樊一笋[1]2004年在《两株功能阻断型CD154单克隆抗体的生物学特性及其应用研究》文中认为1970年，Brestcher和Cohn首先提出并证实T细胞活化的双信号学说。当T细胞通过其抗原受体和CD3复合体识别抗原递呈细胞表达的MHC-抗原复合物并与之发生特异性结合后，获得T细胞活化所需的抗原特异性信号(第一信号)。而T细胞还必须获得其与APC表面的多对膜分子的相互作用所产生的非抗原特异性、非MHC限制性的共刺激信号(协同刺激信号或第二信号)才能有效活化、增殖和产生相应的生物效应。如果仅有抗原特异性信号而共刺激信号缺失，T细胞则表现为无反应状态或免疫耐受，甚至引起凋亡。 近年来分子生物学技术广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。CD154(CD40L、gp39、TRAP、TBAM)是分子量为33kDa的Ⅱ型跨膜糖蛋白，其基因定位于Xq26.3-27.1。人全长CD154的cDNA编码含261个氨基酸残基的多肽链，其氨基末端由22个氨基酸残基组成CD154的胞浆区，跨膜区含24个氨基酸残基，羧基端216个氨基酸残基组成含5个半胱氨酸的胞外区。CD154胞外区蛋白质的叁维构象与TNF-α和LT-α折叠方式相似，因此属TNF超家族成员。CD154主要表达在活化的CD4~+T细胞和活化的血小板表面。此外，肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞均能表达CD154。CD154的表达受到严格调控，其特征是瞬时性。CD40-CD154相互作用的数分钟至1小时内，膜型CD154被蛋白质两株功能阻断型CD154单克隆抗体的生物学特性及其应用研究中文摘要水解形成可溶性CD巧4。 其受体CD40，是分子量为50kDa的细胞膜分子，属I型跨膜糖蛋白，为INFR超家族成员。CD40表达于多种细胞表面，包括树突状细胞、所有发育和分化阶段的B细胞、内皮细胞、胸腺上皮细胞、造血前体细胞及某些肿瘤细胞。 CD40一CD154信号传导在不同细胞可产生截然不同的效应，可为正性调节即导致细胞增殖或分化;也可为负性调节，即导致细胞生长抑制和/或凋亡。研究表明:CD40一CD154信号参与B细胞的发育、增殖和分化;浆细胞的形成;抗体的合成、分泌和类型转换;记忆性B细胞的形成;生发中心的形成和维持;树突状细胞的激发、分化和成熟;T淋巴细胞的分化、活化和增殖;记忆性T细胞的形成;内皮细胞粘附分子的改变;炎症因子的释放;白细胞在炎症部位的聚集等，是近年来倍受关注的细胞分子。 越来越多的研究表明，CD40一CD154信号在自身免疫中发挥重要作用。在几种自身免疫病动物模型(狼疮肾炎、自身免疫性糖尿病、系统红斑狼疮、胶原诱导的关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化症等)的实验研究中发现，给予阻断型anti一CD 1 54 mAb，均能不同程度地减少自身抗体或自身反应性T细胞的产生，缓解症状，延迟病程发展。研究发现，系统红斑狼疮患者与健康人比较，其外周血T淋巴细胞的表面分子如CD154和MHC一11等表达异常，血清sCD154水平增高，’肾脏组织有CD巧4-+细胞浸润。由此推测CD40一CD巧4信号是自身免疫反应的重要参与者。 数十年来，由于组织配型技术、器官保存技术和外科手术方法的不断改进，以及高效免疫抑制剂的陆续问世，器官移植的应用范围日趋扩大，移植存活率不断提高，器官移植已成为治疗多种疾病的有效手断。但移植排斥一直是同种组织和器官移植所面临的主要问题。在临床诸多克服移植排斥反应的方案中，免疫抑制剂的疗效最为确切。目前，特异性免疫抑制剂的开发研制是移植免疫的研究热点。 鉴于CD40一cD 154信号在细胞免疫和体液免疫中所发挥的重要作用，应用阻断型anti一cD154 11飞Ab阻断cD40一cD154信号控制移植排斥反应的研究越来越深入。动物移植模型实验证实，anti一CD154 n1Ab在皮肤、心脏、胰腺以及骨髓 II两株功能阻断型CD154单克隆抗体的生物学特性及其应用研究中文摘要移植中，均能有效地抑制移植排斥反应，延长移植物的寿命。CD40或CD154敲基因小鼠的移植模型亦证实，缺少了CD40一CD 154信号，移植排斥反应明显减弱。1999年，儿rk等将人源化的anti一CD154 mAb应用于rhrsus猴的肾移植取得成功。所有这些结果都为移植排斥的干预和移植耐受的诱导开辟了新途径。 