吕丽华[1]2004年在《山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究》文中认为本文研究山羊卵母细胞体外培养、体外受精及胚胎体外培养程序的优化,目的是为建立一套完善的山羊胚胎体外生产体系。从而为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。同时探讨山羊胚胎干细胞的分离培养技术,为核移植、转基因等胚胎工程后技术的应用奠定基础。试验一研究山羊卵母细胞体外成熟的培养方法,以提高山羊卵母细胞的成熟率。使用微滴法培养,探讨山羊卵母细胞的回收、成熟液的调整对比、添加不同激素、以及不同抗氧化物质等对山羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,选用胞质均一致密,外围至少有3 层以上卵丘细胞包裹的A 级卵母细胞,添加浓度为1 μg/ml 的E 2、5 μM 的?-ME,成熟培养27h 可显着提高卵母细胞体外培养的成熟率。使用国产绒促激素完全可以代替进口的FSH 和LH 用于山羊卵母细胞体外成熟培养,在相同效果的前提下可大大降低成本。试验二研究山羊体外受精条件的优化,为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。比较体外受精方法,不同获能物质的影响表明不同精子获能中,肝素效果比较稳定。Percoll 法处理精子卵裂率要显着高于上浮法,但是囊胚率和囊胚细胞数并没有提高。上浮法的精子镜检活力要好于Percoll 法分离的精子。但是,总体受精率、发育率还很低。试验叁通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合山羊胚胎体外发育的培养体系。通过共培养方法对共培养体系、换液程序、以及不同培养液的研究表明,在山羊胚胎培养中,基础培养液选用配制简单的SOF(CR1 也可使用),添加BSA/FCS,并采用正确换液程序,即48h 前是SOF+BSA,之后换为SOF+FCS 可获得理想的囊胚率和卵裂率。共培养条件下颗粒细胞和输卵管细胞对胚胎的发育并没有明显差异,但就发育率而言,显着优于无共培养体系。由此,说明共培养细胞类型对胚胎发育影响不大,但可以很好地克服胚胎的8~16-细胞阻滞。试验四利用透射电镜研究山羊体内胚和体外胚的超微结构,旨在对体外胚胎质量及其培养体系进行评价,为进一步提高体外胚胎的质量提供超微结构方面的理论依据。结果表明山羊体外胚胎质量要比体内发育胚差,包含有大量脂滴、畸形线粒体以及空泡化严重、细胞间隙连接较少且松散、核质比下降等。试验五以体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚叁种不同来源的囊胚为材料,分离山
李亚东[2]2001年在《颗粒细胞、卵泡液对山羊卵泡卵母细胞体外成熟、体外受精的影响》文中指出本文系统研究了颗粒细胞、卵泡液对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响，主要结果如下： 将卵丘-卵母细胞复合体（COC_s）、机械裸卵（DO）、自然裸卵（NO）在M199体外成熟液中培养24h后，体外成熟率分别为67.68％、45.3％、7.3％，各组间差异显着（p＜0.05）；体外受精24h后，卵裂率分别为14.1％、2.68％、0，各组间差异显着（p＜0.05）。 将部分体外成熟的COC_s进行剥离卵丘细胞处理（试验组）、对照组不进行剥离处理，然后体外受精，试验组和对照组卵裂率分别为14.32％、14.1％，差异不显着（P＞0.05）。 在体外成熟液中分别添加浓度为0.15×10~6个/ml（Ⅰ组）、1.5×10~6个/ml（Ⅱ组）、15×l0~6个/ml（Ⅲ组）、150×10~6个/ml（Ⅳ）的卵丘颗粒细胞和卵泡颗粒细胞悬液，对照组为不添加颗粒细胞的M199液，卵母细胞经体外成熟培养后，对于添加卵丘细胞悬液组，Ⅰ、Ⅱ组的成熟率（60.0％、64.37％）与对照组（65.41％）差异不显着（P＞0.05）；Ⅲ组（50.15％）、Ⅳ（30.4％）与对照组差异显着（p＜0.05）；成熟后体外受精，卵裂率分别为14.2％、14.6％、12.47％、12.56％，对照组为13.4％，各组间差异不显着（P＞0.05）。添加卵泡颗粒细胞结果与卵丘颗粒细胞相类似。 COC_s分别在卵丘颗粒细胞单层、卵丘颗粒细胞条件液和M199培养液（对照组）中培养，体外成熟率分别为66.10％、44.2％和66.28％，条件液组成熟率显着低于与对照组（p＜0.05），单层组与对照组差异不显着（P＞0.05）；体外受精后卵裂率分别为12.7％、13.2％和14.8％，各组间差异不显着（P＞0.05）。 