代广辉[1]2004年在《兔骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及移植修复脊髓损伤实验研究》文中研究表明脊髓损伤是一种严重的伤病，其致残率与致死率非常高。对于脊髓损伤的传统治疗方法有脊柱骨折脱位的复位固定、解除脊髓压迫、对症及康复治疗。近年来，随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深入，神经组织细胞移植逐渐应用于脊髓损伤的治疗并取得了肯定的效果。神经干细胞(Neural stem cellS，NSCs)特别是骨髓基质细胞源性神经干细胞分化调控和移植修复中枢神经系统功能损害亦成为研究重点。 骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)是骨髓细胞中除去造血干细胞之外的细胞部分，目前已证实骨髓基质细胞在特定的培养条件下可分化成多种细胞，如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞和神经元及神经胶质细胞等，具有克隆样增殖特性。其多潜能性的发现和向神经细胞方向定向分化的成功，为神经干细胞的来源增加了一个新的途径，也为解决“自体源神经干细胞”移植方案中细胞数量不足的问题提供了很好的思路。 本研究通过建立体外、体内实验模型等手段，对骨髓基质细胞源性神经干细胞的体外扩增、定向分化、移植及其所移植细胞在损伤脊髓内的存活情况等进行研究，以进一步了解骨髓基质细胞源性神经干细胞的生物学特性，并探讨其在神经系统疾病中的应用的可行性和有效性。 第一部分：兔骨髓基质细胞体外培养分化为神经干细胞的实验研究 一、目的： (一)、观察兔骨髓基质细胞在体外培养及诱导分化获得神经干细胞的可行性； (二)、探讨并确立骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的适当培养方法及条件，建立一个获得“骨髓源神经干细胞”的成熟技术平台，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。二、方法: (一)、以新西兰大白兔为实验对象，无菌穿刺实验动物骨髓腔抽取骨髓，梯度密度离心获得有核细胞，粘附法提取骨髓基质细胞。 (二)、提取的骨髓基质细胞悬液加入神经干细胞培养液，调整细胞浓度到1护个加1后，接种于多孔培养板中，加胎牛血清(1%终浓度)及LIF(10ng/ml)+bFGF(10ng/ml)，在37oC、5%C02、饱和湿度条件下培养，48小时后换液以去除非粘附细胞，以后每周换液2次。培养l~2周后得到较纯化的BMSCSS，可进行细胞传代培养，在培养过程中加入胎牛血清以及RA(终浓度0.5 pg/m1)以诱导BMSCS向神经干细胞分化。 (叁)、观察培养细胞:CKZ型倒置相差光学显微镜(0LY’MPAS，JAPAN)追踪观察细胞生长情况并拍照;采用SABC法进行免疫细胞化学检测(一抗分别为鼠抗一Nestin、鼠抗一NSE、鼠抗一GPAP，二抗试剂盒为生物素化羊抗小鼠IgG/羊抗兔工gG，链霉亲和素一生物素一过氧化酶复合物)，不同阶段培养细胞经4%多聚甲醛固定，0.01mol/L PBS冲洗，一抗37℃60min;生物素化二抗室温孵育10 min;链霉亲和素一生物素一过氧化酶复合物室温孵育10 min;DAB显色染色5~15min，着棕色的细胞为阳性，OLYMPAS光学显微镜观察拍照。叁、结果: (一)、贴壁细胞培养48h后有分裂增殖，然后逐渐形成岛屿状细胞克隆团，给予适当的分化条件10一20d后，这些细胞能分化成具有细长突起、多种形态的细胞。 (二)、经免疫细胞化学鉴定，早期的培养细胞在没有给予诱导分化时可阳性表达Nestin，表明具有干细胞特性;培养细胞经诱导分化后有NSE阳性表达的细胞出现。