林动 徐海鹏 林景辉 许凌 王强 胡卉华 何志勇（通讯作者）
福建省肿瘤医院 福建福州 350000
【摘 要】目的：探讨肺癌患者开展外周血循环细胞（Circulatinq tumor cells，CTC）检测的临床价值。方法：选取本院2013年5月至2015年5月收治的100例晚期肺癌患者为观察组，并将同期接受体检的20例健康志愿者作为对照组。依次对两组样本开展MoFlo XDP系统富集肿瘤细胞检测，总结MoFli XDP 流式细胞仪法的检测价值，并对观察组进行CTC细胞检测，将患者的CTC检测水平同其性别、年龄、吸烟情况、临床分期、肿瘤病理分型等情况进行相关性评价。结果：超高速流式细胞分选仪 MoFlo XDP 用于CD45-CK+/Ep-CAM+细胞测定分析最低灵敏范围为0.0001%；观察组患者样本的CTC阳性率为59.0%，健康对照组样本的CTC阳性率为0%，观察组CTC检出情况同患者的组织学类型、TNM分期以及转移灶数目存在密切相关性。结论：MoFli XDP 流式细胞仪法测定CTC水平具有良好应用价值，CTC检测可用于肺癌的临床治疗具有重要的参考价值
【关键词】晚期肺癌；外周血循环细胞；
【Abstract 】Objective：to study the patients with lung cancer in peripheral blood circulation cells （Circulatinq tumor cells，CTC）to detect the clinical value of，and analyze the MoFlo XDP flow cytometry instrument in CTCS detection application effect. Methods：Our hospital in May 2013 to May 2015 treated 100 cases of patients with advanced lung cancer as the observation group，and will accept the same physical examination of 20 cases of healthy volunteers as control group. On two groups of samples in order to carry out the MoFlo XDP enrichment of circulating tumor cells detection system，the CTC levels the same gender，age，smoking status，pathological classification，clinical stage，tumor ，and so on and so forth relevance evaluation. Results：For the determination minimum range of sensitivity analysis of 0.0001%，the observation group patient samples of CTC positive rate was 59.0%，healthy control group of samples positive rate of CTC was 0%. Its CTC detection with the patient's histological type，TNM stage and there is a close correlation between Numbers of metastases.. Conclusion：MoFli XDP CTCS level flow cytometry instrument method，has a good application value. the patients with lung cancer line CTC detection of clinical treatment are a significant role in guiding.
【 key words 】 late lung cancer；Peripheral blood circulation cells；
近年来，大量临床研究试验均表示肺癌等实体肿瘤发病患者的外周血内存在癌细胞，而相关循环癌细胞或为恶性肿瘤扩散的关键性原因[1-3]。由于外周循环血中的肿瘤细胞含量偏少，对临床检验的要求较高，促使恶性肿瘤患者的外周血循环细胞检测已成为临床研究重点课题[4]。本次研究中针对晚期肺癌患者均采用MoFlo XDP流式细胞仪获取其CTC水平，测定其外周血CTC细胞含量，并将分析结果与患者年龄、组织学类型、TNM分期及转移灶数等情况进行全面比较，验证外周血循环细胞检测的临床价值以及MoFlo XDP流式细胞仪检验的可行性。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院2013年5月至2015年5月收治的100例晚期肺癌患者作为观察组，并以同期参加健康体检的20例健康志愿者作为对照组。观察组患者纳入标准为：1.符合WHO对晚期肺癌的诊断标准[5]；2.疾病分期为ⅢB或Ⅳ期[6]；3.无合并第二原发癌。对照组样本中男性14例，女性6例，年龄范围40～67岁，平均（51.9±2.8）岁；观察组样本中男性67例，女性23例，年龄范围43～68岁，平均（52.1±2.6）岁。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂
美国Beckman公司生产Moflo XDP流式细胞仪与3130XL测序仪，美国ABI公司提供的BigDye 3.1试剂盒。
1.2.2 标本采集
清晨空腹状态下采集外周血7.5mL，将标本置于含有EDTA抗凝剂试管内，放置4℃环境保存并于1d内完成相关检验。
1.2.3 检验方法
采用MoFlo XDP流式细胞仪法获取CTC水平。通过人工校对完成数据记录与整理，CTC计数≥5个/7.5mL为阳性。
1.2.4 数据分析
测定并比较不同组别样本的CTC检验结果，检验MoFlo XDP流式细胞仪 CTC检验的灵敏性和阳性检出率。观察组阳性样本给予2次CTC检测，首次检验时间为化疗前，第二次检验时间为为化疗2周期后21天内，同期给以影像学评价，本组患者均采用肺癌一线化疗方案（第三代新药联合铂类治疗），随访时准确记录其生存时间。同时对CTC阳性和阴性的患者分析其中位生存时间（定义为从研究开始至因任何原因引起死亡的时间的中位值）进行分析统计。另将观察组样本的年龄、性别、组织学类型、TNM分期以及转移灶数目进行统计，联合检出情况评估CTC阳性率与患者临床特征的相关性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件，计量资料以（ ）表示，行t值检验，计数资料行X?检验，P<0.05为比较差异具有统计学意义。单因素采用卡方检验，多因素分析采用非条件多因素logistic回归分析。
2 结果
2.1 Moflo XDP流式细胞仪的灵敏性
