刘万宏[1]2016年在《青蒿DXS基因家族功能分化及低温促进青蒿素合成的分子机制研究》文中提出疟疾是一种严重危害人类健康的传染病,估计全球每年约4亿人感染,接近100万人因此而死亡。青蒿(Artemisia annua L.)是一种中国传统中药,因其含有可用于疟疾治疗的过氧桥键倍半萜内酯化合物青蒿素而闻名。然而在青蒿植株中青蒿素的含量极低,仅为干重的0.01-0.8%。植物次生代谢工程是提高青蒿素含量的有效策略之一。因此,解析青蒿素生物合成途径基因功能,尤其是对基因家族成员功能研究将加深对青蒿素生物合成机制的解析。(1)青蒿DXS基因家族的克隆与分析青蒿素是一种倍半萜化合物,其碳骨架IPP和DMAPP来源于定位于胞质的MVA途径及定位于质体的MEP途径。近年来报道MEP途径提供1分子的IPP构成FPP的核心骨架,因此MEP途径可能是青蒿素合成启动的关键。DXS是MEP途径的第一个关键酶,以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为底物催化合成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸。在拟南芥、玉米等植物中,DXS是个小基因家族由2-4个成员组成。然而遗憾的是,目前尚未见青蒿DXS基因家族成员功能研究的报道。本研究采用RACE技术从青蒿中获得了4条编码DXS的基因序列。氨基酸序列比对发现AaDXS4与其他3个DXS具有较大差异,缺少结合GAP和TPP的保守氨基酸位点。系统进化树结果显示所有DXS基因家族成员聚类为3枝,其中AaDXS1属于DXS1 clade,AaDXS2和AaDXS3属于DXS2 clade,而Aa DXS4属于DXS3 clade,而其中DXS2clade中DXS通常与植物次生代谢合成相关。构建亚细胞定位载体转化烟草原生质体,激光共聚焦结果显示所有AaDXS全都定位于质体,这与MEP途径基因编码蛋白在植物质体中表达的事实是吻合的。(2)筛选稳定的内参基因为DXS基因家族表达模式研究奠定了基础近年来荧光定量PCR因其具有高度灵敏性和特异性而成为基因表达模式分析的主流技术。在本研究中,qPCR用于分析AaDXS家族基因在不同组织或不同处理植株中表达水平差异。然而内参基因的选择和验证对于使用qPCR进行基因表达研究是必要的前提。遗憾的是目前尚未对青蒿内参基因的稳定性进行评估。为了选择青蒿中适合用于qPCR分析基因表达的稳定内参基因,我们克隆10个看家基因18S rRNA,ACT,CYP,EF1α,GAPDH,RPⅡ,RPL13D,TUA,TUB和UBQ,并且考察它们在青蒿不同组织、低温胁迫、热休克、MeJA处理和ABA处理样本中的表达稳定性。采用两个基于Excel开发工具geNorm和NormFinder进行了稳定性分析。为了验证候选内参基因的稳定性,比较了不同组织样本中使用不同内参基因标准化的ADS基因表达水平,以及MeJA处理样本中使用不同内参基因标准化的ADS,cyp71av1和dbr2的表达水平。本研究的结果显示在10个候选内参基因稳定性表现多样,暗示单个内参基因不能同时适用于青蒿中所有样本。通过genorm和normfinder的分析,不同组织中rpⅡ&ef1α组合是稳定的内参基因。在植物激素处理的样本中,ef1α&tub推荐作为内参基因用于分析目的基因的表达水平。此外,act&ef1α是最适合用于分析温度处理样本标准化的稳定内参基因组合。然而,应用广泛的内参基因如18srrna和cyp表现出较差的稳定性,并不适合作为内参基因用于分析青蒿中基因表达水平研究。为了进一步验证上述实验结果的可靠性,rpⅡ&ef1α组合用作内参基因分析ads基因在不同组织中的表达水平,同时ef1α&tub组合用于分析meja处理青蒿中ads、cyp71av1和dbr2基因的表达水平。验证实验显示在不同组织中ef1αandrpⅡ较18srrna更为稳定,cyp是不适合用作内参基因分析meja处理植株中基因表达水平。我们的结果将有助于分析在不同实验条件下青蒿中的基因表达水平。(3)青蒿dxs基因家族成员的组织表达模式和诱导表达模式分析基因家族成员的组织表达模式和诱导表达模式在一定程度上能够解释生物学功能上的差异。在筛选获得稳定内参基因的基础上,我们采用qpcr分析了青蒿不同组织,不同叶片中dxs家族基因的组织表达模式;同时利用meja、光诱导、机械伤害、盐胁迫和低温胁迫处理青蒿,分析dxs家族基因的非生物诱导表达模式。结果显示aadxs3在花中的表达量最高,同时在不同叶片中aadxs3在顶芽中的表达水平很高,而在老叶中表达水平较低,这与ads基因的组织表达模式是一致的,暗示aadxs3的表达水平可能与腺毛体的密度相关。在meja处理的青蒿中aadxs2和aadxs3均能够受到诱导,其中aadxs3受诱导的表达水平更为强烈;aadxs3能够快速响应光,这一表达模式与青蒿素生物合成途径关键酶基因ads和cyp71av1的表达模式相一致;aadxs1是唯一能够受到机械伤害后表达上调的基因,而aadxs3在此处理中表达水平显着下降。aadxs2和aadxs3能够响应盐胁迫且表达水平提高,低温胁迫早期所有成员表达水平均降低,而在6h后aadxs2和aadxs3的表达水平较对照有显着提高。为了进一步研究aadxs3的组织表达定位,采用fpni-pcr方法获得aadxs2和aadxs3的启动子区域序列。plantcare分析显示paadxs2存在响应光信号、meja等激素和冷胁迫的顺式作用元件;而paadxs3存在响应光信号、meja等激素的元件外,同时还有myb、bzip和wrky等转录因子的结合位点;在转基因植株中组织化学染色发现paadxs3启动gus在拟南芥腺毛体中表达。由于青蒿素的合成就是在青蒿叶片的分泌型腺毛体,因此aadxs3的生物学功能很可能是为青蒿素等次生代谢产物提供前体ipp和dmapp。(4)低温胁迫诱导AaDXS3表达水平提高及青蒿素含量积累的分子机制低温是一种有害的非生物胁迫,通常会导致植物中次生代谢产物的含量的增加以增强抗冻性。之前有报道称隔夜霜冻能够有效促进青蒿中青蒿素含量的增加。然而目前其分子机制尚不清楚。为了更好地理解低温胁迫如何促进青蒿素合成,我们考察了外源喷施MeJA对青蒿抗冻性的影响。在低温胁迫时间进程中分析了内源JA、青蒿素及其相关代谢产物的含量,同时考察了JA生物合成途径基因、调控青蒿素生物合成相关转录因子和青蒿素生物合成基因的表达。我们发现外源茉莉酸有效地增强了青蒿幼苗的抗冻性。低温胁迫能够诱导JA生物合成基因LOX1,LOX2,AOC和JAR1基因的表达,从而导致了低温胁迫青蒿植株中内源JA水平提高。增加的内源性JA促进了叁个响应JA信号相关的转录因子ERF1,ERF2,和ORA。上述叁个转录因子均能激活青蒿素生物合成基因如ADS,CYP71AV1,DBR2和ALDH1表达。事实上,这四个青蒿生物合成相关基因在低温胁迫植株中的表达水平较对照显着地提高。随后,青蒿素和相关代谢产物如二氢青蒿酸、青蒿素B和青蒿酸的含量在低温胁迫青蒿中均得到提高。我们的研究为低温胁迫调控青蒿素产量的分子机制提供了解释。