四、结论: (一)、新西兰大白兔骨髓的BMSCS在合适的体外培养条件下能够转化为神经干细胞，保持增殖分化能力; (二)、本实验室采用的培养方案(神经干细胞培养基)适合于大白兔骨髓基质细胞向神经干细胞转化; (叁)、源自BMSCSs的神经干细胞能分化出具有神经系细胞特征的 一3-细胞; 第二部分:兔骨髓源神经干细胞自体移植修复脊髓损伤的实验研究一、目的: (一)、建立脊髓损伤动物模型后，将源自自体的“骨髓基质细胞源性神经干细胞”经标记后移植到模型动物脊髓损伤部位，观察其增殖、生长和迁移等情况; (二)通过采用伤后不同时间移植“骨髓基质细胞源神经干细胞”的方法，观察骨髓源神经干细胞于创伤不同时期在创伤灶的生长、存活情况，探讨神经干细胞移植修复脊髓损伤的最佳时机。二、实验分组: 随机将动物分为九组:【移植治疗组11脊髓全横断损伤十神经千细胞及胶原基质蛋白移植组，于脊髓损伤立即移植。(10只);【移植治疗组2】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组，于脊髓损伤IW移植。(10只);【移植治疗组3】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组，于脊髓损伤ZW移植。(10只);【移植治疗组4】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组，于脊髓损伤3W移植。(10只);【移植治疗组5】脊髓全横断损伤十神经干细胞及胶原基质蛋白移植组，于脊髓损伤4W移植。(10只);【移植对照组1]脊髓全横断损伤+神经干细胞移植组，于脊髓损伤2w移植。(10只);【移植对照组2】脊髓全横断损伤+胶原基质蛋白移植组，于脊髓损伤2w移植。(10只);【手术对照组】脊髓全
袁军[2]2006年在《骨髓源神经干细胞移植联合GDNF治疗脊髓损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理脊髓损伤是一种严重的伤病，其致残率与致死率非常高。对于脊髓损伤的传统治疗方法有脊柱骨折脱位的复位固定、解除脊髓压迫、对症及康复治疗。近年来，随着神经病理生理及神经发育学研究的不断深入，神经组织细胞移植逐渐应用于脊髓损伤的治疗并取得了肯定的效果。神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)特别是骨髓基质细胞源性神经干细胞分化调控和移植修复中枢神经系统功能损害亦成为研究重点。 骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)是骨髓细胞中除去造血干细胞之外的细胞部分，目前已证实骨髓基质细胞在特定的培养条件下可分化成多种细胞，如间充质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞和神经元及神经胶质细胞等，具有克隆样增殖特性。其多潜能性的发现和向神经细胞方向定向分化的成功，为神经干细胞的来源增加了一个新的途径，也为解决“自体源神经干细胞”移植方案中细胞数量不足的问题提供了新的思路。 胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是一种新型的神经营养因子，属于TGF-p超家族成员，于1993年由Lin等首先从大鼠B49细胞系的上清中分离纯化得到。GDNF是目前为止发现的在体外支持运动神经元生长最有效的神经营养因子之一，不仅能挽救发育过程中运动神经元的程序性死亡，还可以促进脊髓损伤后皮质神经元的存活。近年来发现，GDNF除了对中脑多巴胺能神经元具有营养保护作用外，还对感觉神经元和运动
李贵涛[3]2006年在《骨髓基质细胞源性神经干细胞坐骨神经和脊髓移植实验》文中研究表明研究背景：中枢神经和周围神经系统的形成，是胚胎发育过程中最复杂的过程。早在1908年，Tello等就发现中枢神经系统可以再生，但由于当时的证据不够充分而没有得到学术界的公认，以致于很快被遗忘。传统观点认为，成年哺乳类动物中枢神经系统是非再生性组织，分化成熟的神经细胞无法再分裂，神经元细胞损伤后不能再增殖替代死亡的细胞。神经轴突再生的能力在中枢神经系统特别是脊髓中非常差，其基本原因是脊髓轴突的再生反应性弱，中枢神经系统的微环境抑制轴突再生和胶质瘢痕的存在限制了轴突有效地再生。尽管人们已尝试用雪旺细胞、嗅束、外周神经及胚胎神经组织移植修复脊髓和周围神经损伤，并取得了一定的进展。