将COC_s放于山羊卵泡液中培养24h后，体外成熟率为8.3％，与对照组（66.42％）相比，差异显着（p＜0.05）；用M199培养液代替GFF，继续 扬州大学硕士学位论文 培养 24h后，COCs体外成熟率为 62．34％，虽较对照组（68．5％）低，但差 异不显着（P＞0．05）；体外受精后卵裂率为14．5％，与对照组门2．49％）相 比，差异不显着（P＞0．05）。 分别用取自于大卵泡（5－6rum）、中等卵泡（35nun）、小卵泡（2－ 3turn）的不同性周期（卵泡期、早期黄体期、功能黄体期、退化黄体期） 的卵泡液培养 COCS，结果表明：对于同一大小的卵泡，卵泡期u）的卵 泡液对 COCS的成熟抑制作用显着…J．05）低于其它各期，早期黄体期 （11）、退化黄体期（IV）的卵泡液对COCs的抑制作用要低于功能黄体期 （m），且差异显着（p＜0．05），但n 组与 W组之间差异不显着 （P＞0．05）；在卵泡期，来源于大、中、小卵泡的卵泡液对 COCS的成熟 抑制作用依次增强，且组间差异显着（P＜0．05），其它同一性周期内，不 同大小卵泡的卵泡液对卵母细胞的体外成熟抑制作用差异不显着 （P＞0．05）。 在体外成熟培养液中添加浓度为 0、5％、l肌、15％的卵泡液，体外成熟 培养24h后，成熟率分别为66．4％、64．7％、64．3％、60．6％，各组间差异不 显着（P＞0．05）；体外受精后，卵裂率为13．57％、14．0％、13．弧、 13．48％，各组间差异不显着（P＞0．05）。
马学海[3]2007年在《牛体外成熟卵母细胞与性控精子体外受精的研究》文中研究表明本文研究牛卵母细胞的体外成熟培养、与性别分离精子体外受精及早期胚胎体外培养程序的优化,目的是为建立一套完善的牛性控胚胎体外生产体系,从而为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。同时为核移植、转基因等胚胎工程后技术的应用奠定基础。试验一研究牛卵母细胞体外成熟的培养方法,以提高牛卵母细胞的体外成熟率。通过添加不同激素、以及不同血清,比较不同浓度的激素水平,不同血清及其浓度对牛卵母细胞体外成熟的影响。以期找出在本实验室条件下,牛卵母细胞IVM所需要添加的适宜的激素浓度,血清种类及浓度。为进一步做IVF、IVC打下基础。结果表明,选用胞质均一致密,外围至少有3层以上卵丘细胞包裹的A级卵母细胞。添加10μg/mlFSH、10μg/mlLH、1μg/mlE2,成熟培养22～24h可显着提高卵母细胞体外培养的成熟率;与添加5%血清相比,添加10%的血清成熟效果更好,单独添加10%发情牛血清(OCS)能起到与10%胎牛血清(FCS)在外源激素参与下联合培养同等或者更好的效果。说明在牛细胞培养液中只添加10%OCS而不使用激素是完全可行的,在相同效果的前提下可大大降低成本。试验二研究不同精子获能添加物、不同精子密度、不同精子获能液对性别分离精子IVF的影响。目的是优化性控精液体外受精条件,筛选出简便、高效的获能处理方法。为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。研究表明受精液中同时添加一定浓度的肝素(l0μg/ml)与咖啡因(5mM),能较好地促进牛分离精子体外获能与受精;精子密度在1.0×106个/ml左右比较适合牛分离精子IVF;用BO液和TALP液对牛性控精子进行获能和受精处理,其受精效果差异不显着(P>0.05),但BO液对早期胚胎的发育影响较小。试验叁通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合牛胚胎体外发育的培养体系。通过对共培养体系、不同早期胚胎培养液及分离精子和未分离精子IVF的研究表明,在牛早期胚胎培养过程中,在共培养条件下基础培养液选用配制简单的SOF或CR1,添加一定量的BSA,可获得较高的囊胚发育率和卵裂率。颗粒细胞与输卵管上皮细胞间对胚胎的发育并没有显着差异(P>0.05),但两组均显着优于非共培养体系(P<0.05)。分离精子和未分离精子在共培养条件下的体外受精效果表明,两者的卵裂率和囊胚率差异不显着(P>0.05),但未分离精子体外受精效果稍好于分离精子。
