何维1 张丹2 朱星枚2（通讯作者）
(1成都市食品药品检验研究院 四川 成都 610045)
(2陕西中医药大学药学院 陕西 咸阳 712046)
【摘要】 目的：建立皮炎湿敷剂微生物限度检验方法。方法：参照《中国药典》2010年版微生物限度检查法进行方法学验证，用常规法对细菌、霉菌和酵母菌计数，用常规法对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌进行检查。结果：皮炎湿敷剂中细菌、霉菌和酵母菌的回收率均>70.0％。控制菌中，样品对照组和阴性对照组均未检查出控制菌，试验组和阳性对照组均检出控制菌。结论：使用常规法可以去除皮炎湿敷剂抑菌作用，此法可以适用于皮炎湿敷剂微生物限度的检查。
【关键词】 皮炎湿敷剂；微生物限度检查法；常规法
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）24-0334-03
Validation method used for microbial limit test of Dermatitis shi fu agent
He Wei1,Zhang Dan2,Zhu Xingmei(corresponding author)2
1. The Food and Drug Testing Center of Chengdu,Chengdu,Sichuan,610045,China；2. Department of pharmacy of Shaanxi University Of Chinese Medicine,Xi’an 712046,China
【Abstract】 Objective To establish the microbial limits test method for shi fu agent.Methods According to the Chinese Pharmacopeia 2010 edition and by the means of routine method,microbial limits test for the samples were performed；Routine method was used for the detection of fungus and yeast fungus and control bacteriae.Results The recovery rates of routine method were above 70.0%; the control bacteriae could be detected in the positive group and treatment group, which could not be detected in the control group and negative control group.Conclusion This method applied for microbial limit test can objectively reflect the status of microbial contamination in preparations so as to meet the destination of examination．
【Key Words】Microbial limit test;Routine method;Banishing Cream
皮炎湿敷剂主要成分有龙胆草、甘草等，具有清热燥湿，抗敏止痒的功效，用于各种急性皮炎。龙胆草、甘草等中成药，其中任何抑菌成分对微生物限度的结果判断有干扰。微生物限度检查法是判断样品是否受到微生物污染的依据和标准，是对样品生产全过程微生物情况的评价标准，对生产仪器和试验过程有指导作用。按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法标准规定，本品细菌数每1g不得超过100cfu，霉菌和酵母菌数每1g不得超过100cfu，金葡菌和铜绿菌每1g内不得检出。样品按微生物限度法操作，应适用于本品的检查。为确证实验方法有效，参照《中国药典》的要求，对皮炎湿敷剂微生物限度做了方法学验证。
1.仪器、试药与菌种
1.1 仪器
洁净工作台、电热恒温水浴箱、隔水式恒温培养箱、LRH 250生化培养箱。
1.2 供试品
皮炎湿敷剂，批号 131121、140115、140418。
1.3 培养基
营养肉汤培养基，改良马丁培养基，营养琼脂培养基，改良马丁琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，胆盐乳糖培养基。
1.4 稀释剂
0.9％无菌氯化钠溶液， pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.5 菌种
大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，由中国药品生物制品检定所提供，所有菌种均为第4代培养物。
2.方法与结果
2.1 细菌数测定方法验证实验
2.1.1菌液的制备 参照《中国药典》的要求配制大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]五种菌液。
2.1.2供试液制备 取本品10g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，45℃水浴中，制得1：10供试液。
2.1.3回收率测定
2.1.3.1供试品对照组 取1：10供试液1mL至平板中，制备2个平行平板，测定样品本底细菌数。
2.1.3.2菌液组 分别量取上述5种试验菌悬液各1mL，每株试验菌平行制备2个平皿。
2.1.3.3试验组 取1：10供试液1mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1mL，分别制备2个平行平板，参照《中国药典》的要求计数。白色念珠菌、黑曲霉菌悬液倾注玫瑰红钠琼脂培养基，分别制备2个平行平板，参照《中国药典》的要求计数。
2.1.4控制菌检查
2.1.4.1供试液制备 取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，45℃水浴，得1：10供试液。
2.1.4.2菌液制备 参照《中国药典》的要求配制金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]五种菌液。
2.1.4.3常规法检查铜绿假单胞菌 试验组：分别量取供试液10 mL和铜绿假单胞菌菌悬液1mL到100mL胆盐乳糖培养基中，35℃培养22小时。划线接种在溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，22小时后，观察典型菌落的生长情况。量取铜绿假单胞菌菌悬液1mL到100mL胆盐乳糖培养基中，操作同上。样品对照组：操作同试验组。
2.1.4.4常规法检查金黄色葡萄球菌 试验组：分别量取供试液10mL和金黄色葡萄球菌菌悬液1mL到100mL营养肉汤培养基中，35℃培养24小时。划线接种在甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，24小时后，观察典型菌落的生长情况。量取金黄色葡萄球菌菌悬液1mL到100mL营养肉汤培养基中，操作同上。样品对照组：操作同试验组。
2.1.5微生物限度检查 取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL，于45℃混匀，得1：10供试液。细菌、霉菌和酵母菌计数采用常规法检查，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌参照《中国药典》的要求检查，应符合规定。
2.1.6结果
2.1.6.1试验组的菌回收（%）率=(试验组平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数×100%，结果见表1。
表1以看出，本品采用常规法（1mL/皿）检查细菌数、霉菌和酵母菌数，在三次独立的平行试验中，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5种菌的人工染菌回收率均高于70%。因此，本品细菌计数、霉菌和酵母菌计数可采用常规法（1mL/皿）。
2.1.6.2控制菌检查结果 应用常规法分别对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌进行检查。供试品对照组和阴性对照组未检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，试验组和阳性对照组均检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。结果见表2和表3。
3.讨论
同一品种不同批号的菌回收率不同，因此《中国药典》[1]规定的3次独立的平行试验应取3批样品验证为适当。验证条件应保持一致，以确保重复性。因为菌种具有特殊的活性生物，很多因素都会影响到菌悬液的浓度，所以在操作时试验时应确定相关参数开展试验，该品种采用常规法进行试验，经验证5种控制菌的人工染菌回收率均高于70%。当样品中的组分成分、生产工艺、微生物限度检查法修订或者检验条件发生变化的情况下，微生物限度检查法需要重新进行方法学验证，让样品的检查法结果准确可靠。微生物限度检查法更新完善速度在加快，让大家也充分了解到中成药微生物限度检查中方法学验证工作的重要，为日后完善中成药标准提供科学依据，为中成药走出国门提供严实基础。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典，一部[s]．北京：中国医药科技出版社，2010．
[2]高雷，张平，程钢等.黄蜀葵花口腔溃疡膜微生物限度检查方法学验证[J].中国药房，2009，15(2)：1177-1179．
[3]刘雅清.板车消炎颗粒微生物限度检查法的验证[J].中国实用医药，2011，6(4) ：267-268.
论文作者:何维1,张丹2,朱星枚2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2016年8月第24期
论文发表时间:2016/9/6
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