但因细胞来源困难、无法产生新的有功能的神经元，因此，这些方法难以在临床上推广应用。神经干细胞的发现对传统观念提出了挑战，同时也为脊髓损伤的移植治疗带来了新的希望，因为脊髓损伤后，神经元死亡传导束断离，支配区完全瘫痪，现有的常规治疗技术无法使其康复，神经干细胞的移植治疗为众多瘫痪病人带来了新的希望。 目前有关神经元和神经胶质细胞的起源大多数神经生物学家接受的是“一元论”的发生机制，即神经元和神经胶质细胞来源于共同的干细胞。这种干细胞由胚胎早期室管膜上皮细胞产生并具有多向分化的潜能，故被称为多潜能神经干细胞(multipotential neural stem cell)。该种细胞通常具有下列特征：一是可自我复制和更新，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备；二是处于
刘德虎[4]2016年在《兔骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及移植修复脊髓损伤实验研究》文中认为目的:探究骨髓基质源性神经干细胞对于修复脊髓损伤的可行性和可靠性。方法:采用新西兰白兔作为研究对象,提取骨髓基质细胞加以培养分化,手术方式将骨髓基质细胞源性神经干细胞悬浊液移植到脊髓损伤部位,观察损伤区域再生情况。结果:早期培养细胞在无诱导分化时能表达巢蛋白,表明其有干细胞活性;干细胞移植后脊髓损伤部位增殖细胞排列无层次,且Brd U染色呈阳性。结论:兔骨髓基质细胞在合适的体外培养条件下能分化成干细胞,具有增殖分化能力,可以应用于修复脊髓损伤等神经学科领域。
陈剑荣[5]2004年在《新西兰大白兔骨髓基质细胞的诱导分化及其生物活性物质分析的实验研究》文中提出第一部分：骨髓源基质细胞体外诱导分化成神经元样细胞的实验研究 目的 研究兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化为神经元样细胞的可行性。 材料及方法 1．以新西兰大白兔为实验对象，无菌条件下抽取兔骨髓，梯度密度离心获取骨髓基质细胞。 2．在体外应用神经干细胞培养基和细胞因子进行BMSCs向神经干细胞、神经元样细胞的诱导分化。细胞培养中分别加入RA、GDNF、BDNF等细胞生长因子。 3．CK2型倒置相差光学显微镜(OLYMPAS，JAPAN)追踪观察细胞生长情况并拍照；采用SABC法进行免疫细胞化学鉴定。 结果 1．兔BMSCs能在体外培养中增殖分化为神经干细胞、神经元样细胞。培养48小时后细胞有分裂现象，7d后可见细胞克隆团。12d后大而圆细胞有出芽，16～21d细胞进一步分化出长突起，大多数长突起细胞呈现出典型神经元样细胞，并交织成网。 2．经免疫细胞化学鉴定，培养7～14d的神经干细胞可特异性表达神经巢蛋白(Nestin)；经培养20d的神经元样细胞分别见成熟神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经核蛋白(NeuN)的表达。 结论 兔BMSCs是具有较强的自我更新能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，可分化为神经干细胞并进一步分化为神经元样细胞，表达神经系细胞抗原。RA和GDNF在BMSCs向神经元样细胞分化的过程中起着积极作用。特异性BMSCs可作为神经细胞的种子细胞。
王焕明[6]2007年在《大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及自体移植治疗颞叶癫痫实验研究》文中认为神经干细胞是指具有分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞。它主要存在于胚胎和成年中枢神经系统脑室周围的广泛区域，但最近的研究显示骨髓基质细胞在一定条件下能诱导分化成神经干细胞，从而为神经干细胞的应用提供了无限制的来源。