张金花[4]2007年在《优化牛体外生产胚胎体系的研究》文中研究表明随着胚胎工程技术的推广应用，牛活体采卵及体外受精技术成为解决体外生产胚胎紧缺的有效途径。但目前的研究还不能达到产业化体外生产牛胚胎的目的，故本研究针对牛活体取卵技术获取卵母细胞数量少，质量差等特点，旨在建立适合活体取卵技术的微滴培养技术，以及从五个方面优化体外培养体系，为体外高效生产牛胚胎研究奠定基础。本文以屠宰场牛卵巢为材料，采用体外成熟、体外受精、早期胚胎的体外培养等方法，研究了不同体积的受精液及不同早期胚胎培养液体积对体外受精分裂率及囊胚率的影响，同时还研究了微滴培养使用处理石蜡油覆盖受精液滴和早期胚胎培养液对体外受精的影响。结果表明：不同体积的受精液70μl和150μl体外受精后卵裂率(67．2％、64．2％)、囊胚率(25．4％、24．3％)差异均不显着(P>0．05)，但显着优于对照组：体积为70μl的受精液覆盖与不覆盖石蜡油其分裂率(59．3％、70．3％)差异显着(P<0．05)，囊胚率(27．1％、21．4％)差异不显着(P>O．05)，但二者均显着优于对照组；受精使用70μl覆盖石蜡油，其早期胚胎培养使用200μl培养液覆盖与不覆盖处理石蜡油，结果分裂率(72．3％、70．5％)差异不显着(P>O．05)，囊胚率(33．2％、22．3％)差异显着(P<0．05)，且结果显着优于对照组，故少量卵母细胞的体外培养应使用覆盖处理石蜡油的微滴培养，可获得良好的培养效果。在覆盖物的选择上，石蜡油的效果显着优于矿物油(P<0．05)，新石蜡油与反复使用的处理石蜡油效果差异不显着(P>0．05)。本文利用以上建立的微滴培养方法，为优化体外培养体系，探讨了从不同状态卵巢所获卵母细胞、种公牛精液、受精时间、季节及共培养对体外培养结果的影响。结果表明：(1)不同卵巢状态所获卵母细胞培养后，分裂率、囊胚率差异均不显着(P>0．05)；(2)不同种公牛精液进行体外受精，结果显示分裂率和囊胚率差异显着(P<0．05)，受精前有必要对精液的受精力进行测定，确保体外培养的精液的质量；(3)以6h、8h、12h、16h的受精时间分别进行体外培养，结果以12h效果最佳，分裂率、囊胚率与其它各组差异均显着(P<0．05)，表明受精时间以12h左右为宜；(4)季节对体外培养的影响，以春、秋季效果显着优于夏、冬季(P<0．05)；(5)使用颗粒单层对分裂率无明显的影响，但可显着提高囊胚率(P<0．05)。
郑培栋[5]2007年在《南阳黄牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精研究》文中研究指明本研究利用屠宰后南阳黄牛的卵巢,采用切割法收集卵巢上直径小于2mm卵泡中的卵母细胞,对所得的A、B级卵母细胞进行体外成熟、体外受精及受精卵体外培养研究,并探讨了相关影响因素,初步建立了南阳黄牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟培养及体外受精的体系。试验结果如下:1.分别采用切割法、剥离法、组织破碎法采集小腔卵泡卵母细胞,并将各组获得的小腔卵泡卵母细胞在成熟培养液中进行体外成熟培养。结果表明,叁种方法的采卵数分别为8.63、10.96和12.04,采卵率差异不显着(p＞0.05),叁组小腔卵泡卵母细胞的体外成熟率和受精率以切割法为最高(28.57%,26.28%),剥离法(25.71%,21.24%),差异不显着(p＞0.05),但是显着高于组织破碎法(18.57%,19.17%)(p＜0.05)。2.成熟培养液中分别添加0%(对照组,添加10%FCS)、10%、20%、30%牛卵泡液(BFF)对小腔卵泡卵母细胞进行体外成熟培养。结果表明,添加10%BFF组的成熟率和受精率(27.50%,26.67%)均显着高于添加30%BFF组(12.50%,16.67%)(p＜0.05)。添加10%BFF组的卵母细胞成熟率(27.50%)高于对照组(20.00%),但差异不显着(p＞0.05),受精率(26.67%)低于对照组(27.50%),差异也不显着(p＞0.05)。添加20%BFF组的卵母细胞成熟率及受精率(25.00%,22.58%)均低于添加10%BFF组,差异不显着(p＞0.05)。3.将小腔卵泡卵母细胞分别体外成熟培养24～26h、26～28h、28～30h、30～32h。26～28h组的成熟率及受精率均高于其它叁组(25.00%VS 23.33%,21.67%,20.00%)(22.11%VS 19.17%,21.11%,19.48%),但差异不显着(p＞0.05),培养24～26h组的受精率低于其它叁组(19.17%VS 22.11%,21.11%,19.48%),但差异不显着(p＞0.05)。4.成熟培养液中分别添加10%FCS、20%FCS、10%OCS、20%OCS对小腔卵泡卵母细胞进行体外成熟培养。结果表明,在分别添加FCS和OCS两组中,10%的血清浓度所得的卵母细胞成熟率及受精率(OCS:31.67%,28.00%)(FCS:28.33%,27.50%)均高于20%的血清浓度(OCS:23.33%,23.08%)(FCS:20.00%,20.95%),但差异不显着(p＞0.05)且添加OCS所得的效果优于FCS。