本实验在成功获得两株能稳定分泌功能性鼠抗人CD154单克隆抗体的杂交瘤细胞株一一IBI和4FI的工作基础上，旨在进行如下研究: 第一部分Anti一CD154 mAb IBI和4FI在体外同种反应中的生物学特性研究 一、CD4+T细胞对同种抗原低反应性和特异性免疫耐受的诱导 移植排斥体外基础研究的主要方法之一是混合淋巴细胞反应(MLR)。MLR是来源于不同个体的淋巴细胞在体外混合培养，供体细胞表面HLA一11类抗原以及表达的共刺激分子可活化受体T淋巴细胞，活化的T淋巴细胞发生分化、增殖并产生相应的生物学效应。 本研究应用anti一CD154mAb IBI和4FI阻断MLR中CD40一CD154信号，通过检测培养上清的细胞因子(IL一2、IFN一帕水平、cD4+T淋巴细胞的增殖及其表型变化等指标，从而观察IBI和4FI阻断CD40一CD154信号在介导同种抗原的低反应性和诱导
汤琳[2]2007年在《鼠抗人CD40突变体单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究》文中研究指明CD40是分子量为45～50KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,表达于多种抗原递呈细胞、内皮细胞、上皮细胞、造血前体细胞、成纤维细胞以及某些肿瘤细胞。通过单克隆抗体激发CD40分子不仅可以直接作用于表达CD40分子的肿瘤细胞,其介导的信号还可在多个环节影响肿瘤发生、发展,如调控细胞增殖/凋亡,增强其它治疗手段的敏感性,此外还能通过调节适应性和固有免疫应答而起到抗肿瘤作用。然而由于CD40在体内正常组织的广泛表达,叁株抗人CD40单抗虽然已进入美国临床前期试验,但其存在的副作用和安全性问题仍引起高度关注。本科室以往的研究发现一些肿瘤细胞株和新鲜肿瘤细胞表达CD40突变体(CD40mu)(CAC→CAA,78His→78Gln) (NCBI Assay Id: ss23134804,Reference SNP Id:rs17177493),该突变位点位于CD40胞外段第二个富含半胱氨酸的区域,这一区域是CD40与CD40L(CD154)相互作用的重要区域。基因转染细胞的构建进一步证实了该突变体与抗体的结合能力与野生型CD40截然不同,CD40mu胞外段一个氨基酸的突变可导致局部结构改变而形成新的抗原表位,该抗原表位为CD40mu所特有,CD40mu在肿瘤中的表达特点和生物学意义以及单抗激发CD40mu对肿瘤细胞生物学行为的影响有待进一步研究。1.分泌鼠抗人CD40mu单抗的杂交瘤细胞株的制备利用已成功构建的基因转染细胞L929/CD40mu为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞融合技术,将反复免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,以突变体基因转染细胞L929/CD40mu为阳性筛选细胞,以野生型CD40基因转染细胞L929/CD40wt为阴性筛选细胞,通过间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞株进行筛选,经多次克隆化培养,最终获得四株持续、稳定分泌鼠抗人CD40mu单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3G5、5H6、3B9和2B6,前叁株抗体的重链为IgG1,2B6的重链为IgG2a,轻链均为κ链。四株抗体均可用于免疫组织化学分析,其中3G5和2B6可用于Western-blot检测。杂交瘤细胞株经体外连续传代(40代)培养,液氮冻存半年后复苏,仍生长良好,稳定分泌抗体。2.鼠抗人CD40mu单克隆抗体的体外生物学特性研究运用成功制备的单抗检测发现,部分恶性B细胞株及上皮性肿瘤细胞株表达CD40mu,其在新鲜肿瘤组织中也有高水平的表达。四株抗体识别的抗原位点不同,对细胞株的识别谱也不相同。继而采用抗CD40mu单抗对表达CD40mu的人卵巢癌细胞株HO8910和人白血病细胞株K562细胞的体外实验初步表明,单抗2B6能够促进HO8910细胞和K562细胞的生长,促使HO8910细胞进入S期的比例增加和细胞因子IL-6的分泌,而另一株单抗3G5则能够诱导表达CD40mu分子的细胞株HO8910细胞凋亡。综上所述,本研究成功制备了四株特异性鼠抗人CD40mu单克隆抗体,并初步探讨了CD40mu在肿瘤中的表达及其生物学意义,证实了肿瘤细胞表达突变的CD40分子;不同的单抗激发表达该突变体的肿瘤细胞后引起的生物学效应也不同,或促进细胞增殖或诱导其凋亡。这些特异性抗体的获得为深入探讨肿瘤细胞表达CD40mu分子的生物学意义提供了物质基础,也为靶向CD40mu的肿瘤生物治疗提供了新思路。