骨髓基质细胞源性神经干细胞的开发和应用，既克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性，也避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题，其在治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病领域将会有广阔的应用前景。癫痫为神经系统常见病之一，其患病率占人群的5‰左右，国内统计约占全部居民的7‰。癫痫为一非特异性慢性脑疾病，它是由先天的或后天的不同原因导致的慢性脑功能失调所引起的一种临床症候群，其特征是由于大脑某些神经元突然过度高频放电所引起的具有各种临床(或实验室)表现的反复发作。颞叶癫痫为局灶性癫痫的主要类型之一，常有较特殊的嗅觉异常，意识障碍和醉梦状表现。其常见的病理学改变是海马硬化，即海马结构的一些区域神经元丢失和胶质增生。尽管前颞叶切除或选择性海马杏仁核切除可使部分颞叶癫痫病人得以痊愈，但手术本身有一定的危险性，可能会引起偏瘫、偏盲、记忆损害等，且对双侧颞叶的致痫灶不宜作双侧切除。因此，通过神经干细胞移植进行海马功能的修复重建实验研究，可以从一个新的角度来探索治疗、改善颞叶癫痫发作频率和程度的途径，具有潜在的临床意义。第一部分大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经干细胞实验研究一、目的探讨大鼠骨髓基质细胞在体外培养并诱导分化为神经干细胞的可行性，并确立骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞的适当培养方法及条件，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。二、材料与方法以SD大鼠为实验对象，无菌穿刺大鼠股骨骨髓腔抽取骨髓，梯度密度离心获得有核细胞，粘附法提取骨髓基质细胞。向提取的骨髓基质细胞悬液加入神经干细胞培养液，调整细胞浓度到10~6个／ml后，接种于多孔培养板中，再分别加胎牛血清(1％终浓度)、LIF(10ng／ml)及bFGF(10ng／ml)。在37℃、5％CO_2、饱和湿度条件下培养骨髓基质细胞，48h后换液以去除非黏附细胞，以后每周换液2次。原代培养一周后进行细胞传代培养，传代培养的细胞加入胎牛血清以及RA(0.5ug／ml)，以诱导骨髓基质细胞向神经干细胞分化。然后在CK2型倒置光学显微镜下追踪观察培养的活细胞生长情况并拍照。采用SABC法进行免疫细胞化学检测，将不同阶段培养细胞经4％多聚甲醛固定，0.01MPBS冲洗，一抗37℃，孵育60min，生物素化二抗室温孵育10min，最后在链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物室温孵育10min，经DAB显色5～15 min，并在OLYMPUS光学显微镜下观察拍照。叁、结果贴壁细胞培养48h后有分裂增殖，然后逐渐形成岛屿状细胞克隆团，给予适当的分化条件10～20d后，这些细胞能分化成具有细长突起、多种形态的细胞。经免疫细胞化学鉴定发现早期的培养细胞在没有给予诱导分化时可阳性表达Nestin，表明其具有神经干细胞的特性；培养细胞经诱导后有NeuN、NSE和GFAP阳性表达的细胞出现，且随着诱导时间的延长阳性表达的细胞逐渐增强，提示有分化为神经元样或神经胶质细胞样细胞的趋向。四、结论SD大鼠骨髓基质细胞在合适的体外培养条件下能够转化为神经干细胞，并保持增殖分化的能力。骨髓基质细胞源性神经干细胞能分化成具有神经系细胞特征的细胞，且能阳性表达NeuN、NSE和GFAP。第二部分大鼠骨髓源性神经干细胞自体移植治疗颞叶癫痫实验研究一、目的探讨骨髓源性神经干细胞自体移植至KA大鼠海马后与宿主细胞的整合及其对损伤宿主的修复作用，从而为神经干细胞移植治疗颞叶癫痫提供理论依据。二、材料与方法首先分离大鼠骨髓基质细胞，并在特定的条件下培养使其诱导分化为神经干细胞，使用Feridex对干细胞进行标记。将60只雄性SD大鼠随机分为叁组：对照组、移植组及未移植组，每组20只。然后建立大鼠颞叶癫痫模型，将Feridex标记的神经干细胞自体移植到癫痫模型鼠的右侧海马CA3区，对KA未移植和对照组大鼠在相同的靶点注入等量的生理盐水。