5.成熟培养液中分别添加A:10%FCS+GCM、B:10%OCS+GCM、C:10%OCS+LIF+GCM、D:10%OCS+LIF+BOECM进行小腔卵泡卵母细胞的体外成熟培养,结果表明,C、D两组的小腔卵泡卵母细胞成熟率及受精率(35.00%,34.21%)(32.50%,32.56%)均显着高于A组(22.50%,23.00%)(p＜0.05)。用颗粒细胞单层(GCM)进行共培养的C组小腔卵泡卵母细胞成熟率及受精率(35.00%,34.21%)均高于用输卵管上皮细胞单层(BOECM)进行共培养的D组(32.50%,32.56%),但差异不显着(p＞0.05)。6.分别采用Percoll密度梯度离心法、上浮法、直接离心洗涤法对精液进行洗涤,用于南阳牛成熟小腔卵泡卵母细胞的体外受精。结果表明,上浮法洗涤精液所得的受精率及卵裂率(31.11%,28.57%)均高于Percoll密度梯度离心法(26.56%,25.00%),但差异不显着(p＞0.05)。直接离心法的受精率及卵裂率(21.21%,14.28%)均显着低于上浮法(31.11%,28.57%)(p＜0.05),其卵裂率也显着低于Percoll密度梯度离心法(25.00%)(p＜0.05)。7.在改良台氏液(mTyrode's液)中分别添加10mg/l、20mg/l、30mg/l、、40mg/l、50mg/l的肝素进行精子的获能处理,然后进行体外受精。结果表明,五组的受精率呈升高趋势(20.45%,21.57%,23.81%,26.47%,27.91%),但各组之间无显着差异(p＞0.05)。五组的卵裂率也逐渐升高,但添加10mg/l、20mg/l、30mg/l组之间差异不显着(p＞0.05)。添加40mg/l、50mg/l组的卵裂率显着高于添加10m/l组(p＜0.05)。8.用颗粒细胞单层(GCM)培养体系和输卵管上皮细胞单层(BOECM)培养体系进行受精卵的体外培养。结果表明,BOECM培养体系所得的受精率(28.99%)及4—细胞胚发育率(7.14%)均高于GCM培养体系(26.39%,5.26%),但差异不显着(p＞0.05)。由此可知,输卵管上皮细胞单层和颗粒细胞单层均可用于南阳黄牛体外受精卵的体外培养。
王勇胜[6]2004年在《卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响》文中提出体细胞核移植、转基因动物等的研究已成为胚胎工程技术发展的热点和方向，但其效率很低。制约胚胎工程进一步发展的瓶颈是卵母细胞体外成熟及胚胎体外培养技术，体外培养体系的不完善导致卵母细胞和胚胎代谢及基因表达的紊乱，从而导致体外生产胚胎效率和质量的下降，因此进一步完善卵母细胞体外成熟及胚胎体外培养体系具有重要的理论及实践意义。本研究着重于模拟体内环境，系统研究了卵丘细胞与卵母细胞或早期胚胎体外共培养的各种条件，以期建立一套稳定的共培养体系。 1. 研究了卵丘细胞单层共培养对牛未成熟卵母细胞体外成熟的影响。结果发现共培养对 A，B 级卵母细胞体外成熟没影响，但能显着提高由 C 级卵母细胞去除卵丘细胞而得到的裸卵的成熟率。 2．研究了不同蛋白质添加物：牛大卵泡液（BFF)、发情山羊血清（OGS）及胎牛血清（FBS）对牛未成熟卵母细胞与卵丘细胞单层共培养成熟的影响。发现叁种蛋白质添加物对卵母细胞体外成熟后体外受精胚的卵裂率没有显着影响，但囊胚发育率以牛大卵泡液组最高（37.6%），显着高于 FBS 组（25.2%）(P<0.05)，OGS 组囊胚率介于 BFF 和 FBS 组之间，但和二者都没有显着差异。 3. 以卵丘细胞为共培养细胞单层，比较了简单培养基 SOFaa、CR1aa 和复杂培养基 TCM199 对牛孤雌胚发育的影响，在这叁种培养基中，牛孤雌胚囊胚发育率分别为 36.08%，32.64%和 11.24%，SOFaa、CR1aa 组囊胚发育率显着高于 TCM199组（P<0.01），并且在 SOFaa、CR1aa 中囊胚孵化率也比在复杂培养基 TCM199中显着提高（P<0.01），说明 SOFaa、CR1aa 等简单培养液较复杂培养液 TCM199更适合做为卵丘细胞与牛体外胚共培养体系的培养液。 4. 比较了不同蛋白质添加物：牛大卵泡液(BFF)、发情山羊血清（OGS）及胎牛血清（FBS）对共培养体系中牛孤雌胚发育的影响，牛大卵泡液和发情山羊血清组囊胚发育率分别为 46.83%和 48.90%，二者没有显着差异，但二者的囊胚率显着高于胎牛血清组的 27.72%（P<0.01）。实验结果显示，牛大卵泡液和发情山羊血清较胎牛血清更能促进牛早期胚胎在卵丘细胞共培养体系中的发育。 5. 研究了不同共培养时期对牛早期胚胎发育的影响。牛胚胎 0～4 d 与卵丘细胞单层共培养组和 1～10 d 共培养组相比囊胚发育率（43.51% VS 48.82%）和囊胚孵化 （65.67 % VS 73.60%）差异都不显着,但都显着高于 4～10 d 共培养组，4～10 d 共培养与对照组（全部培养时间都不用共培养）相比，胚胎囊胚发育率没有显着提高，但囊胚孵化率显着提高（P<0.05）。
