（常德市第一人民医院 湖南常德 415000）
摘要：目的 研究Hfq对肺炎克雷伯菌耐药性的影响和机制。方法 构建肺炎克雷伯菌hfg基因突变株与回复株，进行药敏试验，检测指标包括MIC、MBC，同时检测生长曲线、时间-杀菌曲线。结果 头孢噻肟、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢他啶对肺炎克雷伯菌WJ101株的抑制作用均较强，抑菌浓度均＜32μg/ml。肺炎克雷伯菌WJ101株生物被膜定量检测的光密度平均值为0.039，与阴性对照孔的检测值（0.032）比较，差异不显著（P＞0.05）。hfq敲除株被膜定量检测的光密度平均值为0.053，明显高于肺炎克雷伯菌WJ101株与阴性对照孔的检测值，对比差异显著（P＜0.05）。结论 Hfq对肺炎克雷菌耐药性具有一定的影响，其作用机制主要是调控肺炎克雷菌的生物被膜形成，是一种多机制共同作用的结果。
关键词：Hfq；肺炎克雷伯菌；耐药性；影响；机制
肺炎克雷伯菌属于革兰氏阴性菌，可分布于多种疾病中，是人类患病的主要致病菌[1]。近年来，肺炎克雷伯菌已被认定为是一种严重的多药物耐药菌，会对人类的身体健康与生命安全造成严重影响。鉴于肺炎克雷伯菌在临床上的耐药现象极为严峻，我们有必要探讨一种治疗肺炎克雷伯菌感染的有效疗效。基于此，现就Hfq对肺炎克雷伯菌耐药性的影响和机制作进一步研究，总结报道如下。
1材料及方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
肺炎克雷伯菌WJ101株源自本实验室。大肠杆菌DH5α源自北京天根生化科技有限公司，PKD46T质粒源自本实验室。pBR322、pHSG298质粒源自大连宝生物工程有限公司。
1.1.2 药品与试剂
药品均为头孢菌素类药物，包括头孢噻肟、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢他啶，均源自中国食品药品检定研究院。化学试剂主要包括：细菌琼脂粉、L-阿拉伯糖、TRYPTONE、YEAST EXTRACT、氯化钠、REGULAR AGAROSE G-10、二甲基亚砜、Mueller-Hinton Broth培养基。
1.2 方法
构建肺炎克雷伯菌hfg基因突变株：分两次把PKD46T质粒与hfq基因突变盒片段电转入肺炎克雷伯菌WJ101株，用卡纳抗性LB琼脂平板进行涂布筛选，最终用PCR与测序方法进行鉴定。结果显示：突变株有851bp、875bp条带，肺炎克雷伯菌WJ101株在目的处无条带。构建肺炎克雷伯菌hfg基因回复株：以肺炎克雷伯菌WJ101株基因组为模板，用KPhfqF/R引物进行pfu酶扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带切胶，用EcoRI、XbaI进行双酶切，再次回收酶切产物，pHSG298质粒用同种酶进行双酶切，并回收酶切产物。用T4连接酶连接两个回收片段，对回复的菌株用PCR与测序方法进行鉴定。进行肺炎克雷伯菌WJ101株药敏试验，检测指标包括最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）。同时，运用结晶紫定量法在630nm处检测肺炎克雷伯菌WJ101株及相应hfq敲除株形成的生物被膜，18h内进行定量，记录两种菌株的光密度平均值，并与阴性对照孔的检测结果进行对比分析，以了解hfq对肺炎克雷伯菌生物被膜形成的影响与作用机制。
1.3 统计学方法
运用SPSS 19.0软件进行数据统计，计数资料以%表示，组间对比行x2检验，以P＜0.05提示差异显著。
2 结果
2.1 肺炎克雷伯菌WJ101株的药敏检测结果
头孢噻肟、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢他啶对肺炎克雷伯菌WJ101株的抑制作用均较强，抑菌浓度均＜32μg/ml。见表1。
注：与阴性对照孔比较，#P＞0.05，*P＜0.05。
3 讨论
肺炎克雷伯菌的分布十分广泛，致病谱极广，可在全球范围内传播，已形成全球重大的公共卫生问题，必须引起高度重视。肺炎克雷伯菌不仅是碳青霉烯类抗生素耐药菌感染的主要致病因素，对第三代头孢菌素类药物的耐药也非常严重[2]。甚至有研究学者认为，肺炎克雷伯菌感染已经无药可治。因此探讨其耐药机制，并未临床治疗开创新的途径尤为重要。
Hfq蛋白属于细菌基于表达的一种转录后调控因子，可介导sRNA和mRNA的作用，其调控机制对多种细菌均可起到一定的影响，尤其是对于肺炎克雷伯菌而言，可在一定程度上影响其细胞过程与生理生化反应，其对宿主均的生长、代谢也会起到一定的影响[3]。
本研究首先构建肺炎克雷伯菌hfq突变株，再进行药物敏感试验，对比分析肺炎克雷伯菌WJ101株与hfq突变株药物敏感性的差异，结果显示，hfq对肺炎克雷伯菌的耐药性具有一定的影响，其对头孢噻肟、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢他啶等头孢菌素类药物的耐药性均高于肺炎克雷伯菌的耐药性，且其在高浓度头孢菌素类药物下的存活能力明显强于肺炎克雷伯菌WJ101株，这进一步证实了hfq的突变会造成肺炎克雷伯菌对头孢菌素类药物耐药性的提升[4]。
基于hfq蛋白是一种全局性调控因子，本研究运用结晶紫染色定量法检测了肺炎克雷伯菌WJ101株与hfq敲除株形成生物被膜的能力，结果显示，hfq敲除株被膜定量检测的光密度平均值（0.053）明显高于肺炎克雷伯菌WJ101株（0.039）与阴性对照孔（0.032），由此提示，hfq敲除株形成生物被膜的量远比肺炎克雷伯菌WJ101株形成生物被膜的量要大。分析Hfq蛋白对肺炎克雷伯菌的调控作用，主要是通过介导sRNA和mRNA之间的相互作用得以实现。因此认为，未来对肺炎克雷伯菌sRNA进行新功能的研究，或可在新领域中对hfq蛋白的调控机制进行进一步的解释[5]。
综上所述，Hfq对肺炎克雷菌耐药性具有一定的影响，其作用机制主要是调控肺炎克雷菌的生物被膜形成，是一种多机制共同作用的结果。
参考文献
[1]张爱荣，许青霞. 2011年-2015年商丘市肺炎克雷伯菌临床分布及其耐药性研究[J]. 中国卫生检验杂志，2017（09）：1344-1346.
[2]金炎，王勇，邵春红，等. 碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌引起新生儿感染的耐药机制研究[J]. 中华检验医学杂志，2015，38（11）：751-755.
[3]李欣燃. Hfq对肺炎克雷伯菌耐药性影响和机制初探及Hfq抑制剂虚拟筛选[D]. 吉林大学，2016.
[4]钟桥石. 耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌耐药机制研究[C]// 中华医学会第十二次全国临床微生物学术年会暨第十一次全球华人临床微生物学与感染症学术年会论文汇编. 2015.
[5]孙恒彪，陈佑明，吕晓明，等. 肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药机制的研究[J]. 现代预防医学，2015，42（15）：2782-2785.
论文作者:夏丹妮
论文发表刊物:《航空军医》2018年2期
论文发表时间:2018/4/11
标签：肺炎论文; 克雷论文; 头孢论文; 头孢菌素论文; 耐药性论文; 机制论文; 质粒论文; 《航空军医》2018年2期论文;