观察移植后1周、2周、4周、8周和16周大鼠海马的脑电图、MRI和病理学改变情况。叁、结果KA注射大鼠均出现典型癫痫发作症状，且经过一段静止时间后大鼠均再次出现反复的自发性癫痫发作，发作类似杏仁核点燃；与KA未移植组相比，移植组大鼠海马脑电图的波幅明显降低，至移植8周后最高降低达40％以上；MRI检查发现在神经干细胞移植后1周和2周时低信号改变区比较局限，但移植4周、8周和16周后低信号改变明显增大，且随着时间的推移低信号改变区逐渐增大；病理学检查显示，KA移植组的CA3区锥体细胞数与未移植组和对照组相比较有统计学差异(P＜0.01)；在移植组内，各时间段之间相比也有统计学差异(P＜0.01)，至移植后8周时细胞数最大，此后又开始下降；在KA未移植组，随着时间的推移，CA3区锥体细胞计数则呈现明显下降趋势；KA移植组海马损伤侧的Timm染色与未移植组和对照组相比有统计学差异(P＜0.01)；在移植组内，各时间段相比也有统计学差异(P＜0.01)，至移植后第8周时Timm染色记分最小，但此后又开始增加；电镜超微结构检查显示移植组海马CA_3区锥体神经元核仁明显，胞质内可见较多的脂褐素，线粒体肿胀，突触小泡数量较少。而未移植组海马CA_3区锥体神经元游离核蛋白体减少，突触膜融合，突触小泡明显增多。四、结论骨髓源性神经干细胞自体移植至KA大鼠海马后对癫痫鼠的癫痫发作有一定的抑制作用，且能与宿主细胞进行整合，并对宿主海马具有显着的修复作用，但其具体的作用机理尚待进一步研究。
代广辉, 徐如祥, 王峰, 姜晓丹, 杜谋选[7]2004年在《自体神经干细胞在兔损伤脊髓内存活并分化的实验效果》文中研究表明目的:将新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养、诱导、分化为神经干细胞,并且移植到兔脊髓横断性损伤模型中,观察移植的细胞是否能够存活及分化。方法:兔骨髓基质细胞取自成年兔的股骨或髂骨,体外培养、诱导、分化为神经干细胞,将兔制成脊髓全横断模型。伤后2周将神经干细胞手术方法直视下移植到受损脊髓缺损处,伤后12周将兔行甲醛灌注留取神经干细胞移植处作为标本,行病理及免疫组化染色。并设立脊髓损伤空白对照组(移植后不行神经干细胞移植)。结果:移植组与对照组相比,移植组移植部位存在大量5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxyuridine/5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)染色阳性的细胞,表明移植的细胞在体内可以存活;同时,移植组脊髓损伤部位存在神经元特异性烯醇化酶抗体(neuron-specificendase,NSE)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)染色阳性的细胞,表明移植的细胞可以分化为具有神经元或胶质细胞特征的细胞。结论:自体神经干细胞在损伤脊髓内可以存活并能分化为类神经组织细胞
李香琴[8]2011年在《骨髓间充质干细胞体外扩增及其与神经类细胞共培养的研究》文中进行了进一步梳理中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病与损伤,如帕金森病(Parkinson's disease, PD)、脊髓损伤等比较难以自我修复,神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植被认为是具有潜在应用价值的治疗手段,但NSCs来源困难。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)以其多分化潜能、可源于自体、免疫源性低、易扩增、能分泌多种细胞因子并参与细胞微环境的构建等优势,为CNS疾病与损伤的治疗提供了一个新的思路。本文旨在研究BMSCs扩增后通过与NSCs之间的相互作用促进PD体外实验细胞模型的修复,进一步为BMSCs移植治疗与修复CNS疾病与损伤提供相应的实验依据。