杨明峰[3]2006年在《人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单克隆抗体的研制》文中认为人LIGHT(TNFSF14)属于TNF超家族成员，为Ⅱ型跨膜糖蛋白，编码240个氨基酸。原位杂交实验发现人LIGHT定位于19p13.3，与CD27L，4-1BBL，C3相邻。LIGHT与LTB和FasL分别有34％和31％的同源性，而且LIGHT与LTαβ异源三聚体结合同一个受体LTβR，与LTα结合同一个受体HVEM，与FasL结合同一个受体DcR3。LIGHT主要表达在活化T细胞和未成熟DC，其mRNA在脾脏细胞、活化的PBL、CD8~+肿瘤浸润淋巴细胞、粒细胞和单核细胞均有高表达，但不表达于胸腺组织。一些研究结果表明，LIGHT可以促进肿瘤细胞凋亡，也可以促进淋巴细胞细胞活化，这都依赖于靶细胞表达的受体。研究显示，LIGHT是不依赖于CD28的可诱导型表达的共刺激分子，可有效地协同CD3信号促进T细胞的增殖，同时它也可以促进DC成熟，提高DC对抗原的提呈能力；体外实验发现，可溶性LIGHT分子可使一些恶性肿瘤生长减缓甚至可以诱导细胞凋亡。因此，可溶性和膜型LIGHT与其受体形成的信号网络在免疫应答和抗肿瘤免疫中有重要的作用。 1 人LIGHT基因的克隆 采用RT-PCR的方法，从活化T细胞中克隆得到了人LIGHT的cDNA，将其装入克隆载体pMD18-T，得重组载体pMD18-T/LIGHT，酶切、PCR和测序鉴定正确。由此，为人LIGHT基因转染细胞的构建奠定了物质基础。 2 人LIGHT基因转染细胞的构建 通过基因克隆技术，将人LIGHT全长的cDNA片段插入逆转录病毒载体pEGZ-HA-Term。测序正确后，通过脂质体转染技术将重组表达载体(pEGZ-HA-Term/LIGHT)与辅助病毒载体共转染包装细胞293T，用其培养上清感染L929细胞72h后，经Zeocin筛选出稳定表达LIGHT分子的L929细胞株(L929/LIGHT)。经体外长期传代和液氮反复冻存复苏，基因转染细胞生长良好，LIGHT的表达稳定在95％
戚春建[4]2006年在《CD40L/CD40及CD40突变体在人多发性骨髓瘤中的表达及其生物学意义》文中进行了进一步梳理多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是源于浆细胞的恶性肿瘤，是常见的血液系统疾病，最突出的病变是骨髓浆细胞大量增生，可占骨髓内细胞总数的15％～90％，常引起多处骨组织破坏，可累及骨骼系统的任何部位。疾病晚期，瘤细胞可浸润软组织，以至侵犯脾、肝、肺和淋巴结等。目前认为，MM的发生发展除了与细胞增殖失控和细胞分化异常有关外，还有一个重要的原因是发生转化的细胞不能正常凋亡。 CD40分子是分子量为50kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，成熟的CD40分子含有277个氨基酸，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，表达于多种抗原递呈细胞(B细胞，树突状细胞，巨噬细胞等)、内皮细胞以及某些肿瘤细胞表面。业已表明，CD40分子可异常表达于人多发性骨髓瘤细胞，CD40信号参与多发性骨髓瘤细胞生长的IL-6产生，但确切的生物学意义尚待阐明。在体内，T细胞表面的T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合物(MHC)结合提供第一信号，这时T细胞表面瞬时表达CD40配体(CD40L)，CD40L与CD40结合，上调APC表面的B7、LFA-3、ICAM-1等分子，这些分子给T细胞提供第二信号，激活T细胞，增大免疫应答能力。在体外实验中已证实，CD40的配基化可以促使B细胞增殖、分化、Ig的分泌和类型转换，一个单一的分子如何能介导如此多样的生物学效应，这引起了人们广泛的兴趣。近几年的研究发现，CD40分子在各种不同的细胞上呈异质性表达，CD40分子通过配基化和交联可以传递不同的生物学信号，产生不同的生物学功能。 CD40分子的胞浆段只有62个氨基酸，没有激酶活性，它主要通过肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)传递信号，TRAFs是近几年发现的与TNFR家族胞浆段直接接触的接头蛋白(adapter)，在TNF／TNFR家族成员与其下游信号传导中起着重要作用。包括TRAF1～6六个成员，它们都有一个保守的C末端，大约有150个氨基