刘彦[2]2002年在《青蒿素生物合成相关基因的克隆、大肠杆菌表达与分子分析》文中研究说明利用现代分子生物学和基因工程技术手段，克隆青蒿素生成途径的关键酶基因，研究关键酶基因对青蒿素生物合成的调控规律，是打破青蒿素生物合成的限速步骤，大幅度提高青蒿素含量，最终达到利用植物生物技术工业化生产青蒿素的目的必须解决的关键问题。本论文基于此目的，开展了青蒿素生物合成相关基因的分子克隆工作。 用RACE方法从青蒿高产株系001中克隆了一个新的1886bp的全长倍半萜合酶cDNA。克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶、莨菪岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为39％，38％和41％；与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50％，48％和59％。cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在。RT-PCR分析表明此基因在茎、叶和花中表达，在根中没有表达。 用RT／PCR方法从青蒿高产株系001中克隆了amorpha-4，11-diene合酶cDNA。将该cDNA插入原核表达载体pET3d并在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达。Southern blot分析表明AMS基因在青蒿基因组中至少有3个拷贝。AMS基因组DNA有一个复杂的结构，包含有7个外显子和6个内含子。RT／PCR分析表明AMS基因在叶片、茎和花中表达，而在根中没有表达。 用RACE方法首次从青蒿中克隆了一个1539 bp全长鲨烯合酶cDNA。青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70％、77％、44％、39％。青蒿鲨烯合酶基因组DNA有一个复杂的结构，包括14个外显子和13个内含子。全长的或C末端截短的鲨烯合酶cDNA被克隆进原核表达载体pET30a并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。但在含有全长的鲨烯合酶cDNA的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达，而C末端截短30个疏水氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达。
肖娜[3]2012年在《青蒿醛脱氢酶基因克隆及青蒿琥酯抗菌增敏作用研究》文中提出目的：青蒿素以高效抗疟作用最为着名,但它也具有抗肿瘤、抗炎症(自身免疫病)等多种功效。由于世界市场供应的青蒿素主要来自我国人工种植的青蒿,其青蒿素含量偏低,生产成本较高,加之种植规模逐年萎缩,因而难以完全满足全球疟疾感染者对青蒿素类抗疟药的庞大需求,于是利用基因工程微生物大规模生产青蒿素成为当前最有希望的解决方案。本研究还对青蒿琥酯的抗菌作用进行了分子药理学评价,为利用抗生素增敏剂克服“超级细菌”日益严重的抗生素耐药性提供新思路。方法：本研究从青蒿中克隆了一个新的青蒿素前体合成基因——青蒿醛脱氢酶基因-1(ALDH1),并经双酶切、扩增和重测序予以确认。通过构建pESC-ALDH1表达载体(含尿嘧啶合成基因)并导入酿酒酵母YPH501菌株(尿嘧啶缺陷型)后,获得能在SD-U(尿嘧啶缺陷培养液)中生长的转化子。将酵母工程菌培养48-72h后,加入半乳糖处理12h诱导ALDH1基因表达,由青蒿试管苗制备无细胞提取液,对酵母发酵产物进行生物转化。在青蒿琥酯抗菌增敏作用研究体外实验中我们检测经过缺氧适应的地衣芽孢杆菌产生的NO值和生长状态(OD值)以及单纯添加抗生素和抗生素和青蒿琥酯联用时NO值和过氧化氢酶活性。在体内实验中以大肠杆菌和地衣芽孢杆菌分别作为革兰氏阴性菌(G-)和阳性菌(G+)的代表,通过粪便菌落培养和计数或血清NO含量测定,在活菌饲喂导致肠道细菌感染的小鼠中评价了青蒿琥酯对抗生素的体内增敏效果。结果：通过气象色谱-质谱分析可见,转化样品中的青蒿素含量高于对照样品,初步证实青蒿ALDH1基因已在酵母细胞中实现功能表达。青蒿琥酯抗菌作用体外实验结果可见青蒿琥酯与一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NMMA一样,可阻断缺氧及缺氧+冷处理诱导的细菌一氧化氮(NO)合成,也能抑制细菌过氧化氢酶(CAT)活性。体内实验可见,青蒿琥酯不仅能提高头孢菌素对G-细菌和利福平对G+细菌的杀伤效果,而且还可辅助氨苄青霉素抑制抗药性细菌的繁殖。结论：以上结果为进一步创建青蒿素全合成微生物平台奠定了基础,为克服“超级细菌”的抗生素抗性提供了新思路。
刘倩[4]2012年在《杀粉蝶菌素A1的生物合成研究》文中指出杀粉蝶菌素A1（Piericidin A1）是具有良好生物活性的-吡啶酮天然产物，可由多种链霉菌产生。它通过结合线粒体呼吸作用复合体I，抑制Fe-S簇氧化和泛醌的还原，从而作为线粒体呼吸作用抑制剂发挥作用。由于这一作用机理，杀粉蝶菌素A1对致病真菌显示较强的生物活性，但对微生物、植物致病菌抗菌活性相对较弱。此外，对蚕、菜青虫有很显着的杀虫效果。最近新的研究进展表明，杀粉蝶菌素A1还有抑制肿瘤的效果。上世纪七十年代，通过同位素前体的喂养发现碳骨架来自乙酸盐和丙酸盐单位，而与已知的其他-吡啶酮天然产物都是通过杂合PKS-NRPS合成显示出显着不同。本课题出发菌株是由浙江省农科院筛选的票霉素链霉菌杭州湾变种，是拥有我国自主知识产权的微生物资源。前期通过诱变育种得到的突变株，可产生具有较高杀虫活性的杀粉蝶菌素衍生物，但精确结构尚未确定。本研究首先对该菌株的次级代谢产物进行发酵和分离，并对活性成分进行结构鉴定，确定其结构为杀粉蝶菌素A1。