CCK8法检测杏丁联合THP对膀胱论文_石海林张天禹通讯作者贾鹏宇覃展偶高漓唐荣金刘升学

　石海林张天禹通讯作者贾鹏宇覃展偶高漓唐荣金刘升学

（桂林医学院附属医院泌尿外科广西桂林541000）

基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目：桂科攻11107009-3-2， 桂林市科学研究与技术开发计划资助项目（No.20090112-4）【摘要】目的：探讨银杏达莫注射液（杏丁）联合吡柔比星（THP）对原代膀胱癌细胞增值抑制作用，从而为杏丁在膀胱癌灌注治疗的临床应用提供理论依据。方法:使用不同浓度的杏丁、THP、杏丁+THP三组药物分别处理原代膀胱癌细胞，用Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)法检测并描绘细胞生长曲线，评价其疗效。结果:杏丁和THP在各浓度及特定作用时间分别对膀胱癌细胞增殖有明显抑制作用且呈浓度依赖效应关系（P<005），而杏丁联合THP抑制癌细胞增殖作用较单独应用杏丁和THP更加明显（P<005）。结论:杏丁联合THP可增强THP对膀胱癌细胞增殖抑制作用，其结果优于单独应用THP，杏丁联合THP达到增效减毒目的。

【关键词】CCK8；杏丁；THP；原代膀胱癌细胞

【中图分类号】R73714【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)05-0008-02

杏丁是银杏叶提取物(EGb)的复方制剂。对多种动物及人类有着明显而广泛的药理活性，其中亦包括抗肿瘤作用［3］。而杏丁联合THP对膀胱癌的增殖抑制作用及协同作用在国内外未见报道。本研究通过CCK8实验检测不同浓度的杏丁、THP、杏丁+ THP对膀胱癌细胞的生长抑制率，进而探讨两种药物联用对膀胱癌细胞的增效性。

1材料及方法

11材料:人膀胱原代癌细胞（取自桂林医学院附属医院泌尿外科膀胱癌患者手术标本）；杏丁；THP；DMEM培养液；胎牛血清；CCK-8试剂。

12实验分组:实验分空白对照组、杏丁组、THP组以及杏丁联合THP组，其中杏丁组又分为001倍(01ug/ml)、01倍(1ug/ml)、1倍(10ug/ml)三组；THP组分为001倍（01ug/ml）、01倍（1ug/ml）、1倍（10ug/ml）三组；杏丁联合THP分为1倍+1倍（10ug/ml +10ug/ml）、1倍+01倍（10ug/ml +01ug/ml）、1倍+001倍（10ug/ml +01ug/ml）三组。

13细胞培养:将新鲜肿瘤组织标本用120目及200目钽网过滤,滤过液1000r/min、离心5min,去上清,用PBS漂洗后加DMEM培养基,制成膀胱癌细胞悬液。

14实验方法:将细胞悬液加入96孔培养板中,150μl/孔,置于37℃、5% CO2培养箱连续培养7 d,隔日换半液，加入不同浓度，不同种类药物并设阴性对照孔和实验孔,每种药物及浓度均设3个复孔。分别培养24h、48h、72h取出培养板加入CCK8 10μl继续培养2 h，在酶标仪450nm处读取OD值，并按下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率 (%)= 肿瘤细胞抑制率(IR)=(对照孔A值—实验孔A值)/对照孔A值×100%［6］。每次实验重复3次，并描绘细胞生长曲线。

15统计学处理:应用SPSS 110软件进行统计学处理,以均数±标准差（x±s）表示。两个样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用完全随机的单因素（One-ANOVA）方差分析，组间两两比较采用q检验。P<005，表示具有差异，P<001表示差异显著，P>005表示没有统计学意义。

2实验结果

21单独应用杏丁和单独应用THP对膀胱癌细胞增殖抑制作用：杏丁在不同浓度及作用时间对膀胱癌细胞增殖有明显抑制作用。其中单独应用杏丁培养第三天与对照组比有差异（P<005），且呈浓度依赖效应关系。（见图1、图2）

22单独应用THP培养第三天与对照组比较有差异（P<005）。

由图6可以看出，1倍浓度杏丁第三天膀胱癌细胞抑制率为4939%，应用001THP第三天膀胱癌细胞抑制率为7257%，1倍杏丁+001倍THP抑制率为776%，1倍THP抑制率为779%，说明杏丁增强了THP对膀胱癌细胞的抑制作用并减少了THP的用量。

3讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国，男性膀胱癌位居全身肿瘤第八位，其发病率远较西方国家低［1］。膀胱癌发病率和死亡率随着年龄增大而增加，近年来随着我国经济的发展其发病率呈现上升趋势［2］。目前临床上应用的药物主要有THP、羟基喜树碱、丝裂霉素等，虽有一定的疗效，但不良反应较大，给药剂量受到限制，影响了药物疗效的发挥，治疗指数低。

CCK-8是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测实验方法。WST-8是MTT的一种升级替代产品，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。相比传统的MTT法来说，其误差小，重复性优于MTT，对细胞毒性作用较小。

近年国内外许多基础及临床研究表明杏丁能诱导膀胱癌等恶性肿瘤细胞的增殖［4］，具有显著的抗肿瘤活性及辅助放化疗作用。本文应用杏丁作用人原代膀胱癌细胞，观察其作用效果，通过CCK-8法检测药物对膀胱癌细胞生长抑制率水平，探讨杏丁联合THP对人膀胱癌细胞的凋亡诱导作用。

实验结果显示杏丁+THP联合用药能明显提高对膀胱癌细胞生长的抑制率，与对照组、单用THP组比较均有差异性（P<005）。该抑制作用与药物作用时间和浓度有一定的相关性，表明联合用药对膀胱癌细胞增殖抑制要优于单独应用THP，联合用药时001倍THP就能达到1倍THP对膀胱癌细胞增殖抑制效果，达到了杏丁联合THP用药的增效减毒目的，为提高膀胱癌患者的化疗疗效提供了一定的理论基础，但临床应用还有待进一步研究。

参考文献

［1］金美花，德伟林．联合检测尿HAase和NMP－22活性水平在膀胱癌诊断和手术后复发的研究［J］．中国实验诊断学，2010，16(8):947－948

［2］柯昌兴，李昊．膀胱癌患者血、尿及癌组织中血管生成因子和抑制因子的表达变化［J］．山东医药，2010，31(26):51－52

［3］马盼香,方成根,连渝平.银杏叶制剂研究的现状与展望［J］.现代中西医结合杂志,2003,12(22):2486

［4］蒋晓芸,钱立平,郑晓娟.银杏叶提取物阻断大鼠胃黏膜癌前期病变的疗效及其抗氧化作用［J］.复旦学报(医学版)，2007,34(6):852-855

论文作者:石海林张天禹通讯作者贾鹏宇覃展偶高漓唐荣金刘升学

论文发表刊物:《河南中医》2013年4月第1期供稿

论文发表时间:2014-3-17

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