丁向彬[7]2005年在《南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精的研究》文中研究指明本研究利用屠宰后南阳牛的卵巢,用抽吸法收集卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞,对所得A、B级卵母细胞进行体外成熟、体外受精及受精卵体外培养研究,筛选出了适合南阳牛体外胚胎生产的培养系统和操作方法,并探讨了相关影响因素。试验结果如下: 1.以TCM199作为成熟培养基础液添加不同组合激素(E_2、FSH+LH+E_2、PMSG+hCG+E_2)进行卵母细胞体外成熟培养。结果表明,添加FSH+LH+E_2组(B组)成熟率及卵裂率(72.5%,52.6%)均显着高于添加F_2组(A组)(47.5%、35.4%)(p<0.05)。添加PMSG+hCG+E_2组(C组)卵裂率(50.6%)显着高于A组(p<0.05)。B、C两组成熟率和卵裂率差异均不显着(p>0.05)。ABC叁组间囊胚发育率无显着差异(p>0.05); 2.成熟培养基础液中分别添加0.6mg/mlBSA、10%FCS、10%OCS进行卵母细胞体外成熟培养。结果表明,添加10%OCS组所得卵母细胞成熟率(73.3%)显着高于添加BSA组(51.7%),(P<0.05)。成熟培养液中添加OCS,FCS所得卵裂率和囊胚发育率都高于添加BSA组,但各组间差异不显着(P>0.05); 3.成熟培养基础液中分别添加0%(对照组,添加10%FCS)、10%、20%、30%BFF进行卵母细胞体外成熟培养。结果表明,卵母细胞成熟率及卵裂率随卵泡液浓度的增加而降低,添加10%和20%BFF组成熟率、卵裂率和囊胚发育率与添加FCS组相比无显着差异(p>0.05)。添加30%BFF组成熟率、卵裂率均显着低于添加FCS组和10%BFF组(p<0.05); 4.卵母细胞经体外成熟培养(18h,22h,26h),成熟率(52.5%,67.5%,70.0%)随培养时间延长逐渐升高,但差异不显着。培养22h所得卵裂率(54.3%)显着高于培养18h组(40.0%)(p<0.05)。囊胚发育率各组间差异不显着(p>0.05); 5.叁种精液洗涤方法用于南阳牛卵泡卵母细胞的体外受精,结果表明上浮法与密度梯度离心法(Percoll法)相比,卵裂率与囊胚发育率均无显着差异(P>0.05)。上浮法所得卵裂率及囊胚发育率(58.3%、25.9%)均显着高于直接离心法(47.2%,13.3%),(P<0.05)。Percoll密度梯度离心法所得卵裂率(60.6%)显着高于直接离心法(P<0.05),囊胚发育率(21.4%)虽然高于直接离心法,但差异不显着(P>0.05); 6.采用BO液,mTyrode's液,TCM199液作为精子的获能基础液对精子进行获能处理,然后进行体外受精。结果表明,BO液与mTyrode's液所得卵裂率及囊胚发育率相比差异均不显着(P>0.05)。BO液和mTyrode's液所得卵裂率(60.1%、59.3%)显着高于TCM199液(48.5%)(P<0.05),囊胚发育率(17.8%、19.6%)高于TCM199液(14.1%),但差异不显着(P>0.05); 7.以叁种精子密度(0.1×10~6/ml、1.0×10~6/ml、10.0×10~6/ml)进行南阳牛的体外受精。结果表明,所得卵裂率和囊胚发育率均无显着差异,但随着精子密度增加,卵裂率有所增加,1.0×10~6/ml组的囊胚发育率(22.7%)高于其它两组(20.6%,17.7%),差异不显着(p>0.05); 8.以TCM199或mSOFaa作为受精卵基础培养液进行受精卵的体外培养。结果表明两种培养系统所得的卵裂率、桑椹胚率和囊胚发育率均无显着差异(p>0.05),虽然mSOFaa系统中的卵裂