此外，优化产生菌的产孢条件和接合转移条件，建立了遗传操作系统，为通过体内遗传学研究杀粉蝶菌素A1生物合成机理奠定了基础。通过Roche454高通量测序平台，对票霉素链霉菌杭州湾变种进行了基因组扫描，捕获了杀粉蝶菌素A1的生物合成基因簇。并对17kb区域进行大片段缺失，证实了与杀粉蝶菌素A1生物合成相关。进一步通过染色体步移和拼接（引物设计补gap），获得与杀粉蝶菌素A1的生物合成相关的长达130kb的序列。对这130kb的序列进行生物信息学分析，确定杀粉蝶菌素A1的生物合成途径包含12个基因，编码1个调控蛋白PieR、6个聚酮合酶PieA1-PieA6、1个转氨酶PieD、1个功能未知蛋白PieC、2个甲基转移酶PieB1和PieB2和1个单加氧酶PieE。以所包含的功能信息为依据，对这些蛋白功能进行了深入分析，推测杀粉蝶菌素A1的生物合成是由聚酮合酶、转氨酶和其它未知功能蛋白参与形成核心结构-吡啶环，由甲基转移酶和单加氧酶完成后修饰步骤，调控基因行使杀粉蝶菌素A1生物合成的特异性调控。随后，对参与杀粉蝶菌素A1核心结构-吡啶环生物合成的基因，pieTE、pieC和pieD基因进行了体内基因置换，并对获得的相应突变株进行了发酵检测。pieD、pieC、pieTE基因中断突变株发酵产物中都没有检测到中间产物的积累，一种原因可能是这类小分子的中间物没有特征的紫外吸收，很难检测；另外一种可能是这类中间物在体内复杂环境中被降解了。通过组合多种体外生物化学分析方法，研究了PieA6中的module8-TE的作用，确定了PieTE的水解功能。首先表达了重组蛋白module8-TE及点突变株module8-TE0（S148A），加入β-ketoacyl-SNAC和malonyl-CoA，经过一轮PKS的延伸缩合，产生β,-diketoacyl-S-ACP8。通过检测到的β,-diketo carboxylic acid脱羧后产生的undecane-2,4-dione，及fluoresceinamine偶联实验中产生的新峰对应于3,5-dioxododecanoicacid的偶联产物，证明PieTE是负责水解释放β,-diketoacyl-S-ACP8成线性β,-diketo carboxylic acid。此外，用DTNB试剂检测了PieTE水解SNAC模拟底物的水解能力，证实PieTE结构域可以水解β-ketoacyl-SNAC，并且对长碳链的底物具有偏好性，对短链的模拟底物基本无水解活性。当定点突变失活PieTE，使用module8-TE0（S148A）进行同样的体外催化反应时，发现天然底物β,-diketoacyl-S-ACP8很容易自发环化形成-吡喃酮。基于上述体内基因置换及体外模拟底物生物化学分析，发现了一种新的-吡啶环生物合成途径并初步阐明了杀粉蝶菌素A1的生物合成途径。I型PKS模块以典型的流水线装配模式组装成聚酮骨架，并被PKS C-端的PieTE直接水解释放生成线性聚酮链，PieD以游离氨为氨基供体，对聚酮链末端的羧基转氨，进而可能由PieC参与环化反应，形成核心结构-吡啶环。实验结果表明，由于PieTE可以高效地直接水解释放线状聚酮酸，所以避免了β,-diketoacyl-S-ACP8自发环化成-吡喃酮。与已报道的其他-吡啶酮类天然产物通过PKS-NRPS途径加载氨基酸单元而引入氮原子不同，证实杀粉蝶菌素A1的生物合成中具有一个新的-吡啶环合成途径。在杀粉蝶菌素A1的生物合成过程中，不是由氨基酸提供-吡啶酮上的氨基供体，而且需要PieTE高效催化水解将不稳定的β,-diketoacyl-S-ACP8释放，进一步以游离氮为氨基供体进行转氨环化，形成-吡啶酮。通过体内基因置换，失活了生物合成基因簇中的叁个修饰基因pieB1、pieB2和pieE。初步分析鉴定了突变株积累的中间物，已成功的对pieB2的目标中间物通过大规模发酵，积累了5mg纯品，准备进行NMR结构鉴定；构建了在大肠杆菌中异源表达PieB1、PieB2、PieE重组蛋白的表达载体。这部分实验初步阐述了杀粉蝶菌素A1生物合成途径中形成-吡啶酮核心结构后，叁步修饰过程发生的先后顺序，为进一步研究这叁个后修饰基因功能奠定了基础。此外，利用生物信息学工具，深入分析基因组序列，发现该菌株还包含丰富的其他多种次级代谢产物的生物合成信息，如PKS、NRPS、杂合NRPS-PKS、aminoglycoside、terpene、siderophore、lantibiotic等，为后期挖掘该菌株丰富的次级代谢产物资源提供基因序列的支持。
苏春[5]2012年在《Fostriecin生物合成基因簇的异源表达研究》文中提出Fostriecin (CI-920)是从链霉菌(Streptomyces pulveraceus ATCC31906)的发酵液中提取分离出来的结构新颖的天然磷酸酯类化合物,其抗肿瘤活性源于对DNA拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用以及选择性地抑制蛋白磷酸酶1(PP1)、蛋白磷酸酶2A (PP2A)和蛋白磷酸酶4(PP4)；体内实验证明,Fostriecin对小鼠淋巴白血病细胞P388和L1210均有很好的抑制作用,具有广谱抗肿瘤活性；因此,其作为先导化合物引起了很多科学家的兴趣并被作为抗肿瘤药物进行临床试验。目前,国外已经完成了对Fostriecin的Ⅰ期临床研究,结果较为理想；但是由于其在体内外的不稳定性,材料来源困难等因素导致临床研究未能进行下去。因此,目前迫切需要解决的问题是研究新的方法来生产Fostriecin以及新型衍生物,从而解决其纯度及稳定性问题。本课题的目标是对Fostriecin生物合成基因簇进行异源表达的研究,利用Red/ET同源重组技术试图在异源宿主菌中设计构建可以产生新型Fostriecin相关化合物的基因工程菌株,从而获得单一组分的化合物并为化学后修饰提供靶点。研究得到以下主要结论：(1)从链霉菌S. pulveraceus ATCC31906基因文库中获得了Fostriecin生物合成基因簇,并对Fostriecin生物合成相关的73kb的基因簇进行了生物信息学分析以及功能推测。基因簇中包含六个聚酮合酶基因(fosABCDEF),七个后修饰基因(fosGHIJKLM)以及八个与后修饰基因相关的基因(orfl-8)。(2)利用Red/ET同源重组技术构建了多个Fostriecin异源表达所需的基因克隆和表达载体。