明志君[5]2006年在《鼠抗人PD-1单克隆抗体的研制及其生物学功能研究》文中研究指明T、B淋巴细胞在机体免疫应答过程中需要两种信号的协同作用。第一信号为抗原与T细胞受体TCR的结合，第二信号为抗原递呈细胞上的协同刺激分子与T、B淋巴细胞上的受体结合。PD-1为T、B淋巴细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量约为50～55kD。在T、B细胞抗原受体激发后呈诱导性表达，也可表达于活化后的T、B细胞、单核细胞和髓系细胞，在胸腺及骨髓发育的特定阶段也可表达PD-1。PD-1与其两个配体PD-L1和PD-L2结合，在免疫应答中起着负性调控作用。为更好地了解PD-1分子在免疫调节中的作用，探讨PD-1作用的分子机制，本研究扩增了人PD-1基因，构建了重组逆转录病毒载体，筛选获得了能稳定高表达人PD-1分子的L929基因转染细胞，制备了抗人PD-1单克隆抗体，并对其生物学特性及对T细胞的影响进行了初步探讨。为进一步研究PD-1／PD-L信号在免疫调节中的作用，在临床肿瘤免疫、自身免疫性疾病以及移植免疫等疾病中的免疫干预，提供了实验基础和理论依据。 1、人PD-1 基因的扩增、在基因转染细胞PD-1／L929上的表达及其生物学功能的研究。采用PCR的方法，突变人PD-1全长基因的PstI位点，从本室构建的重组质粒pGEX-5X-3-PD-1中扩增出PD-1基因，并构建含PD-1基因的重组逆转录病毒载体，最终转染L929细胞，成功构建了稳定高表达PD-1分子的基因转染细胞株PD-1／L929，并探讨了PD-1／L929基因转染细胞对Mo-DC成熟的影响。结果显示，PD-1基因转染细胞可以促进DC的成熟，上调CD80和CD83的表达，但对CD86的作用不明显。此实验提示，PD-1／L929细胞可通过Mo-DC上的PD-L1分子产生逆向信号，从而介导生物学效应。 2、鼠抗人PD-1单抗的研制及其生物学特性研究。应用高表达人PD-1分子的PD-1／L929细胞为免疫原，常规方案免疫6～8周龄BALB／c小鼠。激发免疫后，将小鼠的脾脏细胞与小鼠SP2／0在PEG下融合，杂交瘤细胞经HAT选择培养获得。继而以PD-1／L929为筛选细胞，采用间接免疫荧光试验法，经流式细胞仪检测杂交瘤的培养上清中抗PD-1抗体的分泌。阳性克隆经有限稀释法多次亚克隆，至所有培养孔中的杂交瘤上清为阳性。实验先后共融合80块96孔板，筛选后最终获取2株持
施勤[6]2003年在《共刺激分子CD40/CD40L和OX40/OX40L在乳腺癌中的表达及其生物学意义》文中提出TNF／TNFR超家族成员中的CD40／CD40L、OX40／OX40L分子因其在特异性免疫应答中的重要作用和与疾病的密切关系而备受瞩目，成为免疫学中的热点研究领域。本课题以乳腺癌为研究对象，探讨CD40、OX40、OX40L等相关分子在乳腺癌细胞上的表达及其临床意义，并在体外以rhCD40L为激动剂研究CD40信号对乳腺癌细胞株生物学行为的影响，为临床的运用提供实验依据和理论基础；并对OX40L进行了基因克隆、表达和生物学特性研究，为研制具有自身知识产权的鼠抗人单克隆抗体和开展相关研究提供了实验手段。一、CD40及相关分子在乳腺癌中的表达及其生物学意义本研究采用了免疫组织化学方法对58例乳腺癌石蜡切片CD40分子的表达进行检测，发现正常乳腺组织不表达或弱表达CD40分子，而在乳腺癌细胞中均有一定程度的表达，阳性表达率分别为37.9％，与正常乳腺组织的表达有显着性差异(p＜0.01)。由于使用抗体的识别位点不同和检测的样本数量差异，使得CD40在石蜡切片(37.9％)和新鲜标本(50％)中的阳性表达率尽管不同，但都显示CD40的表达与局部淋巴结的转移有关；新鲜肿瘤标本中CD40的表达结果还显示CD40表达与瘤块大小、远处转移有关(p＜0.05)，与皮肤粘连无关(p＞0.05)；在已建株的乳腺癌细胞上CD40表达强阳性(＞90％)。上述结果均表明CD40分子在乳腺癌中的表达，可能参与肿瘤的发生、发展和转移，其临床意义有待进一步研究。组化结果还显示，58例乳腺癌有21例P53阳性表达(36.2％)，与乳腺癌肿瘤分化程度、瘤块大小有关(p＜0.05)，与局部淋巴结转移无关(p＞0.05)。VEGF分子在各种病理类型肿瘤中高表达(81％)，其表达与乳腺癌肿瘤瘤块大小有关(P<0.05)，与分化程度、局部淋巴结转移无关伽>0.05)，同时也与CD4O、P53分子表达无明显相关性。进一步分析，发现乳腺癌中CD40与P53的表达存在一定的相关性(p<0.01，厂0.52)，提示两者在肿瘤的发生、发展中有密切的关系，两者的表达对于乳腺癌的临床评估具有重要的诊断价值，同时在进行以CD40分子为靶分子的生物治疗中要充分考虑到P53基因功能状态。