江卫民[1]1999年在《小鼠牙本质涎磷蛋白cDNA克隆、表达、纯化、抗体制备及其组织表达特异性研究》文中指出牙本质矿化的分子机制尚不清楚。目前己知的是牙本质磷蛋白(dentinphosphoprotein，DPP)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)是唯一由成牙本质细胞合成和分泌的两种牙本质特异性非胶原蛋白，分泌至矿化前沿，起着启动牙本质矿化以及调节羟基磷灰石晶体的大小和生长速度的作用。大鼠DPP和DSP cDNA已分别被克隆和特征。近来关于牙本质特异性蛋白的一个重要进展是发现DPP和DSP是由单一基因，命名为牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein，DSPP)基因编码的同一转录模本的表达产物。但是否存在一个完整的牙本质涎磷蛋白，尚需要在蛋白水平加以证实。本研究针对上述问题，采用分子生物学技术，对牙本质涎磷蛋白cDNA进行了克隆，原核表达和纯化，并制备了抗牙本质涎磷蛋白的抗体，进行了蛋白印迹(Western blot)和免疫组化的研究，从蛋白水平和分子水平探讨了牙本质涎磷蛋白的组织表达特异性，为获得有活性的牙本质涎磷蛋白及其功能研究奠定了基础。实验分为三部分：1．小鼠牙本质磷蛋白和牙本质涎磷蛋白cDNA的克隆和部分序列分析；2．小鼠牙本质涎磷蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化；3．小鼠牙本质涎磷蛋白抗血清的制备及其组织表达特异性研究。 一．小鼠牙本质磷蛋白和牙本质涎磷蛋白cDNA的克隆和部分序列分析 采用异硫氰酸胍一步法从小鼠牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR方法，从cDNA中扩增出小鼠DPP、DSPPcDNA基因片段(约1.6 kb和3.0kb)，将所得基因片段插入pBluescript Ks(pBS)质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue，挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。所用引物为根据国外文献报道的大鼠DPP cDNA和小鼠DSPP cDNA序列进行设计的，具有良好的准确性和重复
张蓉[2]2001年在《牙本质涎磷蛋白在牙齿发育、矿化及牙髓损伤修复中作用的研究》文中进行了进一步梳理牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）是一牙牙本质非胶原蛋白，主要由成牙本质细胞表达，是目前较为公认的牙齿特异性蛋白。近年来，DSPP的基因结构及mRNA水平的表达模式己较清楚。蛋白印迹实验证实小鼠牙胚中有DSPP蛋白的存在。但是，DSPP在蛋白水平的表达模式如何？它的生物学功能和作用机制是什么？它在牙髓损伤修复中的作用又如何？目前国内外均未见报道。这些问题的研究，对我们在该蛋白后基因水平的了解具有重要意义，也为我们深入了解牙本质生物矿化机制、对牙体组织疾病和损伤进行生物性防治提供理论依据。本研究针对上述问题，从以下几方面进行了实验研究：一.DSPP在小鼠牙胚及软骨发育中的表达 采用免疫组化和原位杂交方法分别从蛋白和基因水平对DSPP在小鼠牙胚发育各阶段（蕾状期除外）的表达进行检测。结果显示：DSPP在蛋白和基因水平的表达基本一致。它在成牙本质细胞的表达始于钟状中期（胎龄19d），并贯穿以后的各个时期；而在前成釉细胞和成釉细胞中具有一过性表达。提示DSPP在小鼠牙胚发育过程中的表达具有时空特异性。此外，在实验中我们意外发现，除牙齿外，DSPP还可在小鼠鼻软骨中表达。为进一步证实这一结果，本实验采用RT-PCR方法，首次从小鼠鼻软骨中克隆到719bp的DSPP cDNA序列，并且在进一步的研究 第四军医大学博士学位论文中发现DSPP在软骨的表达于生后16d时为阳性，而生后sd时为阴性。