进行基因的一步融合构建了正负选择标记载体pRC,其可以在同源重组过程中实现阳性克隆的多次有效筛选,实现本研究中对多个较大基因片段的拼接；通过基因的精确替换构建了载体pMT和pCT,利用其中不同的筛选标记可以从含有不同抗性基因的载体中获得外源基因片段；另外,通过基因的定点插入构建了表达载体p184,其可与不同源复制子的表达载体共存,在同一宿主菌中对不同基因进行共表达。以上所构建的载体可以广泛应用于基因克隆操作中,为后续Fostriecin聚酮合酶基因簇的异源表达提供了克隆和表达的工具。(3)利用Red/ET同源重组技术将56kb的Fostriecin聚酮合酶基因簇(fosABCDEF)分段克隆到大肠杆菌共表达载体pMT和p184中,并将共表达载体转入可以促进聚酮合酶表达的工程宿主菌E.coli BG11-01和BAP1中,构建了Fostriecin聚酮合酶大肠杆菌异源表达系统BG11-01/p8-fosAB-pM-fosCDEF和BAP1/p8-fosAB-pM-fosCDEF,并进一步对表达系统进行诱导表达及其发酵产物的分析。虽然在发酵液中没有发现相关化合物产生,但是这一表达系统的建立为在异源宿主菌中设计构建可以产生新型Fostriecin化合物的基因工程菌株提供了可能,也为进一步分析Fostriecin聚酮合酶的功能以及生物合成代谢机制奠定了基础。(4)利用Red/ET同源重组技术将56kb的Fostriecin聚酮合酶基因簇(fosABCDEF)分段克隆到链霉菌整合型载体p126和游离型载体p124中,并将两个表达载体共同转入链霉菌模式表达菌株S. lividans TK24或者S. coelicolor M512中,构建了Fostriecin聚酮合酶链霉菌异源表达系统TK24/p6-fosAB～p4-fosCDEF和M512/p6-fosAB～p4-fosCDEF。对两个链霉菌表达系统进行发酵培养,发现其宿主菌中的色素基因均被激活,发酵液显示出不同的颜色；其RT-PCR结果也表明Fostriecin聚酮合酶基因簇在DNA水平得到了很好的表达。此外,仅在M512/p6-fosAB-p4-fosCDEF表达系统发酵液中获得了微量的Fostriecin前体化合物,进而推测出了一个Fostriecin生物合成代谢的新机制。(5)通过对Fostriecin生物合成过程中后修饰蛋白FosH的异源表达以及体外活性测试,发现其可以催化Dephosphofostriecin及衍生物完成C-9上的羟基磷酸化,证明了fosH为Fostriecin九位羟基的特异性磷酸激酶编码基因,完成了对其基因功能的定位。以上对Fostriecin生物合成相关基因簇异源表达的研究,为在异源宿主菌中设计构建产生新型化合物的基因工程菌株提供了可能,并为进一步分析Fostriecin聚酮合酶的功能以及Fostriecin生物代谢合成机制,及新型Fostriecin类似物的生物合成奠定了基础。
高允允[6]2012年在《微生物生物合成β-榄香烯前体—吉马烯A研究》文中研究表明p-榄香烯是从中国姜科植物温郁金中提取的一种高效、低毒、广谱的抗癌活性天然萜类化合物。β-榄香烯口服乳和注射液药物作为国家二类新药在临床上已经取得了显着的疗效。但是从植物分离提取β-榄香烯成本高、纯度低以及化学全合成步骤繁琐、要求条件苛刻等缺点,限制了β-榄香烯的广泛应用。因此,寻找p-榄香烯的新的经济可行的大规模制备技术对于p-榄香烯药物的推广应用将具有重要意义。本研究从构建的温莪术叶cDNA文库中克隆到了全长981bp的萜类化合物合成途径关键酶—IPP异构酶(GenBank:GU724874)编码基因,并利用颜色互补验证了该基因的功能。由于未能克隆出催化FPP合成吉马烯A的GAS合酶编码基因,本研究选择与细菌结构和生理状态相似的蓝细菌来源的GAS编码基因作为研究对象,分别在大肠杆菌和酿酒酵母中进行了表达,并且检测到的吉马烯A的产量分别是128μg/L和9.5μg/L,因此,选择大肠杆菌作为优化吉马烯A合成的表达系统。合成生物学结合微生物代谢工程,可用于微生物大量生产一些难于从原材料中提取、化学合成困难的高价值的代谢产物。本研究在p-榄香烯生物合成途径阐明的基础上,构建了一个由8个基因组成的可以在大肠杆菌中功能表达的异源甲羟戊酸途径,该途径和蓝细菌GAS基因共表达,结合合成条件的优化,p-榄香烯产量从最初的128μg/L,达到了6325.51μg/L,产量提高了54倍。本研究的大肠杆菌合成吉马烯A产量距离工业化生产还存在较大的差距,本研究中吉马烯A合成酶在大肠杆菌中表达的包涵体占表达总蛋白的76%,这个成为吉马烯A产量提高的限制因素。本研究正在开展利用定向进化技术,结合LacZa融合报告系统,筛选高可溶性表达的突变体研究。
陈俞裴[7]2017年在《青蒿茉莉酸受体AaCOI1的功能研究》文中研究指明青蒿素(Artemisinin)是一种经典的C15类型的倍半萜类化合物,因其结构中特有过氧桥键结构,使得其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾的治疗十分明显;世界卫生组织(WHO)推荐青蒿素联合疗法作为治疗疟疾的首选。最新的研究发现青蒿素对于抵抗病毒,抗肿瘤活性,治疗糖尿病和肺结核等疾病的治疗也有显着效果,其市场需求巨大。然而青蒿素的化学全合成因其合成产率低,副产物多,而且毒性较大,短时间内还很难应用于实际的生产。利用发酵工程部分合成青蒿的前体,然后再经过体外氧化合成青蒿素的技术虽然已经比较的成熟,但是其产量有限,相对于巨大的市场需求,任然存在巨大的市场差额。目前,从青蒿中分离提取青蒿素仍然是青蒿素市场供应的主要来源,但是野生型青蒿中提取青蒿素的含量极低,约占植株全部干重的0.01%-0.8%,于是,如何提高青蒿植株中青蒿素的累积,就成了当今研究植物次生代谢产物的主要目标。茉莉酸酯类是茉莉酸(Jasmonic acid,JA)及茉莉酸衍生物的统称,是重要的植物信号分子。对于植物来说,其生长发育的过程、对环境改变的防御响应和它的次级代谢产物的合成和积累都与茉莉酸有着举足轻重的作用。已有研究发现外源喷洒茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)处理青蒿植株时可以使青蒿素的含量显着累积上调。COI1作为茉莉酸途径的唯一受体,主要和SCF形成SCFCOI1复合物存在于植物体内,对植物的生长、耐盐性和抗逆性都起到了至关重要的作用。