二、CD40信号对乳腺癌细胞株生物学行为的影响 两株高表达CD40的乳腺癌细胞MDA一MB一231、MDA一MB一435细胞，经thCD40L激发后，其HLA一DR分子有不同程度的上调，肿瘤细胞自身高表达CD44和CD54可通过与各自相应配体结合，稳定细胞间接触，增强免疫原性和促进T细胞活化。同时，Rl’- PCR结果显示肿瘤上皮细胞经CD40激发后T细胞活化和趋化因子RANTES的转录水平上调，推测其编码的蛋白可能参与了对T细胞的趋化和活化。因此，肿瘤细胞CD40分子的激发可以促使机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，通过粘附分子/共刺激分子上调，改善或纠正T细胞对肿瘤细胞的免疫无能，可以认为这是CD4O信号作用于肿瘤细胞和扩大抗肿瘤效应的间接机制。 我们的实验结果显示rhCD40L影响MDA一MB一231、MDA一MB一35生长抑制和/或凋亡，同时thCD40L可提高肿瘤细胞对化疗药物(阿霉素、轻基喜树碱)和细胞因子(IFN一Y)的敏感性。在本实验中，单用thCD40L、化疗药物、IFN-Y仅导致肿瘤细胞的部分生长抑制，而thCD40L联合化疗药物或IFN一Y则导致更有效的肿瘤生长抑制。细胞周期的检测结果显示MDA一MB一435、MDA一MB一231分别在CD40激发后48、72hr进入Gl期阻滞，不同的细胞周期阻滞的机制尚不完全清楚，推测与细胞生长周期或不同的细胞周期蛋白激酶有关。thCD40L对MDA一MB一231、MDA一MB一35的生长抑制随着thCD40L剂量的增加而增加，这种抑制作用不仅与细胞周期阻滞有关，还与细胞凋亡有关。Pl一A刀nexinV荧光标记方法的结果表明，MDA一MB一35、MDA一MB一231在CD40激发后48hr即出现不同程度的凋亡，MDA一MB一435比MDA一MB一231凋亡显着，这与MDA一MB一35、MDA一MB一231分别在CD40激发后48、72hr进入Gl期阻滞结果相一致，正是Gl期阻滞使得肿瘤细胞不能进入正常的细胞周期而发生细胞凋亡。在基因转录水平上，CD40分子激发使得MDA一MB一435、MDA一MB一231中B瓦习BCL一XL的比率提高。这与早先的研究结果相一致，亦即相对于单独BAX和BCL一XL，B瓦X/BCL一XL的比率与细胞的存活或凋亡更直接相关。CD40分子的激发或配基化可增强肿瘤细胞对化疗药物和细胞因子的敏感性，这为在针对CD40分子靶向治疗肿瘤时，降低临床用药剂量，避免由于大量运用化疗药物而带来的毒副作用提供了实验依据。同时thCD40L分子与化疗药物、细胞因子的协同作.用也为降低rhCD40L的使用剂量避免rhCD40L对相应的全身影响提供了理论基础。 MDA一MB一435细胞高表达CD95分子，CD40信号活化后，尽管没有检测到膜型TNF的改变，但CD120a(TNF甩)、CD95L表达增加，提示该细胞凋亡可能通过CD95(Fas)路径介导凋亡信号，从而引起B瓦X/BCL~XL的比率改变参与对肿瘤细胞生长抑制的调控。MDA一MB一231没有明显的细胞表型改变，我们推测与CD4O信号活化激发的TRAFs谱改变有关。这也表明尽管同属乳腺癌细胞，但不同的细胞对
戚春建[7]2003年在《CD40信号对多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响及其分子机制》文中提出CD40分子激发可诱导B细胞产生多种生物学效应：Ig的分泌和同型转换、细胞表面分子的上调性表达如：CD23、B7、CD54和CD95等分子及诱导细胞因子的分泌如IL-2、IL-6、IL-8、TNFa和GM-CSF等。而恶性B淋巴细胞表达的CD40分子激发后可产生不同的生物学效应：涉及到肿瘤细胞生长抑制、细胞凋亡或促进细胞增殖等。一种分子为何能介导如此复杂而多样的生物效应?这引起人们的广泛关注，但迄今为止确切的原因尚未明了。因此，探讨CD40激发后信号传导及其涉及分子为阐明上述科学问题提供实验依据。鉴此CD40分子信号传导及其涉及的分子是当今免疫学领域的一个研究热点。近期发现的能与CD40胞浆结构域结合的蛋白分子TRAFs、JAK3、ERK等分别或共同参与了不同类型细胞和不同状态下CD40分子的信号传导，其中TRAFs家族成员在CD40信号传导中的作用倍受关注。 