张国敏[8]2015年在《PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡闭锁、卵母细胞老化及克隆胚胎发育过程中作用的研究》文中提出在卵泡生长发育过程中,大多数卵泡都发生了闭锁退化,只有少数卵泡能够发育成熟和排卵,如果排出的卵母细胞未及时受精则发生老化,将严重影响后续的发育潜能。线粒体在动物卵泡发育、卵子成熟及其后续胚胎发育的过程中起着重要作用。研究发现,线粒体转录相关因子PGC-1α(过氧化物酶体增生激活受体丫协同刺激因子)和NRF-1(核呼吸因子-1)能协同促进线粒体增殖,对调控线粒体的功能和抵抗氧化损伤有重要的作用,然而关于其调控卵泡闭锁、卵母细胞老化以及体外胚胎发育的研究还比较少。随着辅助生殖技术的发展,对卵母细胞质量的要求越来越高,选择优质胚胎进行移植也显得尤为重要。因此,了解卵泡发育与闭锁的规律、探索卵母细胞老化的分子机制和找出能预测胚胎发育潜能的标记物,对丰富内分泌·生殖生理学和完善辅助生殖技术具有重要意义。本试验主要分为以下四个部分:试验一、PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡发育和闭锁过程中表达变化的研究剥离性成熟山羊卵巢中的卵泡,然后按照不同直径(≤2 mm、2～5 mm和≥ 5mm)和状态(健康和闭锁)分组,通过qRT-PCR和Western blot等方法,初步探索PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡发育和闭锁过程中的表达变化。结果表明:PGC-1α、NRF-1、BCL-2和BAX四个蛋白主要在各发育阶段卵泡的颗粒细胞内表达。随着卵泡的发育(卵泡体积的增大),PGC-1α和NRF-1的表达量(mRNA和蛋白)显着升高(P<0.05)。与健康卵泡相比,闭锁卵泡内雌激素的含量和雌激素/孕酮的比值显着降低(P<0.05),并且PGC-1α和NRF-1的表达量也有降低的趋势,而BAX的表达量与BAX/BCL-2的比值显着升高(P<0.05)。综上所述,在山羊卵泡发育过程中,PGC-1α和NRF-1基因表达模式的改变,可能会导致卵泡闭锁。试验二、PGC-1α和NRF-1调控体外培养山羊颗粒细胞凋亡的研究分离健康卵泡的颗粒细胞进行体外培养,通过干扰或过表达PGC-1α与NRF-1基因,研究PGC-7α与NRF-1对体外培养颗粒细胞凋亡的调控。结果表明:PGC-1α与NRF-1蛋白主要在颗粒细胞的胞质内表达,干扰PGC-1α或NRF-1能显着减少颗粒细胞内mtDNA的拷贝数(P<0.05);减少SOD2、GPx和C471的表达量(P<0.05);增加Caspase 3、Caspase 9和BAX基因的表达量以及BAX/BCL-2的比值(P<0.05);增强细胞内Caspase 3和Caspase 9的活性(P<0.05),改变细胞内BAX和BCL-2的蛋白表达量(P<0.05),并显着增加颗粒细胞的凋亡率(P<0.05)。过表达PGC-1α与NRF-1能在一定程度上抑制颗粒细胞凋亡的发生。此外,流式细胞周期检测发现,干扰或过表达PGC-1α与NRF-1对颗粒细胞周期无显着性影响。综上所述,在体外培养的颗粒细胞中,PGC-1α与NRF-1的表达异常,可能会导致颗粒细胞的凋亡。试验叁、PGC-1α和NRF-1在山羊卵母细胞老化过程中作用的研究首先通过孤雌激活胚胎的发育率和TUNEL凋亡检测判断体外培养卵母细胞老化的时间点(24、30、36、48和60 h),然后在卵母细胞(成熟和未成熟)和卵丘细胞中通过 qRT-PCR 检测目的基因(PGC-1α、NRF-1、HAT1、SNRPN、HAS 3、SMAD2、AAX、BCL-2、HAS 2、STAR和SOD 1)的表达变化,并试图通过卵丘细胞基因的表达变化预测卵母细胞的老化进程。结果表明:随着卵母细胞体外培养时间的延长(24～60 h),孤雌激活的囊胚率显着降低(P<0.05),凋亡的卵丘细胞显着增多(P<0.05)。在成熟的卵母细胞中,PGC-1α、NRF-1和SMAD2基因的表达量随着培养时间的延长(24～36h)而显着降低(P<0.05);HAT1和HAS 3基因的表达量随着培养时间的延长(24-60 h)而缓慢升高。目的基因在未成熟卵母细胞中的表达模式与在成熟卵母细胞中的表达模式相似。另外,在卵丘细胞中,随着培养时间的延长(24～36 h),PGC-1α、SCL-2、H2和>SOD1基因的表达量显着降低(P<0.05),而BAX基因的表达量显着升高(P<0.05)。综上所述,在山羊卵母细胞体外培养过程中,卵母细胞的老化开始于体外培养的第30 h,伴随着卵母细胞的老化,卵母细胞和卵丘细胞的基因表达模式均发生了明显的改变。线粒体相关基因可能是预测卵母细胞质量的潜在分子标记物。试验四、PGC-1α和NRF-1评价山羊转基因克隆胚胎体外发育潜能的初步研究基于以上研究,本试验拟进一步从代谢物质变化角度分析线粒体相关基因与胚胎发育潜能是否存在相关性。因此,本试验以山羊转基因克隆胚胎为研究对象,根据不同的形态标准(高质量:A vs低质量:B)对胚胎进行分组培养,体外发育至囊胚时,收集各组的囊胚和对应的胚胎代谢液进行分析。