本文首先采用胶原凝胶、中空纤维膜(hollow fiber membranes, HFMs)和自行研发设计的气升式环流生物反应器(air-lift loop bioreactor, ALB),建立一种可使细胞免受剪切力损伤的叁维动态扩增体系,将BMSCs在体外先行扩增。在扩增的过程中,通过取样检测吸光度及计细胞数,绘制细胞生长曲线,获得细胞扩增倍数；检测细胞代谢参数,确定细胞的新陈代谢状况；扩增7天后,检测细胞在支架内的活性,观察细胞在支架上的生长形态,获得细胞进一步增殖、分化、保持自身功能的能力；流式细胞仪分析细胞表面特异性蛋白表达,检测细胞多向分化潜能,鉴定所扩增的细胞。结果表明,初始密度为5×105cells·mL-1的BMSCs在此系统中扩增时代谢旺盛,一周后,动态条件下扩增约17倍,静态条件下扩增约13倍；扩增的细胞仍保持较高的活性,活率约为92%,且在支架内仍保持长梭形的贴壁生长形态,仍表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45,并仍具有较强的成骨、成软骨及成脂肪的多向分化能力；动态条件下扩增的细胞呈现出更加充分伸展的形态与较强的多向分化潜能。将以上扩增的BMSCs与生长于支架内的NSCs进行短期静态共培养,考察BMSCs与叁维条件下NSCs之间的相互作用。实验中采用优化的海藻酸钙胶珠制备工艺,包囊适宜密度的NSCs,待微囊化的NSCs长至一定大小的神经球时,与BMSCs进行共培养。共培养过程中观察神经球结构及BMSCs形态的变化；共培养结束后计算NSCs及BMSCs的增殖倍数,对增殖条件下共培养的NSCs表型和多向分化潜能以及BMSCs向NSCs或神经细胞分化进行免疫荧光染色鉴定；对分化条件下共培养的NSCs向不同神经细胞分化的能力进行流式细胞仪检测,对BMSCs向NSCs或神经细胞分化进行免疫荧光染色鉴定。结果表明,1.5%(wt%)的海藻酸钠溶液与3.5%(wt%)的CaCl2溶液凝胶化反应10min,以0.8x105cells·mL-1为初始密度包囊NSCs,制备直径约2mm的海藻酸钙胶珠,与BMSCs进行共培养是比较适宜的。BMSCs可使生长于支架内的NSCs迁出细胞球,对NSCs的增殖没有明显影响；但能够明显影响NSCs的分化,使其向少突胶质细胞分化的能力增加3倍,向星形胶质细胞分化的能力减弱1倍,而向神经元细胞分化的能力没有明显变化；NSCs可促进BMSCs向NSCs及星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元细胞分化,且在分化共培养时这种分化比例增加,分别由增殖共培养时的约8%,11%,6%及7%增加至约18%,25%,15%及11%。根据上述BMSCs与NSCs之间的相互作用,本文进一步利用去血清诱导PC12细胞凋亡,建立PD体外实验细胞模型,将诱导凋亡的PC12细胞与NSCs及BMSCs以不同方式进行共培养,考察BMSCs在NSCs修复这一细胞凋亡模型中的作用。实验采用海藻酸钙胶珠或transwell小室作为共培养隔离手段,通过观察PC12细胞的形态,检测PC12细胞的存活率、细胞周期和培养基中胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF)的含量,确定BMSCs在NSCs保护去血清诱导PC12细胞凋亡中的作用。结果表明,NSCs通过分泌神经营养因子GDNF抑制了去血清诱导的PC12细胞的凋亡,使受损细胞的凋亡率由模型组的44.0%降低至24.3%,存活细胞处于G1期的百分数由模型组的79.9%降至53.1%,处于S期和G2期的百分数分别由模型组的15.3%和4.9%增加至35.5%和9.8%,与正常培养的PC12细胞所处周期没有较大差异,G1期细胞向S期和G2期过渡基本未受阻断,起到了神经保护作用；引入BMSCs后,两种干细胞通过相互促进向神经细胞方向分化,使培养体系中细胞分泌GDNF的量比单独NSCs作用时平均增加约33.4%,细胞分泌GDNF的能力明显增强,提高了对去血清诱导凋亡的PC12细胞的保护作用,使受损细胞的凋亡率由单独NSCs作用时的24.3%继续降低至15.1%,且存活细胞处于G1期、S期和G2期的百分数分别为53.3%,36.7%和10.3%,仍与正常培养的PC12细胞所处的周期没有较大差异。