本论文以表达CD40分子的人多发性骨髓细胞为研究对象，着重探讨了CD40分子信号对肿瘤细胞生物学行为的影响及其分子机制，我们的实验结果显示：(1)叁种CD40激发方式均可显着抑制人MM细胞株XG2的体外增殖，导致XG2细胞呈现G1期阻滞，并诱导XG2细胞凋亡；(2)XG2细胞激发后TRAF1、TRAF2、TRAF5、TRAF6明显下调，而人MM细胞株XG7细胞激发后TRAF1、TRAF5、TRAF6都明显上调；(3)低剂量的CD40激发型抗体能通过诱导IL-6自分泌使XG2细胞增殖；高剂量的CD40抗体激发，虽然也诱导IL-6的分泌，但是同时也可上调膜型TNF(mTNF)和TNFRI的表达，并以后者的效应占主导作用，从而引起细胞凋亡。在我们近期的对两例MM新鲜标本的进行的相关实验中都不同程度的证实了以上在细胞株中的结果。上述结果首次证实了：CD40信号在MM细胞上生物学功能的多样性可能与不同类型TRAF谱和CD40信号对多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响及其分子机制提要不同强度的CD4O分子激发有关。
郑毅[8]2013年在《抗人CD40单克隆抗体免疫纳米载药胶束的制备及其生物学特性的研究》文中进行了进一步梳理抗人CD40分子治疗性单克隆抗体作为肿瘤生物治疗的一项重要手段，在对实体瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中具有其独特的作用。5C11是本研究所自行研制的激发型抗人CD40单抗。前期研究表明，5C11在体外具有诱导骨髓瘤细胞凋亡，并增加化疗药物对某些肿瘤细胞敏感性的作用。因此，该抗体具有潜在的治疗性应用价值，有望与免疫佐剂联合应用并配合化疗药物，更好地发挥抗肿瘤作用。纳米载药体系具有微小的体积、水溶液中良好的稳定性、广泛的载药范围、长时间的体内滞留、可通过被动靶向作用携带化疗药物到达肿瘤部位等优势，能有效克服单独使用化疗药物治疗所带来的局限性和毒副作用，可作为免疫佐剂的理想选择。本课题着眼于合成制备一种纳米载体，包载化疗药物，同时与抗人CD40单克隆抗体5C11相偶联，且不改变抗体的生物学活性，以达到兼具纳米载药体系和单抗靶向药物的优势，提高对肿瘤细胞的杀伤效果。目的：采用纳米聚合胶束为载体，制备包载阿霉素且偶联5C11的聚合胶束，并对其体外细胞毒作用及细胞摄取进行评价。方法：合成一端含对甲苯磺酸酯基团而另一端聚合混消旋丙交酯的链段聚合物PLA-PEG-OTs作为成胶束（PMs）材料。溶剂挥发法制备阿霉素载药胶束（DOX-PMs）并偶联5C11形成阿霉素免疫载药胶束（DOX-PMs-5C11）。氢核磁共振波谱法与渗透凝胶色谱法检测胶束材料PLA-PEG-OTs结构及分子量。芘探针荧光光谱法检测PMs临界胶束浓度（CMC）。动态光散射法检测PMs粒径。四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测阿霉素（DOX）、DOX-PMs和DOX-PMs-5C11对乳腺癌细胞毒作用。流式细胞仪、荧光酶标仪与激光共聚焦显微镜分别研究乳腺癌细胞株上CD40分子表达情况,PMs与蛋白质连接率,PMs与5C11偶联活性及肿瘤细胞对DOX-PMs、DOX-PMs-5C11摄取情况。结果：氢核磁共振波谱法与渗透凝胶色谱法显示合成的各种不同亲疏水链比例的胶束材料PLA-PEG-OTs分子量分布在（4000~10000）g/mol间。它们形成的PMs的临界胶束浓度范围分布在（3.2~5.5）×10~(-3)g/L间,粒径分布在（21.2~31.8）nm间，且偶联蛋白后粒径分布在（21.4~33.1）nm间。PMs与蛋白偶联反应最佳酸碱度为pH=8.5，此条件下PMs与BSA-FITC的偶联率为13.4%~17.1%。PMs能较好包载阿霉素并偶联5C11，其载药量与包封率分别为：(3.75±0.27)%、(75.12±2.38)%。MCF-7、MCF-7/ADR两株细胞上CD40的表达率为54.5%、73.6%。DOX-PMs-5C11对乳腺癌细胞的细胞毒效果均好于DOX-PMs及DOX，尤其在MCF-7/ADR细胞株中较为显着（P<0.05）。PMs偶联5C11抗体后能促进肿瘤细胞对PMs的摄取。结论：阿霉素免疫载药胶束能通过增加肿瘤细胞对阿霉素的摄取,进而增强阿霉素对肿瘤细胞的毒性。该作用在CD40表达较高的耐阿霉素乳腺癌肿瘤细胞中发挥较为明显。