结果发现,A组的囊胚率显着高于B组(P<0.05)。气相色谱-质谱联用技术分析发现,不同组间代谢液中有多种显着性的代谢差异物,这些物质的变化多与氨基酸和能量代谢相关,而线粒体又是能量代谢中心。因此,本试验进一步分析了线粒体相关基因在克隆胚胎中的表达。qRT-PCR结果发现,在低质量组(B组)的囊胚中,线粒体相关基因PGC-7α和NRF-1的表达量显着降低(P<0.05),BAX/BCL-2的比值显着升高(P<0.05)。这一结果提示:在低质量的胚胎中,PGC-1α和NRF-1的表达异常,可能会导致线粒体的损伤进而影响山羊转基因克隆胚胎的质量。综上所述,结合胚胎的形态评估,找出与山羊转基因克隆胚胎质量密切相关的分子和代谢标记物,为寻找预测胚胎发育潜能的研究提供了参考,将有助于筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的效率。
张志平[9]2006年在《建立牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别的方法》文中研究表明本论文主要研究了体外生产牛胚胎和一种新的牛胚胎性别鉴定方法-环介导恒温扩增法,为胚胎生产积累了宝贵的资料。具体内容包括以下几部分:1.本研究比较了牛卵母细胞成熟时间、卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的分级、雌激素(E_2)浓度以及来源于不同大小卵泡对卵母细胞成熟效率的影响。结果表明:(1)24 h成熟的卵母细胞卵裂率显着高于21 h和27 h,同时囊胚率也显着提高(P<0.05)。(2)A级和B级卵母细胞的卵裂率和囊胚率显着高于C级和D级卵母细胞(P<0.01))。(3)在成熟液中添加1μL/mL E_2(雌激素)后,卵裂率和囊胚率显着高于10μL/mL组(P<0.01),但与对照组差异不显着。(4)采自2～8 mm卵泡的卵母细胞卵裂率显着高于采自小于2 mm组和大于8 mm组(P<0.01),囊胚率也显着高于小于2 mm组(P<0.05),但与大于8 mm组差异不显着。因此,研究认为卵母细胞成熟24 h,细胞胞质和细胞核都已经充分成熟;A级和B级卵母细胞可用做生产体外胚胎;在成熟液中添加1μL/ mL E_2能增加卵母细胞的核成熟率,但是高浓度则抑制胚胎发育;源于2～8 mm卵泡的卵母细胞成熟24 h后受精,适宜胚胎发育,且发育良好。2.研究了在卵母细胞成熟液中,添加来源于不同直径卵泡液[小(<3 mm)、中(3～6 mm)和大(6～12 mm)]的成熟卵母细胞,观察排出极体和胚胎发育情况。发现在成熟液中添加中、大卵泡液能显着提高卵母细胞的第一极体率(P<0.05),而且添加50%大卵泡,还促进了孤雌激活胚胎的发育,但是降低体外受精胚的卵裂率(P<0.05)。说明添加50%大卵泡液(6～12 mm)对卵母细胞胞质成熟有促进作用,但是不利于受精。为了有效提高卵母细胞的成熟率,本试验分两步进行:第一步,于成熟液中添加50%的大卵泡液,让卵母细胞成熟数小时。第二步,于成熟液中添加10%的FBS,再成熟24 h。结果表明,两步成熟法,有效的提高了胚胎的卵裂率和囊胚率,特别是第一步成熟6 h,获得84.7%卵裂率和44.7%的囊胚率(P<0.05)。3.本试验研究了颗粒细胞在体外受精中的作用。结果表明COCs受精率、卵裂率和囊胚率极显着高于裸卵(P<0.01);颗粒细胞和裸卵混合,受精率和囊胚率显着高于(P<0.05)裸卵组;输卵管上皮或颗粒细胞与裸卵混合后受精,二者卵裂率和囊胚率差异不显着;在受精液中添加100 ng/mL孕酮,COCs组卵裂率和囊胚率没有变化,但是裸卵组,受精率和囊胚率有一定程度的提高;COCs在20% O2的卵裂率和囊胚率比在5% O_2有显着的增加(P<0.05),但是裸卵在这两种气相条件下,没有变化。结果表明,颗粒细胞在体外受精中具有独特作用,尤其是与卵母细胞形成复合体的作用更大。分析是因为受精时,颗粒细胞分泌孕酮和增加氧自由基,从而提高受精效率和后期胚胎发育潜力。