结果提示：DSPP并非为牙齿的特异性蛋白！除牙齿外，它还可在小鼠鼻软骨中表达，且表达具有时间特异性。二．DSPP反义核酸对体外培养牙胚发育和矿化影响的研究 采用反义核酸技术，用特异的与 DSPP mR＼A互补的反义寡脱氧核昔酸（ODN）抑制体外培养小鼠牙胚中DSPP的翻译，继而观察该抑制反应对牙胚生长及矿化的影响。实验共分为三组：反义ODN组；正义ODN组及空白对照组。培养牙胚均取自胎龄为17d Balb／C子鼠上颌第一磨牙。对照牙胚置于无血清BGjb半固体培养基中培养；其余牙胚分别置于含有30 11M，长 15hP的 DSPP反义或正义 ODN的半固体培养基中培养。牙胚体外分别培养16d和 10d后，进行HE，von Kossa染色或透射电镜检测。结果显示：同空白对照组牙胚相比，反义ODN组牙胚明显缩小，且vonKossa染色结果为阴性（对照为阳性）；而正义ODN组牙胚形态、大小及vo。Kossa染色结果与空白对照相似。进一步的透射电镜显示：反义 ODN组牙尖处成牙本质细胞中粗面内质网扩张较对照更为明显，而牙本质基质厚度却小于对照，且胞外基质中胶原纤维粗细不等，排列紊乱。本研究首次用直接的实验证据说明DSPP反义ODN不仅可抑制牙胚的矿化，还可减缓体外培养牙胚的发育。该影响可能是通过对成牙本质细胞分泌功能的影响及对胶原纤维粗细和排列方向的控制所造成的。研究证实：DSPP在牙本质矿化中起着重要作用。同时，实验结果还提示：DSPP在维持牙齿正常的生长发育中也起着重要的作用。三．DSPP在大鼠牙髓损伤修复中的表达 采用单纯开放法构建大鼠实验性牙髓损伤修复模型，并在此基础上采用兔疫组化和原位杂交方法，对DSPP在牙髓早期损伤修复中的表达进行研究。结果显示：DSPP在牙髓损伤后的表达与损伤后时间具有显著相关性。它在成牙本质细胞中的表达于损伤后 6－12h下调、l－3 d时 第四军医大学博士学位论文显著上调而于7d时趋于正常。结果提示：DSPP可能在早期牙髓损伤修复中起重要作用。 本研究通过多种研究技术和手段，从基因和蛋白水平；大体和超微结构方面对DSPP在牙齿发育、矿化及牙髓损伤修复中的作用进行了较为系统的研究。结果证实了DSPP在牙本质矿化中起着重要作用。同时发现：DSPP在维持牙齿正常发育中也起着重要作用。并且除牙齿外，它在软骨中也有表达。为进一步全面了解该蛋白和深入探讨牙本质生物矿化的分于机制提供了实验依据。
张莹[3]2002年在《人牙本质涎蛋白的基因克隆、表达和功能研究》文中研究指明牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)属于牙本质非胶原蛋白，占牙本质非胶原蛋白的5％～8％，因与骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)相似而得名。DSP富含谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)，由366个氨基酸组成，分子量约为53 000，含30％的碳水化合物和10％的涎酸，有6个潜在的糖基化位点和13个潜在的磷酸化位点。DSP的功能尚不清楚，考虑到DSP在成牙本质细胞中有阳性表达，并在前成釉细胞中有一过性表达，推测DSP可作为成牙本质细胞和相关细胞的标记物，并可能在上皮和间充质之间充当信号分子，参与成牙本质细胞分化。 一、人牙本质涎蛋白的基因克隆、表达、多抗制备和组织表达研究 克隆hDSP成熟肽编码区基因片段并进行原核表达，用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总RNA，再用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA，然后用RT-PCR法，从cDNA中扩增出hDSP基因片段(约600bp)，将所得基因片段插入pBluescript质粒载体，转化到大肠杆菌XL1-Blue后，挑选阳性克隆，提取重组质粒DNA，通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆；再将hDSP基因重组入表达载体pGEX-3X中构建表达载体，并在大肠杆菌BL21中进行表达。