在番茄、水稻和橡胶等植物中对JA信号通路中的COI1受体相关功能已有一定的研究,而在青蒿中JA信号通路对青蒿素的生物合成调控具有重要作用,但对于JA信号通路中的基本原件并不是很清楚,因此本研究从青蒿中克隆JA信号通路受体编码基因Aa COI1并验证其生物学功能,为揭示JA调控青蒿素生物合成的分子机制奠定重要基础。本文以NCBI登录的拟南芥At COI1序列为基准,通过blast比对在青蒿转录组中查找到对应的COI1基因序列。通过PCR克隆后测序并对序列分析发现:Aa COI1的c DNA全长1767 bp(Gen Bank登录号:KY706201),它包含1752 bp的开放阅读框(Coding Domain Sequence,CDS),并编码一个584个氨基酸的蛋白质。蛋白质属于亲水性蛋白,其富含亮氨酸重复序列(LRR)和F-box结构域,但没有跨膜区、复合螺旋区、信号肽等结构域。亚细胞定位结果显示:Aa COI1特异性定位在细胞核中,双分子荧光互补(Bi FC)技术实验结果显示,Aa COI1与青蒿中的Aa JAZ1和Aa JAZ5存在相互作用。从青蒿c DNA文库中克隆得到Aa JAZ5序列,c DNA全长为1044 bp(Gen Bank登录号:KX034796),包括564 bp的CDS,且编码188个氨基酸。基因表达谱结果显示;Aa COI1、Aa JAZ5在青蒿的根中的相对表达量较高,在叶、花和茎中表达量较低;同时发现,Aa COI1、Aa JAZ5受到Me JA诱导性表达。Me JA处理后Aa COI1、Aa JAZ5基因的表达量在3h时呈显着提高(P<0.05),这些结果进一步证实了Aa COI1和Aa JAZ5都是JA信号通路的组成元件。在拟南芥中过量表达Aa COI1基因,因纯合突变的coi1-1是雄性不育,而coi1-1杂合型拟南芥是可育的,所以转入杂合型coi1-1的拟南芥中,筛选并获得纯系的纯合突变背景的转基因拟南芥可发育成角果,并且在Me JA处理拟南芥后发现互补之后的拟南芥对甲基茉莉酸敏感,与纯合突变的coi1-1相比根会变短和野生型拟南芥情况一样,回复突变后的拟南芥在Me JA处理后花青素的含量以及花青素合成途径上相关基因表达量都在增加,这些结果都说明了Aa COI1可以互补于纯合突变的拟南芥,进一步验证了,在甲基茉莉酸途径中Aa COI1的重要作用。综上所述,本研究克隆了来源于青蒿编码JA信号受体蛋白的COI1基因,采用q PCR研究了其在不同组织及诱导条件下的表达差异;通过亚细胞定位分析Aa COI1定位于细胞核中表达,并且能够与JAZ5在核中出现物理结合,说明本研究克隆的Aa COI1参与了JA信号通路;为进一步研究Aa COI1的生物学功能,采用突变体表型恢复的方法在coi1-1拟南芥中过表达Aa COI1,结果发现能够恢复拟南芥对茉莉酸反应,即恢复育性,在Me JA诱导下根生长出现抑制、花青素含量提高以及花青素合成途径相关基因表达量提高等表型。这些证据比较充分的证实了Aa COI1的生物学功能是作为青蒿JA信号通路的受体。
吕海舟[8]2017年在《AP2/ERF转录因子调控丹参活性成分生物合成的功能研究》文中研究指明丹参(Sallvia miltiorrhizaBunge.)为我国常用大宗药材,其有效成分——丹参酮和丹酚酸类化合物具有多种药理活性,以丹参为君药的“复方丹参滴丸”在治疗心脑血管疾病方面已取得显着疗效。近年来,丹参活性成分生物合成途径分子机制已获得深入解析,但其生物合成的调控机制研究尚十分匮乏。AP2/ERF转录因子在多种药用植物中具有调控活性成分(如倍半萜青蒿素、二萜紫杉醇等)生物合成的功能,而在丹参中调控活性成分合成的AP2/ERF尚未报道。本次研究的主要研究结果如下:1.本课题组已获得丹参基因组图谱,注释到170个AP2/ERF转录因子,命名为Sm001-Sm170。本研究基于已有丹参不同器官(根、茎、叶、花)及根不同组织(周皮、韧皮部、木质部)的转录组数据,参照已鉴定参与丹参酮及丹酚酸类化合物生物合成关键酶基因的表达谱,筛选出两个AP2/ERF转录因子,皮<韧皮部和木质部的规律;Sm082具有在根中显着性高丰度表达的特点。通过实时荧光定量PCR实验验证这两个AP2/ERF基因的表达谱,结果与转录组数据一致。构建瞬时转化体系,侵染烟草叶片,分析Sm008和Sm082的亚细胞定位情况,证明两个转录因子定位于细胞核中。2.本研究构建了丹参遗传转化体系,对Sm008和Sm082进行过表达、RNAi抑制表达分析,获取了丹参转基因毛状根。检测阳性转基因毛状根中Sm008基因抑制表达和过表达的效率,筛选出3个抑制表达株系:8i-1/3/6;3个过表达株系:8oe-1/8/9。检测了转基因毛状根中丹酚酸类化合物的含量变化,每个株系做叁个生物学重复。结果表明,与对照组相比,3个抑制表达株系中丹酚酸B的含量有明显下降,同时3个过表达株系中丹酚酸B含量明显上升。另外,观察到Sm008转基因毛状根和培养液呈现丹参酮类化合物所具有的黄/红色,所以对丹参酮的含量变化进行检测,结果发现,与对照组相比,Sm008抑制表达的2个株系中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量在毛状根及培养液中均下降,说明Sm008基因可能对丹酚酸及丹参酮类化合物的生物合成均具有调控作用。进一步分析转基因毛状根中参与丹参酮和丹酚酸生物合成基因的表达量变化,预测转录因子可能调控的目的基因,结果表明,Sm008可能调控的丹酚酸途径的目的基因为4CL2基因,丹参酮途径的目的基因为CPS1、KSL1、CYP76AH1基因。3.对于Sm082的转基因株系,筛选出4个抑制表达株系:82i-1/5/7/19;1个过表达株系:82oe-9。化学含量分析结果表明,与对照组相比,4个抑制表达株系中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA明显下降,过表达株系中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮含量上升;而丹酚酸B含量在过表达及RNAi株系中均无明显变化;说明Sm082基因对丹参酮类化合物的生物合成具有调控作用,对丹酚酸类化合物的生物合成不具有调控作用。分析关键酶基因的表达量变化说明Sm082可能调控丹参酮途径的目的基因为CPS1、KKSL1基因。本次研究还获得了 Sm082转基因毛状根对应的转基因组培苗,观察根系及叶片的荧光情况及qRT-PCR实验证明转基因组培苗依然携带GFP报告基因且保持了Sm08 基因的抑制/过表达状态。4.构建Sm008和Sm082基因的原核表达体系,Sm008在异源表达体系中可以表达并获得可溶性蛋白,而Sm082在蛋白提取的上清和沉淀中均未诱导表达获得蛋白。同时,我们还预测了丹参酮及丹酚酸类化合物生物合成途径中一系列关键酶基因的启动子区,筛选出含有GCCbox的启动子序列并进行启动子区克隆,已克隆到启动子区的基因有参与丹酚酸类合成的SmRAS1和SmTAT1及参与丹参酮合成的SmCPS1。实验结果初步证明Sm008和Sm082转录因子对丹酚酸及丹参酮生物合成具有调控作用,调控的分子机制仍有待于进一步解析。