张伟[9]2011年在《组织工程化人工神经修复长节段周围神经损伤的实验研究》文中指出【背景】周围神经损伤(peripheral nerve injury, PNI)是临床最常见的创伤之一。随着现代建筑业、交通运输业的发展以及局部战争的频发,PNI的发生率也逐年呈上升趋势。由于成熟的神经元不能分裂和复制,与其它组织相比,周围神经损伤后的再生和恢复效果还很不理想。若不能及时救治,可导致肌肉功能丧失、感觉功能损害、功能恢复不佳甚至导致病人终生残疾,给社会带来巨大的损失和沉重的负担,已成为世纪医学挑战之一。目前国内外修复周围神经损伤的主要策略是桥接神经断端,促进神经轴突再生,克服再生屏障。20世纪90年代Lundborg利用神经再生室模型证实神经趋化特异性以来,神经导管修复神经缺损的优势逐渐被人们认识和接受。随着组织工程技术的飞速发展,周围神经损伤的修复又取得了新的进展。组织工程技术治疗PNI的基本模式是―种子细胞+细胞因子+生物支架‖。利用具有良好的组织相容性和生物活性的组织工程化人工神经搭载神经干细胞修复PNI取得了一定得疗效。【目的】1、体外培养骨髓间充质干细胞(BMSCs),并在体外诱导分化为骨髓源性神经干细胞,实现短时间内获得增殖能力较强的神经干细胞的要求。2、以PLGA为原料制作管壁具有叁维结构的中空的可降解组织工程用神经导管。3、利用IKVAV自组装多肽构建组织工程化人工神经。4、将可降解神经导管、IKVAV自组装多肽凝胶、骨髓源性神经干细胞和神经生长因子构建的组织工程化人工神经移植至坐骨神经缺损处,观察神经再生和功能恢复情况,探讨新型组织工程化人工神经修复周围神经的可行性。【方法】1、利用全骨髓培养法进行原代骨髓间充质干细胞的培养。以3月龄大白兔为取材对象,于胫骨平台下抽取2~3ml骨髓,加入Percoll液中离心,10%FBS,1%抗生素的DMEM培养液重悬后,接种于培养皿中培养。BMSCs达到亚融合后,去除培养液,加入诱导液(DMEM培养基、全反式视黄酸、bFGF等),诱导BMSCs向类施万氏细胞分化。2、以PLGA为原料,通过静电纺丝技术制作中空的、管壁具有叁维结构的可降解神经导管,并进行神经导管的体外、体内生物相容性测试。3、以IKVAV自组装多肽为原料,在一定条件下触发自组装形成多肽凝胶,并进行其与神经干细胞的相容性初步测试。4、将构建的组织工程化人工神经移植进行神经缺损修复实验。以新西兰大白兔为动物模型,实验动物随机分为3组:A组:自体神经移植组,B组:神经导管+神经干细胞+NGF,C组:神经导管+IKVAV自组装凝胶+神经干细胞+NGF。于术后3、6、9、12周,应用肌电图、肌肉湿重测量、HE染色、免疫荧光染色、透射电镜等观察方法观察神经干细胞的存活、周围神经功能的恢复情况。【结果】1、流式细胞仪鉴定结果表明成功分离、培养BMSCs,诱导后经S-100免疫细胞化学染色鉴定为类SC细胞,细胞纯度达87%。2、利用新型的静电纺丝工艺能够制作出管壁具有叁维结构的组织工程用神经导管,导管外径3mm,内径2.5mm,管壁纤维直径约18μm,呈螺旋上升结构。导管管壁孔隙率约85.4%,支架具有良好的生物相容性,降解时间约为3个月。3、在实验室条件下成功触发IKVAV多肽自组装成凝胶,透射电镜显示其纤维直径为10-30nm,长度可达数百纳米,纳米纤维交织成立体网状结构。测定神经干细胞在凝胶上的黏附率及生物活性显示其有良好的生物相容性。4、构建的人工神经修复长节段坐骨神经缺损,术后3组动物均出现不同程度的足底溃疡,恢复情况以A组最好,C组次之,B组最差。神经肌电图、小腿叁头肌湿重结果提示C组神经修复效果接近A组(P > 0. 05)而优于B组(P < 0. 05)。HE染色观察12周时A组见较多束状组织,神经纤维排列整齐,神经纤维较为粗大,髓鞘较厚。B、C组切片可见PLGA纤维基本降解、消失。C组亦可见较多束状的组织,呈波浪形,神经纤维较A组稀疏,组织间可见新生毛细血管,胶原组织较少。而B组中神经纤维排列较杂乱,胶原组织较多,神经纤维细小。透视电子显微镜观察:A组中有大量的有髓神经纤维,排列均匀。