郑舒丹[9]2009年在《鼠抗人CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究》文中研究表明CD40为CD40L的受体,是相对分子质量(Mr)为48000的Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于神经生长因子受体(NGFR)/肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。CD40主要表达于B细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、造血细胞、上皮细胞、血管内皮细胞及一些肿瘤细胞(如急慢性淋巴细胞白血病,霍奇金淋巴瘤,鼻咽癌,乳腺癌等)也有表达。CD40/CD40L是免疫细胞间重要的信号传导通路,在B细胞的活化与增殖分化、抗体产生及同种类型转化中起关键作用,在T细胞活化以及效应性细胞因子的分泌过程中也起重要调节作用。CD40分子介导的信号不仅能对CD40+肿瘤细胞直接发挥作用,还可通过调节适应性和固有免疫系统增强机体对表达CD40分子的肿瘤细胞的杀伤效应。目前国际上已有叁株人源化抗人CD40单抗进入临床Ⅲ期,但其存在的副作用和安全性问题仍引起高度关注。本科室以往的研究发现一些肿瘤细胞株和新鲜肿瘤细胞表达CD40突变体( CD40mu )(CAC→CAA,78His→78Gln) (NCBI Assay Id: ss23134804,Reference SNP Id:rs17177493),该突变位点位于CD40胞外段第二个富含半胱氨酸的区域,这一区域是CD40与CD40L相互作用的重要区域。基因转染细胞的构建进一步证实了该突变体与抗体的结合能力与野生型CD40截然不同,CD40mu胞外段一个氨基酸的突变可导致局部结构改变而形成新的抗原表位,该抗原表位为CD40mu所特有,为此,研制特异性抗人CD40mu分子的单克隆抗体,具备重要的研发价值。本文研制的mAb 3E4、6B4与10C5是鼠抗人CD40mu单克隆抗体,完全不同于已报道的抗人CD40单克隆抗体,能识别多种肿瘤细胞株(HO8910,H460等)以及肿瘤新鲜组织表达的CD40分子,其中10C5不识别血管内皮细胞株Eahy926以及一些正常组织表达的CD40分子,显示出独特的应用价值。1.鼠抗人CD40mu单抗的杂交瘤细胞株的制备以突变体基因转染细胞L929/CD40mu为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞融合技术,将反复免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,以突变体基因转染细胞L929/CD40mu为阳性筛选细胞,以野生型CD40基因转染细胞L929/CD40wt为阴性筛选细胞,通过间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞株进行筛选,经多次克隆化培养,最终获得3株持续、稳定分泌鼠抗人CD40mu单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E4、6B4和10C5,其重链分别为IgG2b、IgG1、IgG3,轻链为κ链。三株抗体均可用于免疫组织化学分析,3E4和10C5可用于Western-blot检测。杂交瘤细胞株经体外连续传代(40代)培养,液氮冻存半年后复苏,仍生长良好,稳定分泌抗体。2.鼠抗人CD40mu单克隆抗体的体外生物学特性研究运用制备的单抗检测发现,部分恶性B细胞株及上皮性肿瘤细胞株表达CD40mu,其在新鲜肿瘤组织中也有高水平的表达。叁株单抗与野生型CD40单抗5C11识别的抗原位点不同,对细胞株的识别谱也不相同。不同于已报道的抗人CD40单克隆抗体,叁株单抗能识别多种肿瘤细胞株(HO8910,H460等)以及肿瘤新鲜组织表达的CD40分子,其中10C5不识别血管内皮细胞株Eahy926以及一些正常组织表达的CD40分子。继而采用抗CD40mu单抗对表达CD40mu的人卵巢癌细胞株HO8910的体外实验初步表明,单抗3E4能够促进HO8910细胞的体外生长,单抗10C5能够抑制HO8910细胞的体外生长,并且促使其凋亡。综上所述,本研究成功制备了3株特异性鼠抗人CD40mu单克隆抗体,初步探讨了CD40mu在肿瘤中的表达及其生物学意义,证实了肿瘤细胞表达突变的CD40分子;单抗激发表达相应突变的肿瘤细胞后引起了生物学效应:促进/抑制肿瘤细胞的体外生长,并且诱导其凋亡。叁株特异性抗体的获得为深入探讨肿瘤细胞表达CD40mu分子的生物学意义提供了物质基础,也为肿瘤的靶向生物治疗提供了新思路。