王福生[9]2016年在《柑橘类柠檬苦素生物合成相关基因的鉴定与功能验证》文中进行了进一步梳理类柠檬苦素是柑橘中特异存在的叁萜类物质,是一类具有抗癌、降低胆固醇、抗病毒和消炎等生物活性的次生代谢产物,对人体健康具有较大的价值。本研究以12个柚类品种为实验材料,分析不同发育过程中不同组织的柠檬苦素和诺米林的积累与分布规律,研究类柠檬苦素生物合成的时空动态规律及遗传差异,寻找特异表现型的遗传种质资源。以茎段韧皮部、种子和叁个发育时期的叶片为材料,通过转录组测序、生物信息学和分子生物学等方法筛选和验证调控类柠檬苦素生物合成的候选基因。克隆与类柠檬苦素合成高度相关的角鲨烯合成酶基因(Ci SQS)和氧化角鲨烯合成酶基因(Ci OSC),并构建和利用转基因技术对Ci SQS和Ci OSC基因的功能进行分析,探讨Ci SQS和Ci OSC基因对柑橘类柠檬苦素生物合成的作用。主要结果如下:1.柚类果实中柠檬苦素和诺米林的时空分布。HPLC检测结果显示,果实完全成熟时,种子中的类柠檬苦素含量(柠檬苦素和诺米林的总含量)在1233.78~4090.41 mg/kg FW之间。ANOVA分析显示,12个柚子品种中的柠檬苦素和诺米林的总含量差异显着。以种子中的类柠檬苦素含量为参数进行聚类,12个品种可以分为叁类。类柠檬苦素含量最高的早熟暹罗蜜柚、勐仑早柚、宜安倭柚聚在一类,与来源于中国南方的9个柚品种有较大差异。表明类柠檬苦素的含量主要受遗传背景影响。当种子开始生理成熟时,诺米林和柠檬苦素的含量明显增加,说明种子的生理成熟是类柠檬苦素开始快速积累的关键节点。当果实转色至10%时,诺米林和柠檬苦素含量达到最大值。果实成熟后,从11月至次年1月,随着气温的下降,种子和囊衣中的柠檬苦素和诺米林含量基本呈现上升的趋势。2.类柠檬苦素生物合成相关基因的鉴定。利用东风早柚的种子(SII)、韧皮部(PII)和叁个发育时期的叶片(LI、LII、LIII)进行转录组测序,共得到14,551,995(LI)、13,302,783(LII)、14,900,160(LIII)、18,151,136(PII)和14,978,415(SII)个clean reads。根据类柠檬苦素的含量,以LI为参照,对转录组数据进行两两比对,差异基因数为2,086(LII VS LI)、4,082(LIII VS LI)、5,837(PII VS LI)和9,428(SII VS LI),这四组基因中共有的差异基因数为924个。Map Man软件分析发现,924个差异基因包含30类不同功能的基因。主要的功能分别为RNA调控、蛋白质修饰和降解、信号、细胞、次生代谢、激素代谢和细胞壁等。其中,有14个参与萜类物质的生物合成。利用MEV软件分析LII VS LI、LIII VS LI、LIII VS LII叁组叶片差异基因的表达模式,K-means聚类结果显示,叁种表达模式的基因(共382个基因)可能与类柠檬苦素的含量相关,其中只有Ci OSC基因参与萜类的生物合成。不同物种的OSCs聚类结果表明,Ci OSC分别与南瓜(Cucurbita pepo)和黄瓜(Cucumis sativus L.)中葫芦素生物合成途径的第一个关键基因CPQ和Bi聚在一起。qRT-PCR结果显示,Ci OSC基因在类柠檬苦素高含量的广西沙田柚、北碚447锦橙等柑橘的叶片中具有较高的表达水平,在低含量的滑皮金柑、融安金柑、旺苍皱皮柑、宫川温州蜜柑和丹娜香橼等柑橘中的表达量较低。Ci OSC基因的表达量与类柠檬苦素含量在早熟暹罗蜜柚和广西沙田柚的种子发育进程中具有极为相似的变化趋势,表明Ci OSC与类柠檬苦素的生物合成有高度相关性。因Ci OSC与合成类柠檬苦素所需的萜类物质的生物合成相关,据此推测,Ci OSC是处于类柠檬苦素生物合成途径上游的重要基因。另外,RNA-seq分析还鉴定出19个与类柠檬苦素生物合成相关的候选基因,主要包括5个转录因子、6个CYP450s、3个UGTs、1个乙酰转移酶基因、1个生长素响应蛋白、1个木葡聚糖内糖基转移酶和2个转运蛋白。这些基因的表达量随着种子的发育具有与类柠檬苦素含量变化类似的模式,CYP450基因家族的Ciclev10000886m、Ciclev10030087m、Ciclev10022473m和Ciclev10025448m基因与类柠檬苦素的含量达到显着相关水平,相关系数分别为0.995a、0.985b、0.958b和0.981b。MYB家族的Ciclev10021695m和生长素响应蛋白Ciclev10029650m基因也表现出显着相关性。随着种子的发育,叁个UGTs基因(Ciclev10020010m、Ciclev10015042m和Ciclev10001658m)的表达量在高含量的早熟暹罗蜜柚种子中与类柠檬苦素含量呈负相关,而在低含量的广西沙田柚种子中,其表达量与类柠檬苦素含量呈正相关。ABC家族的转运蛋白(Ciclev10011147m和Ciclev10003388m)的表达量与生长发育时期的种子中的类柠檬苦素含量具有较高的相关性,且在种子中特异表达,表明其可能参与类柠檬苦素的转运。3.CiSQS基因的结构、表达及与类柠檬苦素含量的关系。通过RACE技术克隆得到1813bp的Ci SQS基因全长c DNA序列,ORF分析发现,CDS区长度为1242 bp,编码413个氨基酸,预测的分子量为47.37 k Da。SQS基因在18个柑橘品种中高度保守,其c DNA序列有99%的相似度。对CDS区的SNP位点进行分析发现41个多态性位点,平均SNP突变频率为1个/329 bp。有26个同义突变和非同义突变引起了氨基酸的改变,靠近3’端的核苷酸突变分别引起小果罗浮终止子提前出现和融安金柑的CDS区变长。小果罗浮、融安金柑和4号宜昌橙在CDS区第14位碱基都发生了G/C同义突变。这叁个类柠檬苦素低含量的品种在进化树上聚在了同一类,与其它品种明显不同。