宫晓静1 万玲琴1 王义善1,2(通讯作者)
(1.滨州医学院附属烟台解放军107医院 山东 烟台 264003)
(2.解放军第107医院国家中西医结合肿瘤治疗重点专科 山东 烟台 264002)
【摘 要】目的:探讨黑蒜提取液(aged black garlic extract,ABGE)对人胰腺癌Panc-1细胞生长与运动迁移的影响。方法:将不同浓度的ABGE(0.2,,0.6,1.0,1.4,1.8mg/ml)作用于胰腺癌Panc-1细胞,采用CCK-8法分别于24h、48h、72h测定Panc-1细胞株的生长增殖活性;RT-PCR检测ABGE干预后Panc-1细胞TGF-β1、Smad4mRNA以及MMP-2mRNA表达变化;Transwell小室基底膜侵袭实验检测ABGE干预后Panc-1细胞的运动迁移能力。结果:CCK-8结果显示,黑蒜提取液对Panc-1细胞株的生长活性具有明显的抑制作用,且具有时间剂量依赖关系;RT-PCR结果显示,黑蒜提取液能明显地上调TGF-β1、Smad4mRNA以及下调MMP-9mRNA的表达;Transwell实验结果显示黑蒜提取液能够显著抑制胰腺癌Panc-1细胞在体内的生长增殖与运动迁移能力。结论:黑蒜提取液抑制Panc-1细胞的生长与运动能力,可能是其干预Panc-1细胞的TGF-β1/Smad4信号通路有关。
【关键词】黑蒜提取液;胰腺癌;TGF-β1/Smad4蛋白;TGF-β1/Smad4信号通路
【中图分类号】R735.9 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028(2015)8-0661-02
Effects of aged black garlic extract on pancreatic cancer -1 cell growth and tranfer in vitro
Gong Xiao-jing1,Wan Ling-qin1,Wang Yi-shan2
(1Binzhou Medical University affiliated Yantai, the people's liberation army 107 hospital,Yantai,264003)
(2Yantai, the people's liberation army 107 hospital,Yantai,264002)
【Abstract】 Objective:To explore Effects of aged black garlic extract(ABEG) on pancreatic cancer -1 cell growth and tranfer in vitro.Methods:ABEG was extracted and then different concenteations of ABEG(0.2,0.6,1.0,1.4,1.8mg/ml) acted as Panc-1, the growth activity of Panc-1 was detected by CCK-8 in 24h,48h,72h;and the TGF-β1、Smad4mRNA and MMP-2mRNA protein expression of Panc-1 was detected by Realtime-PCR; the movement tranfer ability of Panc-1 was detected by Transwell.Results:CCK-8 test showed that ABEG had the inhibitory effect on Panc-1 and a time-dose-dependent manner;Reaitime-PCR test showed that ABEG could obvious up-regulate TGF-β1 and smad4 protein expression and down-regulate MMP-9 protein expression;Transwell test showed that ABEG could obvious inhibition the ability of movement of Panc-1.Conclusion:ged black garlic extract on pancreatic cancer -1 cell growth and tranfer,maybe because ABEG could interfere TGF-β1/Smad4 signaling pathway.
【Key words】Aged black garlic extract;Pancreatic cancer;TGF-β1/Samd4 protein;TGF-β1/Samd4 signaling pathway
Fund assistant:The Science and Technology Projects Fund of the Army(No.06G034)