结果酶切图谱和序列分析与文献报道一致，并且hDSP蛋白(约200个氨基酸)在大肠杆菌中得到了高效表达。用原核表达并经过纯化 第囚旱巨大学傅士学位论文 的人牙本质涎蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清，抗血清效价可达1： 100 000。用 Western blot法检测不同组织的表达情况，结果显示 hDSP在人牙 胚中有表达，分子量约为60 000左右，而其它软组织（包括牙龈、肝、肾。 脾等）则无表达，其分子量大小与天然牙本质中DSP的分子量接近。 二、人牙本质涎蛋白全长基因表达载体的构建和莫核细胞转染 用原核系统表达目的蛋白具有产量高、成本低、操作简单等特点，但是原 核系统表达的目的蛋白不具备折叠、糖基化等特点，所以用原核系统表达的目 的蛋白常常不具备天然蛋白的功能。由于hDSP是高度糖基化的糖蛋白，所以， 最好选择真核表达系统。本研究将hDSP全长基因克隆入真核表达载体 pCDNA3中，构建pCDNA3－hDSP重组质粒。酶切鉴定和测序正确后，将 pcDNA3－hDSP真核表达质粒转染COSJ细胞，Western Blot和免疫组化均证 明hDSP在COS刁细胞中得到了较高表达，为其功能研究提供了保障。 三、人牙本质涎蛋白的功能研究 首先，通过免疫组化方法观察了hDSP在人牙胚不同发育阶段的表达情 况。显示hDSP在蕾状期、帽状期成釉器上皮、钟状早期内釉上皮有弱表达， 正在分泌基质的成牙本质细胞、牙本质小管有强阳性表达，而在钟状晚期， hDSP主要在牙本质小管中表达，成牙本质细胞转为弱阳性表达。前成釉细胞、 成釉细胞有一过性表达，而前期牙本质始终无阳性表达，牙胚周围牙槽骨、软 骨和口腔软组织无阳性表达，提示hDSP是牙齿特异性的蛋白，它只在成牙组 织中有表达。另外hDSP在前成釉细胞和成釉细胞中的一过性表达，提示hDSP 不仅参与了牙本质的形成，而且还可能参与了上皮和间质之间的信号传递。再 者前期牙本质阴性表达，表明hDSP蛋白直接通过成牙本质细胞突起穿过前期 牙本质分泌至矿化前沿，参与牙本质的形成。 其次，观察了hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶 活性的影响。选择第5代人牙乳头间充质细胞，通过MTT比色法观察细胞增 殖情况，发现hD盯能明显抑制培养的人牙乳头间充质细胞增殖（P＜0刀1）；通 4 第q罩巨大学俗士学位论X 过检测细胞内和细胞外碱性磷酸酶活性，发现hDSP能明显促进培养的人牙乳 头间充质细胞碱性磷酸酶的分泌（P＜o．01），提示hD SP在人牙乳头间充质细 胞的分化和矿化过程中可能起重要的调节作用。 最后，通过hDSP对狗牙直接盖髓观察hDSP对牙髓损伤修复的影响。选 择体重 10 kg左右、年龄 6～12月的健康杂种狗 3只，选用尖牙、磨牙为实验 牙，共30个。分实验和对照两组：实验组：hDSP表达上清浓缩液加胶原膜， 18个牙；对照组：空白载体表达上清浓缩液加胶原膜和 PBS加胶原膜，各 6 个牙。胶原膜作为载体与实验组、对照组的液体复合，4”C过夜。 结果：hDSP盖髓术后2周，对照组和实验组牙髓组织炎性细胞少见，成 纤维细胞增生明显，实验组和对照组均无牙本质桥形成。随着盖髓时间的延长
参考文献：
[1]. 小鼠牙本质涎磷蛋白cDNA克隆、表达、纯化、抗体制备及其组织表达特异性研究[D]. 江卫民. 第四军医大学. 1999
[2]. 牙本质涎磷蛋白在牙齿发育、矿化及牙髓损伤修复中作用的研究[D]. 张蓉. 第四军医大学. 2001
[3]. 人牙本质涎蛋白的基因克隆、表达和功能研究[D]. 张莹. 第四军医大学. 2002