摘要 目的：测定不同产地土牛膝中蜕皮甾酮的含量差异，建立高效液相测定土牛膝中蜕皮甾酮的方法。方法：采用Agilent C18液相色谱柱（250×4.6 mm，5 μm），以甲醇：水（39：61）为流动相进行梯度洗脱，流速1ml/min，检测波长250 nm，柱温35℃。结果：蜕皮甾酮进样量在0.117~5.85 μg范围内与峰面积之间呈良好的线性关系，蜕皮甾酮的线性方程为A=1367.7C（r=0.9998）；加样回收率的范围在96.41%~103.95%之间，RSD值为2.45%（n=9）；含量测定结果表明蜕皮甾酮含量最高的为广西金秀自然保护区样品（0.1306%），蜕皮甾酮含量最低的为南宁市罗村样品（0.0104%）。结论：该方法准确可靠，操作简便，可以为土牛膝药材的质量控制与标准制定提供参考依据。
【关键词】土牛膝，蜕皮甾酮，HPLC，含量测定
Determination of ecdysterone in Achyranthes aspera L. from different producing areas by HPLC Han fu Meng1，Sheng gao Yin*2，Liu yan Zeng2，JuanYiang2，Xiaoxia Li2
（1. Guangxi Nanning Force Creation Biotechnology Co.，Ltd. mashan Guangxi 530603，2.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530001）
Abstract Objective：to determine the content of ecdysterone in Achyranthes bidentata from different areas and to establish a HPLC method for the determination of ecdysterone in Achyranthes bidentata. Methods：a Agilent C18 liquid chromatographic column of 250 × 4. 6 mm ~（-1）was used for gradient elution with a mobile phase of methanol：water 39：61. The flow rate was 1 ml / min，the detection wavelength was 250 nm and the column temperature was 35 ℃. Results：there was a good linear relationship between the concentration of ecdysterone and peak area in the range of 0.117 μ g and 5.85 μ g. The linear equation of ecdysterone was A=1367.7C（r=0. The range of recovery was 96.41% 103.95% and the RSD value was 2.45%. The results showed that the highest ecdysterone content in Jinxiu Nature Reserve of Guangxi was 0.13066.The lowest ecdysterone content was 0.0104% in Luocun，Nanning City. Conclusion：this method is accurate，reliable and easy to operate. It can provide reference for quality control and standard formulation of Radix Achyranthes bidentata.
Keywords：Achyranthes bidentata，ecdysterone HPLC，determination of content
土牛膝为苋科植物粗毛牛膝（Achyranthes aspera L．）野生种的干燥根及根茎[1]。其为我国常见药用植物，味苦酸，性微寒；归肝、肾、脾胃经，有活血祛瘀，泻火解毒，除湿邪利水道之功效[2]；对白喉、扁桃体炎、感冒发烧、麻疹肺炎、急慢性咽喉炎、痈疽疖肿等炎症有较好的治疗效果，此外还能用于毒蛇咬伤和类风湿性关节炎的辅助治疗[3]。蜕皮甾酮是土牛膝发挥药理作用的重要成分之一。有研究表明，蜕皮甾酮可缩短核酸及蛋白质的合成时间、作用于糖代谢、加快脂类代谢、参与免疫调节、影响中枢神经系统的活动等多方面药理作用[4-9]，具有良好的开发应用前景。
本文采用高效液相色谱法对不同产地的土牛膝药材中蜕皮甾酮的含量进行测定，以期可以为土牛膝药材的质量控制与标准制定提供参考依据。具体如下：
1 实验试药与仪器
1.1 实验材料
1 实验材料
本次实验所用的14批土牛膝样品分别采自玉林市北流、桂林市龙胜县、柳州市金秀、河池市（罗城、宜州）、南宁市（马山、伊岭岩、四塘、罗村）、重庆市（樟县、巫溪、奉节）等地，各样品经广西中医药大学药学院廖月葵高级实验师鉴定为苋科植物土牛膝（Achyranthes aspera L．）的干燥根和根茎。蜕皮甾酮对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，生产批号：130428，纯度≥98%）。