胰腺癌是目前严重影响人类身心健康的一种消化道恶性肿瘤[1],有研究5年的生存率仅为3%~5%[2]。胰腺癌的恶性程度高、进展变化快、侵袭力较强、并且85%的患者在发现时已发生远处或局部转移,仅有少部分患者有手术的机会。而对于不能手术的患者目前主要的治疗手段仍以放化疗为主。但是由于胰腺癌患者容易出现化疗耐药,所以治疗效果欠佳。因此,能够研发一种提高胰腺癌疗效的药物,有重要的意义。以往研究表明,胰腺癌在发生早期转移中TGF-β1/Smad4信号通路发挥着重要的转导作用,在癌细胞中表达均下调。黑蒜(Black Garlic)取材于生大蒜去皮采用特殊加工经过酵素激活、中温发酵以及高温熟成等过程而成的。因此过程之后其表面呈黑色所以称为黑蒜。研究报道称,黑蒜有保护N-亚硝胺氧化损伤,抑制亚硝胺合成、抗氧化、促肿瘤细胞凋亡以及提高机体免疫力的作用[3],对胰腺癌、肝癌、胃癌等具有明显的肿瘤抑制作用[4,5],但是目前黑蒜对胰腺癌在体内的生长以及运动的影响未见报道。本研究中,通过在体外培养的胰腺癌Panc-1细胞株为研究对象,观察黑蒜对肿瘤细胞的生长增殖、运动迁移能力以及Smad4蛋白表达的影响,探讨黑蒜抗肿瘤生长和迁移运动的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器
黑蒜由大连华谷蒜业有限公司提供;DMEM高糖培养基、已灭活胎牛血清:美国Hyclone公司;胰蛋白酶(trypsin):Amersco公司;DMSO:安徽安特化工有限公司;CCK-8试剂:碧云天生物公司;Transwell小室:Costar公司;RNAiso Plus:大连TaKaRa公司;反转录试剂盒:大连TaKaRa公司;Realtime- PCR试剂盒:大连TaKaRa公司;Smad4单克隆抗体、MMP-2、P21单克隆抗体:Sigma公司;旋转蒸发仪:上海越众仪器设备有限公司;全自动酶标仪:Biotek公司;3111型二氧化碳培养箱:Thermo公司;显微镜、荧光显微镜:上海东星建材实验设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人胰腺癌Panc-1细胞株购自中科院上海细胞库,将胰腺癌Panc-1细胞培养 于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基中,于37℃、5%的CO2的恒温培养箱中常规无菌培养,保持细胞单层贴壁生长,生长至80%~90%融合时将细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后传代,取对数生长期的细胞做后续实验。
1.2.2 黑蒜提取液的制备
称取并捣碎100g果脯膏状黑蒜瓣成酱,常温下加1000mL的95%的乙醇搅拌均匀并浸泡24h,后数控超声波清洗器清洗30min,真空过滤(重复),在47℃温度下采用旋转蒸发仪浓缩至50mL,0.9%的生理盐水采用1:1的比例将其混匀(相当于生药1g/mL),0.22μm滤膜过滤除菌,制备成黑蒜提取液,4℃储存用于后续实验。
1.2.3 CCK-8法检测Panc-1细胞体外生长增殖活性
选取对数生长期Panc-1细胞,轻轻反复吹打细胞悬液使之均匀后,以DMEM培养基调整细胞浓度至5×104/mL,轻轻反复吹打细胞悬液使之均匀后,加入96孔培养板中,每孔加入细胞悬液100μL,每组设3个复孔,同时设置空白对照组(0.1%DMSO),培养箱中培养24h后细胞贴壁后,吸弃培养液,加入含有不同浓度的黑蒜提取液的DMEM培养基,使其终浓度分别为 0.2,0.6,1.0,1.4,1.8mg/ml,后继续培养24h、48h、72h后取出培养板,每孔再加入10μLCCK-8试剂,继续培养4h后,,用酶标仪在450nm处测定每个孔的吸光度值(A值),计算细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。用SPSS13.0统计软件分析处理。
1.2.4 RT-PCR检测黑蒜提取液TGF-β1、Smad4mRNA以及MMP-9mRNA的表达活性
细胞以1.0×105个/mL的密度接种于25mL培养瓶中,于37℃培养箱中无菌培养24h,待细胞贴壁之后,选取0.2,1.0,1.8mg/ml的黑蒜提取液浓度作用于细胞,24h后收集对数生长期细胞,并设最终浓度0.1%DMSO浓度为对照组,RNAiso Plus提取总RNA,核酸分析仪检测RNA纯度,OD260/OD280在1.9-2.1之间,纯度较好,逆转录成cDNA后进行PCR反应。引物有青岛生物工程有限公司合成TGF-β1mRNA上游引物序列为:5,-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3,,下游引物序列为:5,-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3,。Smad4mRNA上游引物序列为:5,-TCAGCCAGCTACTTACCACCA-3,,下游引物序列为5,-ACACGTCCCCTTCACCTTTAC-3,。MMP-9mRNA上游引物序列为:5,-CTGGCGTGTGAGTTTCCAA-3,,下游引物序列为5,-CGGTTGAAGCAAAGAAGGAG-3,。反应体系的配制:SYBR Premix Ex Tap(2×)10μL、PCR Reverse Primer(10μmol/L)0.8μL、DNA模板2.0μL以及dH2O7.2μL共20μL液体混匀,置于Real time-PCR扩增仪中,按照Real time-PCR反应程序:95℃ 30s;PCR反应95℃ 5s,60℃ 20s,40Cycles;溶解曲线分析基因改变。