B组有髓神经纤维形态不规则,数量较少,少数神经纤维髓鞘轻度肿胀,呈脱髓鞘改变。C组中再生有髓神经纤维较多,但分布不均匀,纤维直径和髓鞘厚度大小不等,神经纤维间有较多新生血管形成。12周时组织工程化人工神经切片在荧光显微镜下观察到在神经损伤处有GFP荧光表达,表明神经干细胞在人工神经内仍然存活。【结论】1、采用全骨髓培养法进行BMSCs,可以获得大量高纯度BMSCs,经诱导后可以转化为类SC细胞,可作为神经修复的种子细胞。2、利用静电纺丝技术制作的PLGA可降解神经导管,具有良好的生物相容性和适当的降解时间,可以用来修复PNI。3、IKVAV多肽可以自组装形成凝胶,凝胶是由纳米纤维交联形成的类似细胞外基质的物质,具有良好的生物相容性和生物活性,可以作为神经组织工程支架。4、组织工程化人工神经修复坐骨神经具有较好的疗效,植入体内的神经干细胞可存活3个月以上,神经缺损处发现新生轴突,坐骨神经功能得到部分恢复。
刘然, 范洪学, 刘世文[10]2010年在《物理治疗因子对干细胞调控机制的影响》文中研究表明背景:化学性因子对干细胞调控机制的研究是当前国内外的热点。但许多研究证实物理因子刺激也可以干预干细胞的调控,使其向目的细胞定向分化及产生功能。目的:探讨某些物理因子对干细胞定向分化的实际应用价值。方法:就近10年国内外常用物理治疗因子对干细胞增殖分化影响的论文约102篇作一回顾,其中脉冲磁场刺激、经颅磁刺激、脉冲电(电针)刺激、超声波治疗、高压氧、力学刺激(pulsed electromagnetic fields,transcranial magnetic stimulation,Low Frequency Impulse Electrotherapy,Ultrasonic Therapy,high pressure oxygen,various mechanical stress)的研究报告略多,认为这些物理因子可促进干细胞增殖分化,而运动训练及弱直流电刺激因子(treadmill training,direct current stimulation)的研究报告甚少,可能受限于研究思路或手段,没有确切的共识或报告信息。结果与结论:物理因子作用于干细胞的机制比较复杂,其可能参与了包括细胞因子和生长因子在内的生物化学环境共同组成的细胞生长微环境,可能对细胞因子等生物化学信息提供补充或协调作用。
参考文献：
[1]. 兔骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及移植修复脊髓损伤实验研究[D]. 代广辉. 第一军医大学. 2004
[2]. 骨髓源神经干细胞移植联合GDNF治疗脊髓损伤的实验研究[D]. 袁军. 第一军医大学. 2006
[3]. 骨髓基质细胞源性神经干细胞坐骨神经和脊髓移植实验[D]. 李贵涛. 第一军医大学. 2006
[4]. 兔骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及移植修复脊髓损伤实验研究[J]. 刘德虎. 中医临床研究. 2016
[5]. 新西兰大白兔骨髓基质细胞的诱导分化及其生物活性物质分析的实验研究[D]. 陈剑荣. 第一军医大学. 2004
[6]. 大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及自体移植治疗颞叶癫痫实验研究[D]. 王焕明. 南方医科大学. 2007
[7]. 自体神经干细胞在兔损伤脊髓内存活并分化的实验效果[J]. 代广辉, 徐如祥, 王峰, 姜晓丹, 杜谋选. 中国临床康复. 2004
[8]. 骨髓间充质干细胞体外扩增及其与神经类细胞共培养的研究[D]. 李香琴. 大连理工大学. 2011
[9]. 组织工程化人工神经修复长节段周围神经损伤的实验研究[D]. 张伟. 第二军医大学. 2011
[10]. 物理治疗因子对干细胞调控机制的影响[J]. 刘然, 范洪学, 刘世文. 中国组织工程研究与临床康复. 2010
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