赵伟李琳刘叔文谭穗懿通讯作者

（南方医科大学药学院广东广州510515）

基金项目：国家自然科学青年基金（项目编号：81102482）【摘要】目的：构建人钙联蛋白S100A8的原核表达载体并进行蛋白表达及纯化，以便进一步研究。方法：从人单核巨噬细胞THP-1中提取总RNA，逆转录后进行PCR，得到目的基因，与TA克隆载体pMD-T进行连接，得到pMD-S100A8质粒，经BamHⅠ和XhoI双酶切产物或者PCR产物双酶切后，与大肠杆菌pGEX-6P-1表达载体进行连接，得到pGEX-S100A8重组质粒。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)表达菌进行蛋白表达。融合GST蛋白用GST柱纯化，冷冻干燥，进行下一步研究。结果：成功构建了TA克隆质粒pMD-S100A8及阳性pGEX- S100A8重组质粒，成功诱导蛋白的原核表达。结论：纯化得到的蛋白为进一步研究S100A8钙联蛋白的结构和功能提供了参考。

【关键词】钙联蛋白；S100A8；质粒构建；表达；纯化

【中图分类号】R453【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)10-0307-02

近年来，对S100A8/A9的研究主要着重于二者及其低聚物在炎症及肿瘤中的应用和作用机制［1］。在炎症方面，主要针对其在炎症中所起的作用，其对炎症的影响机制机理以及与花生四烯酸和嘌呤之间的相互作用［2,3］。本文拟构建原核表达重组质粒pGEX-S100A8，诱导蛋白原核表达并进行纯化，以得到大量纯化蛋白，以对其结构及功能进行更深入的研究。

1资料与方法

11一般资料

111细胞，菌株及质粒：人单核巨噬细胞THP-1由南方医科大学药学院吴曙光教授提供；菌株DH5α由本实验室保存,菌株BL21(DE3)购自上海EXcell Biology公司；载体pGEX-6P-1由复旦大学上海医学院陆路副教授惠赠，载体pMD-T购自TAKARA公司。

112主要试剂：RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，普通PCR试剂盒,BamHI和XhoI内切酶以及T4连接酶均购自TAKARA公司；DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司；Bugbuster mix裂解液，his-tag羊抗鼠单抗以及羊抗兔二抗购自Merck公司，S100A8兔抗人单抗购自Santa Cruz公司。

12方法

121S100A8 DNA片段的来源从GenBank查找得到S100A8基因序列(CR4076741)，进行引物设计：Sense:5’-(BamH I) GGATCCATGTTGACCGAGCTGGAG-3’，Anti sense:3’-(XhoI) CTCGAGCTACTCTTTGTGGCTTTCT-5’。PCR产物09%的琼脂糖凝胶电泳，以β-actin做对照，用DNA回收试剂盒回收目的DNA 片段。

122质粒构建:将回收的DAN片段TA克隆至pMD-T载体，转化入大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有X-gal的氨苄抗性LB平板，用蓝白斑进行筛选。连接产物琼脂糖凝胶电泳回收得到pGEX- S100A8质粒。

123诱导表达:将构建好的质粒pGEX-S100A8转化入大肠杆菌DH5α，涂布于氨苄抗性LB平板得到再次筛选，挑取单克隆小量提取质粒，测序正确后进行保种。第2d以1:100接种于100ml含有氨苄的LB培养基，37℃,220rpm，摇3～4h，测得OD600在06~08之间时，开始加入IPTG达到终浓度为05mM，28℃，220rpm，诱导12h。

124蛋白纯化:诱导表达后，取预先称重的50ml离心管收集菌体，5000g离心30min，求得菌体重量，加入Bugbuster mix裂解液，按Bugbuster mix说明书步骤裂解菌体，离心后取上清。用045μm的滤膜过滤后，过滤液上GST柱，用尿素洗脱，洗脱后的缓冲液中即为带有GST标签的目的蛋白S100A8。