结果表明,第14位核苷酸的区域可能与类柠檬苦素的含量有较为密切的关系。基因表达分析结果显示,不同柚子品种的种子中的Ci SQS基因表达水平与类柠檬苦素含量较一致,但在低含量的管溪蜜柚和坪山柚中基因的表达量反而较高。随着管溪蜜柚和坪山柚的种子发育,表现出与类柠檬苦素含量相似的变化模式,但在最低含量的坪山柚ST1时期种子中的基因表达量却为最高。表明Ci SQS基因的表达没有显示出和类柠檬苦素含量之间有显着相关性。利用qRT-PCR分析低温、Me JA、SA、GA3和Na Cl等非生物胁迫处理下的植株发现,低温能显着诱导CiSQS基因的表达。4.Ci SQS基因为类柠檬苦素生物合成的相关基因。构建了Ci SQS基因的植物过量表达载体p BI121GSH-SQSOE、干扰载体p GBi-SQSRNAi和p GBi-SQSRNAi-N。通过农杆菌浸染法转化锦橙上胚轴,得到3株SQSOE过表达植株和4株SQSRNAi-N干扰转基因植株。HPLC分析表明,3株SQSRNAi-N干扰植株叶片中的类柠檬苦素含量减少,为对照的72.24~95.12%。而Si N-3植株叶片中的柠檬苦素和诺米林总含量则上升,为对照的1.24倍。在所有Ci SQS干扰株系中,柠檬苦素含量减少最显着,为对照的35.83~81.56%。造成Si N-3植株中总含量增加的原因是由诺米林含量增加而引起,Si N-3和Si N-4株系叶片中的诺米林含量分别为对照的1.53倍和1.35倍。由于SQS是合成许多植物激素类物质前体的关键酶,因此基本得不到SQS完全沉默的转基因植株。在所获得的几株转基因植株中虽然发现Ci SQS的表达被部分沉默,并与类柠檬苦素的含量有一定相关性,但关系并不显着,说明Ci SQS对类柠檬苦素生物合成的影响较小,距类柠檬苦素生物合成途径有较远的距离。qRT-PCR结果表明,Nos弱启动子引起的Ci SQS基因沉默,4个植株的SQS表达水平都受到抑制,为对照的61%~79%。转基因株系中OSC类型的123βAS、195ATLUP2、330βAS、632βAS、951CAS1等基因的表达水平在大多数Si-N株系中都受到抑制,789ATLUP2、490CAMS1、602CAS1基因在大多数沉默植株中的表达量反而升高。结果表明,在Ci SQS干扰的株系中,不同类型的OSC基因可能存在竞争性抑制关系。3株过表达植株中仅有SOE-1正常生长,嫁接9个月后,SOE-2仅长出两片新叶,SOE-3仍保持嫁接时的状态。SOE-1叶片中的类柠檬苦素含量显着减少,为对照的68%。但SOE-1和SOE-2株系中的Ci SQS基因表达水平分别为对照1.45倍和1.31倍。在两株过表达植株中,不同类型的OSC基因表达水平出现既有上升也有下降的现象。进一步印证不同的OSC基因间可能存在竞争性抑制关系。与过表达株系出现植株发育不正常类似,Ca MV 35S启动子驱动的7个Ci SQS干扰株系出现叶片坏死、芽发育不正常,最后死亡。这些现象说明SQS与植物的一些重要代谢功能关系密切,对其进行调控易导致植物基本代谢的失调。5.柑橘TRV介导的VIGS系统的构建及基因沉默对Ci OSC基因的功能验证。从广西沙田柚中克隆到了沉默后能引起叶片出现光漂白现象的Ci CHll基因,将其作为标记基因构建到来自本生烟的TRV2病毒载体,首次构建了用于基因沉默的柑橘TRV介导的VIGS系统。在用含Ci CHll标记基因的菌液浸染柑橘植株第7天后(7 days post infiltration,7dpi),新叶出现光漂白现象;14 dpi时,大多数叶片都表现出Ci CHll完全沉默的特征;至27dpi,整株植株出现大面积的黄化,表明来源于柑橘的Ci CHll可以作为VIGS沉默的标记基因。用不同遗传背景的柑橘品种为材料,测试并优化了柑橘的VGIS沉默体系。墨西哥莱檬是最敏感的品种,黄化面积占叶面积的65.5%,广西沙田柚的敏感性较低,只表现出少量的光漂白现象。通过对浸染菌液的OD600值、浸染叶片的发育程度和使用的植物材料的发育时期等条件的试验优化。建立了能有效用于柑橘基因功能验证研究的VIGS系统。利用VIGS沉默广西沙田柚种子萌发的幼苗中的Ci OSC基因后发现,6株幼苗中的Ci OSC基因表达水平受到明显抑制,类柠檬苦素含量也显着减少,为对照的41.04~65.33%。2号株系中Ci OSC基因表达水平受到的抑制最显着,为对照的9.09%,柠檬苦素和诺米林含量分别为对照的35.08%和44.49%。表明Ci OSC基因能调控类柠檬苦素的生物合成,可能是类柠檬苦素生物合成途径上游的一个重要基因。
杨瑞仪[10]2009年在《青蒿素生物合成在天然及人工模拟环境中的转录调控机制研究》文中提出植物次生代谢产物是医药、化工、食品和农业高附加值产品的重要原料,其中萜类化合物是植物次生代谢产物的主要组成部分。抗疟药青蒿素及抗肿瘤药紫杉醇、长春花碱等都是着名的萜类药物,其碳链骨架都是通过细胞质或质体的异戊二烯途径合成的。目前,萜类生物合成途径的中间产物及其转变过程已基本阐明,但对萜类合成中基因表达调节的分子机制却了解甚少。为了建立萜类合成基因表达研究平台,本研究以菊科蒿属植物青蒿为模式,采用RTFQ-PCR技术及GUS报告基因表型显示工具,系统而全面地开展青蒿素及其相关萜类生物合成基因在天然及人工模拟环境中的转录调控机制研究。同时,在前期工作基础上,提出“~1O_2可能是青蒿素合成诱导剂”的假说,并通过实验予以证实。本研究的目的在于建立萜类合成代谢共同途径研究模型;构筑青蒿倍半萜青蒿素合成基因表达研究平台;阐明青蒿素合成诱导及时空调节机制;探索青蒿素高产的可行方法,其主要研究内容及其成果概括如下:①从青蒿中克隆了8种MVA及DXP途径基因(HMGR、FPS、DBR2、DXS、DXR、FS、CS、EPS)并测得全序列,其中DBR2基因序列为首次发表,已提交GenBank注册(登录号为EU848577),连同我们前期已克隆的ADS、CYP71AV1、CPR、SQS基因,为进一步开展青蒿功能基因组学研究及青蒿素高产代谢基因工程改良提供了丰富的素材。②采用自行设计的扩增引物,对青蒿中9种MVA及DXP途径基因(HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2、DXS、DXR、SQS)的发育特异表达动态进行了跟踪测定,发现相应的mRNA在青蒿中的水平以6月份相对较低,7月份后迅速提高,到8月份(临近开花前)达到顶峰,9月份(开花后)开始回落,其中ADS与CYP71AV1mRNA水平在7月份后更是出现爆发式增长,最高峰时分别为6月份的40倍和18倍。