1.2.5 Transwell小室试验检测细胞的运动迁移能力
采用孔径8μm的24孔小室,将PVPF滤膜贴于Transwell小室中,滤膜的外表面涂FN5μg,内表面涂Matrigel 10μg,室温过夜干燥,制作成人工基底膜。消化提前以0.2mg/ml、1.0mg/ml、1.8mg/ml浓度的黑蒜提取液处理的24h的PANC-1细胞,并设对照组,用含体积分数10% FBS的DMEM培养基重悬细胞,调整细胞浓度,上室中加入2×105个细胞,接种细胞匀液总体积100μl;下室中加入体积分数为10%FBS的DMEM无血清培养基600μl。37℃培养箱内孵育4h,200倍荧光显微镜下随机选择5个视野进行观察,计数每个视野穿膜细胞数,实验重复3次,取平均值作为穿过人工基底膜的细胞数量。
1.2.6 统计学方法
采用SPSS 13.0软件分析数据,各实验重复3次,两样本比较采用t检验,样本均数比较采用均数±标准差( ±s)表示。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 CCK-8实验结果
黑蒜提取液对Panc-1细胞的生长增殖具有明显的抑制作用,同一时间段各个剂量组之间以及同一剂量组在不同的时间段比较差异具有显著性(P<0.05),呈现出明显的剂量和时间依赖性,见表1、图1:
4 讨论
胰腺癌在当今任然是危害人类健康的一种常见的恶性消化道肿瘤之一,研究表明近年来在我国发病率呈明显上升趋势,5年生存率低于5%[6]。由于胰腺癌的特殊结构,最易发生远处转移,并且在早期很难确诊,因此大多数患者确诊时已经处于晚期,错失了最佳治疗时期,无疑增加了手术的难度,提示预后也不良。胰腺癌对放化疗都不敏感,而研究中医中药以及相关肿瘤信号通路联合治疗,提高胰腺癌治疗效果成为亟待解决的问题。
黑蒜,是普通大蒜经过一系列的酶促反应发酵加工而成的,不仅没有失去原有大蒜的作用功效,反而是其中含有的有效成分大蒜素得到了有效地发挥,使其作用更加稳定,保存时间延长。而早在多年以前,大蒜素因其具有杀菌、消炎、抗氧化以及抗肿瘤的作用已经被广泛的开发利用,尤其是在抗肿瘤方面。研究也证实大蒜素能够引起肿瘤细胞周期阻滞,抗氧化以及阻止肿瘤细胞的生长转移[7]。本实验中以黑蒜提取液为研究对象,探讨了黑蒜提取液对胰腺癌Panc-1细胞中的TGF-β1/Smad4信号通路的作用机制。
在肿瘤的发生发展过程中,癌基因的激活以及抑癌基因的失活或者受到抑制起着重要的作用,而细胞增殖和转移信号通路起着关键的作用[8]。TGF-β1信号通路的调控机制非常复杂,有多条信号转导通路完成,而其中的Smad4蛋白尤为关键。TGF-β1/Smad4信号通路参与细胞的的多种基因调控,Smad4蛋白是此通路中关键转录因子,有研究证实Smad4是一种新型的一种抑癌基因[9]。而一旦Smad4蛋白缺失,将会导致整个信号通路甚至整个细胞代谢发生紊乱,最终形成肿瘤[10]。同时TGF-β1/Smad4信号通路有研究还对基质金属蛋白酶类(MMP-2、MMP-9),尤其是MMP-9有明显的抑制作用,可以减少细胞外基质的降解,从而降低细胞的运动。因此TGF-β1/Smad4信号通路对于肿瘤的发生发展尤其是生长转移极其重要[11]。
本实验采用CCK-9法检测黑蒜提取液对胰腺癌Panc-1细胞生长活力的影响,结果显示黑蒜提取液可以显著的抑制Panc-1细胞的生长增殖能力(P<0.05),并且能够下调TGF-β1mRNA、Smad4mRNA以及MMP-9mRNA的表达,同时能够明显的降低细胞的穿膜数量,降低细胞的转移迁移能力。综上,本实验的结果显示黑蒜提取液抑制胰腺癌Panc-1细胞生长与迁移能力可能是与其抑制干预TGF-β1/Smad4信号转动通路的活化有关,其进一步的作用机制仍值得深入探讨。
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作者简介:
宫晓静,女,研究生。专业中西医结合临床,
基金资助:
全军科技攻关项目(No.06G034)
论文作者:宫晓静1,万玲琴1,王义善1,2(通讯作者)
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月
论文发表时间:2016/6/1
标签:细胞论文; 胰腺癌论文; 肿瘤论文; 提取液论文; 生长论文; 信号论文; 作用论文; 《河南中医》2015年8月论文;