1.2 实验仪器
Agilent??1260高效液相色谱仪（Agilent美国安捷伦）、SQP电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、Direct-Q?SUV超纯水器（广西南宁博美生物科技股份有限公司）、L600台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、HWS-2l电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司），等。
1.3 试剂与溶剂
甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水；其它试剂均为分析纯；
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
精密称量蜕皮甾酮对照品11.70 mg，置10ml容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，摇匀，精密移取2 ml置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即可。
2.2 供试品溶液制备
取土牛膝根茎粉末（过50目筛）约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇30ml，称定重量，超声处理1.5h，静置，放冷，补足重量，摇匀，离心，取上清液，残渣精密加入30%甲醇30ml，重复提取1次，合并2次所提取的上清液，水浴干燥，用甲醇定容至5ml容量瓶中，摇匀，取1ml试液离心处理15min（转速13000rpm），即得供试品溶液。
2.3色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇：水=39：61；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进量体积：10μl；检测波长：250nm。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1至图2所示。结果表明：蜕皮甾酮峰在16.9min附近出峰，无干扰。
图2 土牛膝样品高效液相色谱图
2.5 标准曲线绘制
分别精密吸取蜕皮甾酮对照品溶液（0.234 mg/ml）0.5、1、5、10、15、25 μl，注入液相色谱仪，按上述2.3项下的色谱条件测定峰面积，以峰面积y与蜕皮甾酮进样量x（μg）进行线性回归，得标准曲线方程：y=1367.7x，r =0.9998。表明蜕皮甾酮在0.117~5.85 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取同一供试液（广西南宁市罗村）平行进样6次，每次10μl，按2.3项下的色谱条件测定，得到蜕皮甾酮的峰面积值的RSD值为1.15%（n=6）。表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试液（广西南宁市罗村），分别在0、2、5、10、15、24小时进样10μl，按2.3项下的色谱条件测定，结果测得峰面积RSD值为1.48%（n=6）。表明供试品溶液在24小时内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批号样品（广西南宁市罗村）6份，分别按2.2项下供试品溶液的制备方法进行制备，制得6份供试品溶液，分别精密进样10μl，按2.3项下的色谱条件测定，将测定所得的峰面积代入上述实验所得线性方程中，计算得到该样品中总蜕皮甾酮的平均百分含量为0.012%，RSD值为1.36%（n=6）。表明本方法重现性良好。
2.9 加样回收试验
取已知样品中蜕皮甾酮的百分含量为0.012%的土牛膝样品粉末（过50目筛）9份，每份0.5 g，精密称定，分别加入一定量的蜕皮甾酮对照品，按2.2项下方法制备得高、中、低3个浓度的供试品溶液，进样测定并计算回收率。得其平均加样回收率为100.89%，RSD值为2.45%（n=9）。结果如表1所示。
3 分析与讨论
本实验蜕皮甾酮的精密度测定峰面积RSD值为1.15%（n=6），表明仪器精密度良好；稳定性测定峰面积RSD值为1.48%（n=6），表明供试品溶液在24小时内稳定；重复性测定蜕皮甾酮的RSD值为1.36%（n=6），平均百分含量为0.012%，表明本方法重现性良好；平均加样回收率为100.89%，RSD值为2.45%（n=9），表明本方法系统误差小。
本实验对蜕皮甾酮进行线性考察结果表明，其进样量在0.117~5.85μg范围内与峰面积线性关系良好（r=0.9998）。蜕皮甾酮含量测定结果表明：蜕皮甾酮含量最高的为广西金秀自然保护区样品，蜕皮甾酮含量为0.1306%；蜕皮甾酮含量最低的为广西南宁市罗村样品，蜕皮甾酮含量为0.0104%；所以建议拟定不同地区土牛膝药材中蜕皮甾酮含量应不低于0.010%。
本实验的方法准确可靠，操作简便，适用于土牛膝药材中蜕皮甾酮的含量测定，可以为土牛膝的质量控制与标准制定提供参考依据。
参考文献：
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论文作者:蒙汉富1,银胜高*2（通讯作者）,曾柳燕2,蒋娟2,
论文发表刊物:《中国蒙医药》2018年第5期
论文发表时间:2018/7/25
标签：土牛论文; 精密论文; 溶液论文; 色谱论文; 南宁市论文; 样品论文; 值为论文; 《中国蒙医药》2018年第5期论文;