同时还发现,MVA及DXP途径的其他基因与青蒿素合成基因的发育表达模式基本一致,间接表明细胞质MVA途径及质体DXP途径可能共同参与青蒿素的生物合成。③在青蒿组织特异表达动态方面,处于盛花期的青蒿根、茎、叶、花中都能检测到ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2等青蒿素合成基因的表达,而且各基因表达量差异不显着,表明苗期至盛花期间的青蒿素合成基因表达无明显组织特异性。相反,在褐变的老叶中,青蒿素合成相关基因mRNA水平显着提高,其中CYP71AV1、ADS、DBR2mRNA的上升幅度最明显,分别是绿叶的51.2、25.5、14.8倍。相应地,老叶中的青蒿素含量也相应提高,最高约为绿叶的1.5倍,从而首次发现青蒿素合成基因表达与青蒿素的积累可能受生长发育程序尤其是衰老进程的直接调控。由于老叶比绿叶释放更多的~1O_2,推测~1O_2直接参与了青蒿素合成基因表达的调控及青蒿素前体向青蒿素的非酶促转变,因而它可能是衰老过程能促进青蒿素大量合成与积累的主要原因。④在转基因烟草ADSP-GUS融合系统中,根、茎、叶中都能检测到GUS活性,表明ADS启动子驱动GUS报告基因的基础表达,在转录调控上无明显组织特异性。GUS定量检测结果显示,在低温(4℃)及紫外辐射条件下,GUS活性分别提高2.2倍和1.6倍,提示ADS基因受极端环境胁迫的诱导调控,对诱导~1O_2生成的胁迫条件(如低温、紫外辐射等)高度响应。逆境诱导报告基因表型显示平台的成功建立,为进一步高通量筛选青蒿素合成基因高效表达诱导剂提供了极大方便。⑤利用RTFQ-PCR技术分析了青蒿素生物合成相关基因在低温(4℃)、高温(50℃)、紫外辐射、淹水或复水(缺氧)、脱水(干旱)、NaCl(高盐)、真菌诱激(添加酵母提取物)、信号分子刺激(SA、MJ、GA_3、ABA)等12种诱生~1O_2的人工模拟环境中的转录模式。结果显示,在低温与紫外辐射条件下,青蒿素生物合成途径(包括共同途径与特异途径)的基因表达水平普遍上升;ADS和DBR2对于环境胁迫的响应更为明显:ADS在冷、紫外辐射、脱水、添加酵母提取物处理条件下的转录水平分别是对照的35.6、14.2、15.5、5.5倍,DBR2在淹水、复水、添加酵母提取物处理条件下的转录水平分别是对照的1 3.8、38.2和20.7倍。由于上述氧化胁迫条件均能导致~1O_2释放,因而本研究在成功模拟包括天然衰老过程在内的氧化胁迫条件的基础上,首次揭示了青蒿素合成基因受氧化胁迫尤其是~1O_2诱导的分子机理。⑥对本实验室首次克隆的7种青蒿新EST——过氧化物酶1基因(POD1)、几丁质酶基因(CH1)、钙调素基因(CaM)、泛素结合酶基因(UCE)、干旱/低温及盐响应蛋白基因(D/LTSRP)、富含甘氨酸RNA结合蛋白基因(RGP)和生长素阻遏/休眠相关蛋白基因(AR/DAP)的低温诱导表达模式进行了定量分析。结果显示,经过4℃处理48h以后,D/LTSRP、UCE、CaM、AR/DAP、POD1基因的mRNA水平分别为对照的7.5、5.0、2.6、2.3、1.5倍,提示这些基因可能参与了青蒿低温信号启动与转导的网络调控,从而为进一步阐明青蒿素生物合成的信号转导通路及其级联调节网络提供了线索。⑦对细胞质与质体萜类合成途径受到抑制后的基因表达定量分析显示,MVA与DXP两条途径表现互为补偿的机制,添加DXP途径抑制剂(磷甘霉素)后,DXP途径基因表达出现先抑制后恢复,而MVA途径基因表达则呈现先上升后回落的趋势;添加MVA途径抑制剂(洛伐他汀)后,两条途径的基因表达均被抑制,进一步表明不同的亚细胞空间(细胞质和质体)在萜类合成过程中存在着交叉对话,再次证实MVA与DXP途径都参与了青蒿素的生物合成。咪康唑对类固醇合成的抑制显示,青蒿素合成基因ADS和DBR2的表达分别提高了2倍和5倍,表明对青蒿素合成竞争途径的抑制可调节MVA途径不同分支中碳源的流向,使细胞代谢向合成青蒿素的方向移动。⑧对转asSQS基因青蒿株中SQS基因及其他倍半萜合酶基因的表达变化研究表明,在转基因株中,SQS基因的表达受到明显抑制,为非转基因的0.5-0.12倍,有2株转基因株中的ADS基因表达提高3.5和3倍。经过4℃间歇冷处理后,非转基因与转基因株中的SQS基因表达不受影响,ADS与EPS基因的表达水平上调1.5-5倍,FS基因表达基本维持不变,CS基因的表达量下降,下降幅度约为50-100倍。再次证明青蒿中萜类合成具有网络调控特性,在“节流”与“引流”的双重作用下更有利于吸引碳源流向青蒿素合成途径。本研究的创新性在于首次从转录水平上开展了包括青蒿素合成基因在内的青蒿萜类代谢调控研究,为其他萜类(如紫杉醇、长春花碱等)的后续功能基因组学及代谢途径工程研究提供了模式,有关青蒿萜类基因表达及其调控的研究结果国内外均无报道。其次,通过对青蒿素合成基因的时间及空间表达动态的跟踪测定,初步揭示了青蒿素合成基因表达的发育及组织特异调节机制,首次发现青蒿素合成基因表达受衰老程序控制的规律,证实衰老过程中产生的过量~1O_2可能是诱导青蒿素合成基因高效表达及促进青蒿素高产的主要原因。在此基础上,利用各种环境胁迫条件模拟~O_2的释放,阐明了青蒿素合成基因的环境诱导表达及其调节机制,从而经由实验直接验证了“~1O_2是青蒿素合成诱导剂”的假说,并进一步指明青蒿素可能是其前体(双氢青蒿酸)清除~1O_2后生成的副产品。
参考文献：
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[2]. 青蒿素生物合成相关基因的克隆、大肠杆菌表达与分子分析[D]. 刘彦. 中国科学院研究生院（植物研究所）. 2002
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[5]. Fostriecin生物合成基因簇的异源表达研究[D]. 苏春. 大连理工大学. 2012
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[8]. AP2/ERF转录因子调控丹参活性成分生物合成的功能研究[D]. 吕海舟. 北京协和医学院. 2017
[9]. 柑橘类柠檬苦素生物合成相关基因的鉴定与功能验证[D]. 王福生. 西南大学. 2016
[10]. 青蒿素生物合成在天然及人工模拟环境中的转录调控机制研究[D]. 杨瑞仪. 广州中医药大学. 2009