樊一笋[10]2001年在《两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及其生物学功能研究》文中指出CD40配体（CD40L、CD154、gp39）是一种分子量为33KDa的Ⅱ型跨膜糖蛋白，其基因定位于Xq26.3-Xq27.1，属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族，主要表达在活化的CD4~+T细胞和肥大细胞表面。人们最初是通过高IgM综合征（HIGM）认识CD40L在体液免疫应答中的作用。HIGM免疫缺陷病发病机制为编码CD40L的基因发生突变，使CD40L不能功能性表达、或致使CD40L不能与CD40结合，主要表现为血清IgM的水平升高，IgG、IgA、IgE水平下降或完全缺失。越来越多的研究表明，CD40/CD40L在特异性免疫应答中发挥重要作用，通过CD40/CD40L的信号途径：（1）促使抗原递呈细胞的有效活化，进而介导其分化、成熟，启动免疫应答的产生；（2）活化T淋巴细胞，介导细胞免疫应答，参与记忆性T淋巴细胞的形成；（3）促使B细胞的活化、增殖、分化、分泌Ig及类型转换，对生发中心和记忆性B细胞的形成及维持起重要作用；（4）促进免疫活性细胞分泌多种细胞因子（IL-1、IL-8、IL-12、TNF-α等），参于 摘 要 免疫应答的调节。 业己报道，运用抗CD40L单克隆抗体阻断CD40CD40L，能有 效地抑制特异性免疫应答，减少特异性抗体和CTL的产生，在自身 免疫、移植排斥、炎症等病理免疫反应中发挥重要作用。有报道， 抗 CD40L单克隆抗体在小鼠自发性肾炎 SW、小鼠糖尿病 NOD、 实验诱导的胶原性关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎EAE等自身 免疫病模型中，均能不同程度地减少自身抗体或自身反应性T细胞 的产生，缓解症状，延迟病程发展。同时，在皮肤、心脏、肾等小 鼠移植模型中，运用抗CD40L单克隆抗体能明显延长移植物的存活， 为移植排斥的防止和移植耐受的诱导提供了新方法。该单抗在基础 及临床免疫学中的应用前景己受到广泛关注。目前，世界上报道的 阻断型抗CD40L单抗仅叁株，国内尚未见有关报道。鉴此，阻断型 抗CD40L单抗的研制不仅具有重要理论研究意义，而且还有潜在的 开发价值。 本研究以高表达人CD40L分子的小鼠成纤维转基因细胞为抗原， 采用B淋巴细胞杂交瘤技术将免疫的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细 胞SP2／0融合，通过荧光标记、竞争抑制、细胞核型分析和免疫印迹 等方发获得并建立两株识别不同抗原位点的鼠抗人CD40L单克隆抗 体的杂交瘤细胞株，分别命名为 IBI、4F。经体外长期传代培养， 液氮冻存半年以上反复复苏良好，分泌特异性抗体性能稳定。 CD40分子表达在一些非免疫细胞如血管内皮细胞、胸腺内皮细 胞，以及一些淋巴细胞性肿瘤病：卵巢癌、鼻咽癌、膀耽癌、慢性 淋巴细胞白血病（CLL入 非何杰金氏淋巴瘤（N’HL人 幼淋巴性白 血病0LL）及多发性骨髓瘤（MM）等。文献报道，这些肿瘤细胞 与正常的免疫细胞不同，用抗CD40激发型单抗激发或CD40L转基 因细胞与表达CD40分子的肿瘤细胞相互作用，可导致其生长抑制甚
参考文献：
[1]. 两株功能阻断型CD154单克隆抗体的生物学特性及其应用研究[D]. 樊一笋. 苏州大学. 2004
[2]. 鼠抗人CD40突变体单克隆抗体的研制及其生物学功能的研究[D]. 汤琳. 苏州大学. 2007
[3]. 人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人LIGHT单克隆抗体的研制[D]. 杨明峰. 苏州大学. 2006
[4]. CD40L/CD40及CD40突变体在人多发性骨髓瘤中的表达及其生物学意义[D]. 戚春建. 苏州大学. 2006
[5]. 鼠抗人PD-1单克隆抗体的研制及其生物学功能研究[D]. 明志君. 苏州大学. 2006
[6]. 共刺激分子CD40/CD40L和OX40/OX40L在乳腺癌中的表达及其生物学意义[D]. 施勤. 苏州大学. 2003
[7]. CD40信号对多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响及其分子机制[D]. 戚春建. 苏州大学. 2003
[8]. 抗人CD40单克隆抗体免疫纳米载药胶束的制备及其生物学特性的研究[D]. 郑毅. 苏州大学. 2013
[9]. 鼠抗人CD40突变体分子的单克隆抗体的研制及其生物学功能研究[D]. 郑舒丹. 苏州大学. 2009
[10]. 两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及其生物学功能研究[D]. 樊一笋. 苏州大学. 2001
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