将A549肺癌细胞株细胞计数后，依照浓度梯度，分别将1、5、10、50 个A549肺癌细胞与106个健康志愿者外周血淋巴细胞混匀，所以肿瘤细胞浓度分别为 10-6，5*10-6，10-5，5*10-5，该实验重复三次。由此可知，超高速流式细胞分选仪 MoFlo XDP 检测CD45-CK+/Ep-CAM+细胞的敏感性可达到0.0001%，即1*10-6。
2.2 Moflo XDP流式细胞仪检测肺癌患者CTC检出率
观察组样本CTC阳性共59例，检出率为59.0%，假阴性率为41%，对照组CTC阳性 0例即假阳性率为0%，特异性为100%。见表1。
3 讨论
肺癌在全球范围内均具有极高的发病率与死亡率，在病变细胞转移至血液系统后会逐渐形成CTC，进而促使肿瘤细胞的全身化转移倾向[7]。通常情况下人体免疫系统能够良好清除CTC组织，但少量CTC会出现逃逸表现，定植于其他器官与组织后而发生严重的肿瘤转移情况[8]。受CTC血行转移影响，患者病情程度会大大增加，其临床治疗效果也会显著下降，促使临床死亡几率明显升高。国外学者经临床研究提出96.7%肺癌患者病灶中均可检出CTC，而29.4%肺癌患者外周血肿亦可检出CTC[9]。
在本次研究中分别对晚期肺癌患者及健康志愿者开展了CTC检测，结果显示肺癌患者中CTC阳性率达59.0%，而健康志愿者均为CTC阴性，说明MoFlo XDP检测CTC特异性高，且灵敏性与国内外资料相仿，故MoFlo XDP在肺癌CTC检测可适用于临床应用。同时，100例肺癌患者的年龄、组织学类型、TNM分期以及转移灶数目均与CTC检出结果呈密切相关性，反映了CTC测定在预后分析和预测方面的可靠性。虽然肺癌患者CTC检验的相关研究日趋增多，但采用CTC检测替代组织标本检验仍缺乏确切定论，其主要问题如下。①既往研究报道对CTC组织EGFR变异情况的检验结果不一，仍缺乏大样本量的前瞻性研究[10]；②外周血游离DNA替代肿瘤病灶生物学行为的可靠性缺乏定论；③CTC检验中游离DNA的浓度偏低，其检验的特异度与敏感性同肿瘤病灶组织检验相比偏差，但由于其临床实施简易性较好，可为疾病诊断提供新的思路。
参考文献：
[1]Chen X，Zhou F，Li X，et al. Folate Receptor-Positive Circulating Tumor Cell Detected by LT-PCR-Based Method as a Diagnostic Biomarker for Non-Small-Cell Lung Cancer[J]. J Thorac Oncol，2015，10（8）：1163-1171.
[2]Farr KP，Maller DS，Khalil AA，et al. Loss of lung function after chemo-radiotherapy for NSCLC measured by perfusion SPECT/CT：Correlation with radiation dose and clinical morbidity[J]. Acta Oncol，2015，19（23）：1-5.
[3]Wang H，Huang J，Yu X，et al. Different eficacy of EGFR tymsine kinase inhibitors and prognosis in patients with subtypes of EGFR-mutated advanced non-small cell lung cancer：A meta analysis[J]. J Cancer Res Clin Oncol，2014，140（11）：1901-1909.
[4]陈晓林，欧阳小平，黄玉民，等.MicroRNA-182在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J].临床肺科杂志，2015，20（6）：997-1000.
[5]邱田，凌云，山灵，等.非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体Kras基因突变检测及与临床病理特征的相关性[J].中国肿瘤临床与康复，2015，1（6）：678-680.
[6]Myung JH，Roengvoraphoj M，Tam KA，et al. Effective Capture of Circulating Tumor Cells from a Transgenic Mouse Lung Cancer Model using Dendrimer Surfaces Immobilized with anti-EGFR[J]. Anal Chem，2015，20（27）：192-195.
[7]宋英健，王正，杨林，等.肺癌循环肿瘤细胞的研究进展[J].中国肺癌杂志，2012，15（10）：612-618.
[8]Hamilton G，Rath B，Klameth L，et al. Receptor tyrosine kinase expression of circulating tumor cells in small cell lung cancer[J]. Oncoscience，2015，2（7）：629-634.
[9]Okumura Y，Tanaka F，Yoncda K，et al. Circulating tumor cells in pulmonary venous blood of primary lung cancer patients[J]. Ann Thorac Surg，2009，87（6）：1669-1675.
[10]Xu YH，Zhou J，Pan XF. Detecting circulating tumor cells in patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. Genet Mol Res，2015，14（3）：10352-10358.
[11]万佳蔚，沈洪远，黄红宇，等.非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞与临床特征关系的初步研究[J].临床与病理杂志，2015，35（1）：43-47.
[12]Dingemans AM，Brakenhoff RH，Postmus PE，et al. Detection of cytokeratin-19 transcripts by reverse transcriptase-poly-merase chain reaction in lung cancer cell lines and blood of lung cancer patients[J]. Lab Invest，1997，77（3）：213.
[13]董强刚，江晓丰，沙慧芳，等.外周血循环中肺癌细胞的流式细胞仪定量分析[J].肿瘤，2000，20（1）：31-33.
注：福建省肿瘤医院（福建省肿瘤转化医学重点实验室，福建省医科大学教学医院）。该项目为福建省省自然资助项目，项目编号2013J01284。吴阶平医学临床科研专项资助项目，课题编号 320.6799.15006。*通讯作者：何志勇。
论文作者:林动,徐海鹏,林景辉,许凌,王强,胡卉华,何志勇
论文发表刊物:《航空军医》2016年第11期
论文发表时间:2016/7/21
标签：肺癌论文; 细胞论文; 患者论文; 肿瘤论文; 阳性论文; 检出论文; 样本论文; 《航空军医》2016年第11期论文;