2结果

21S100A8 PCR基因扩增产物的鉴定 S100A8蛋白基因大小为279bp,11KD左右。提取的RNA做逆转录PCR，基因产物跑09%的琼脂糖凝胶电泳，以β-actin作为对照，成功扩增出S100A8蛋白基因（见图1）。

(图1)1DNA Marker；2β-actin PCR产物阳性对照；3～5S100A8 DNA PCR产物。

(图2)1Wide Range DNA Marker (500-15,000)；2~3Pgex-6p-1空载体对照；4~6Pgex-6p-1与 S100A8链接产物。

22pGEX-6p-1-S100A8载体的构建 PCR回收的S100A8 DNA片段，以及载体pGEX-6p-1经BamHI和XhoI双酶切，回收后，做链接，以空载体作对照，进行琼脂糖凝胶电泳，去除杂片段，鉴定链接成功（见图2）。

23重组质粒测序blast比对结果 以重组质粒转化后小提质粒pGEX - S100A8质粒及菌液送测序后，测得结果加上5’及3’酶切位点后与NCBI结果做比对，可百分之百配对，结果显示构建的重组质粒正确。

24原核表达融合蛋白S100A8定位 重组质粒转化入BL21(DE3)原核表达菌进行表达后，收集培养基上清，菌体裂解后上清，以及裂解后沉淀，进行SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。表达的蛋白主要存在于菌体裂解后的上清中。

1蛋白Marker；2,5,8,11分别为S100A8诱导6h，12h，18h和24h培养基上清；3,6,9,12。分别为S100A8诱导6h，12h，18h和24h裂解离心后上清；4,7,10,13分别为S100A9诱导12h和24h裂解离心后下沉淀

25目的蛋白鉴定以及诱导条件摸索：诱导剂浓度为05mM，温度为28℃，诱导时间分为12h和24h。以未诱导的摇相同时间的菌液样品作为对照。菌液离心，用Bugbuster mix裂解后，取上清进行western blot，可知在诱导12h后，上清中蛋白为带标签的目的蛋白S100A8，见图4。

(图4)1,3分别为诱导12h和24h小时的菌体裂解后上清；2,4未诱导的分别摇12h和24h菌体裂解后上清(图5)1蛋白Marker；2上清总蛋白；3洗脱液；4洗涤液；5流穿液。

26蛋白纯化及检测：以最佳条件，即诱导剂浓度为05mM，温度为28℃，诱导时间为12h，大量诱导蛋白表达后，收集菌体裂解上清，上GST柱纯化蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染色，鉴定在洗脱液中得到较纯的目的蛋白，见图5。

3讨论

S100家族21个成员中的16个蛋白基因定位于染色体1q21，而这一区极不稳定，与细胞的生长和分化呈强烈相关，因此S100A8和S100A9与肿瘤有着密不可分的联系，在一些肿瘤细胞中及周围的侵润细胞中呈现不同程度的高表达，报道的肿瘤主要如下：鼻咽癌，喉鳞癌，肺癌，乳腺癌，宫颈癌，卵巢癌，前列腺癌，胃癌以及大肠癌等等。在疾病发生前期或发生后，二者形成的异质二聚体以钙离子依赖方式从细胞质中转移到细胞骨架上，或者释放到细胞外，阻止细菌的侵入，或者最终形成淀粉样导致疾病的发生。本文构建原核表达载体，体外成功原核表达S100A8蛋白，为进一步研究这个蛋白的生物学功能打下坚实的基础。

论文作者:潘晓彦赵伟李琳刘叔文谭穗懿

论文发表刊物:《河南中医》2013年10月第2期供稿

论文发表时间:2014-3-19

标签：质粒论文;  蛋白论文;  诱导论文;  载体论文;  目的论文;  上清论文;  产物论文;  《河南中医》2013年10月第2期供稿论文;