武建朝[10]2007年在《利用性成熟前山羊卵泡卵母细胞体外生产胚胎的研究》文中进行了进一步梳理本研究以长江叁角洲白山羊为研究对象，分别研究了羔山羊不同日龄及激素剂量对卵泡发育及卵巢组织学的影响；与成年羊对比，研究了性成熟前山羊卵母细胞体外减数分裂进程；体外培养成熟的卵母细胞进行体外受精，研究了性成熟前山羊卵母细胞卵龄、成熟过程和受精过程中卵丘存在程度对卵母细胞发育能力的影响，并且比较了性成熟前山羊不同直径卵母细胞体外发育能力，进一步就卵母细胞体外受精及受精卵体外培养方案进行了优化，旨在提高性成熟前山羊卵泡卵母细胞体外胚胎生产效率。1．日龄和激素剂量对羔山羊COCs的获得影响显着。FSH处理后45日龄羔羊卵巢可见卵泡数、COCs数及未扩展COCs数均显着高于90日龄(P＜0.05)。45日龄FSH70组卵泡数和COCs数显着高于FSH 40组，但未扩展COCs数低于FSH 40组。FSH70组裸卵比例较高，未扩展COCs数较FSH 40组低。FSH 40组45日龄羔羊平均每只单侧卵巢获得可用卵母细胞23.33±1.53枚，显着高于其它各组(P＜0.05)。切片组织学观察发现：FSH处理对原始卵泡、初级卵泡的直径影响不显着，但对卵子直径影响显着，均属正常卵子直径范围内(130～150μm)。FSH 40处理组生长卵泡数明显高于FSH70处理组，其中FSH 70组卵泡较FSH 40组大。2．成年山羊和性成熟前山羊卵母细胞体外成熟过程中减数分裂各时相出现时间不同。在整个体外成熟培养过程中，性成熟前山羊卵母细胞GV期存在时间较长(7.21h)，在成熟培养23.96h后才能进入MⅡ期；成年羊卵母细胞GV期存在时间相对较短(2.94h)，大约在成熟培养20.64h后，进入MⅡ期。体外成熟培养24h和27h，成年羊卵母细胞成熟率差异不显着，但是性成熟前山羊卵母细胞成熟率差异显着(P＜0.05)。与成年山羊相比，羔山羊卵母细胞孤雌发育能力较差，可能与其卵母细胞本身成熟缺陷有关。3．体外成熟24h、27h和30h，性成熟前山羊卵母细胞受精率、卵裂率差异不显着(P＞0.05)，但显着高于21h组(P＜0.05)。成熟24h和27h卵母细胞桑椹胚囊胚率显着高于成熟21h和30h组(P＜0.05)。4．去除卵丘的卵母细胞和裸卵体外培养可以成熟，但受精率、卵裂率、桑椹胚囊胚率显着低于带卵丘的卵母细胞(P＜0.05)。成熟前机械去除卵丘严重影响性成熟前山羊卵母细胞发育能力。1～3层和多层卵丘的卵母细胞受精率、卵裂率、桑椹胚囊胚率差异不显着(P＞0.05)。5．性成熟前山羊卵母细胞受精前卵丘存在程度对其受精率和卵裂率影响不显着(P＞0.05)，但受精前完全去掉卵丘严重影响胚胎后续发育能力，桑椹胚囊胚率显着低于带卵丘的卵母细胞。卵丘完整组与部分卵丘去除组卵母细胞体外发育能力差异不显着。6．性成熟前山羊卵母细胞GVBD发生率及成熟率随其直径的增加而显着增加。成熟培养0h，直径＜110μm卵母细胞GV期比例显着高于其它各组。随着卵母细胞直径的增加，GVBD发生率也增加。成熟培养27h，直径＞135μm组MⅡ期比率(75.00％)显着高于其它组(P＞0.05)，其中直径＜110μm组卵母细胞体外培养不能达到MⅡ期。7．性成熟前山羊卵母细胞受精率、卵裂率随其直径的增加而显着提高(P＜0.05)。卵母细胞直径＜110μm、110～125μm、125～135μm组桑椹胚囊胚率差异不显着(P＞0.05)，但显着低于直径＞135μm组(P＜0.05)。8．TALP液较BO液更适合性成熟前山羊卵母细胞体外受精所用。9．SOFaa较CRlaa更适合性成熟前山羊早期胚胎体外培养所用。
参考文献：
[1]. 山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究[D]. 吕丽华. 山西农业大学. 2004
[2]. 颗粒细胞、卵泡液对山羊卵泡卵母细胞体外成熟、体外受精的影响[D]. 李亚东. 扬州大学. 2001
[3]. 牛体外成熟卵母细胞与性控精子体外受精的研究[D]. 马学海. 石河子大学. 2007
[4]. 优化牛体外生产胚胎体系的研究[D]. 张金花. 新疆农业大学. 2007
[5]. 南阳黄牛小腔卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精研究[D]. 郑培栋. 河南农业大学. 2007
[6]. 卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响[D]. 王勇胜. 西北农林科技大学. 2004
[7]. 南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精的研究[D]. 丁向彬. 河南农业大学. 2005
[8]. PGC-1α和NRF-1在山羊卵泡闭锁、卵母细胞老化及克隆胚胎发育过程中作用的研究[D]. 张国敏. 南京农业大学. 2015
[9]. 建立牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别的方法[D]. 张志平. 西北农林科技大学. 2006
[10]. 利用性成熟前山羊卵泡卵母细胞体外生产胚胎的研究[D]. 武建朝. 南京农业大学. 2007
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