孙锋[1]2006年在《Bt蛋白试剂盒的制备及抗虫棉Bt蛋白时空表达的研究》文中认为转Bt基因抗虫棉在我国应用最广，它对鳞翅目害虫具有较强的抗性。利用基因工程技术转入棉花中的Bt基因可以在棉花各组织器官中高效表达，合成对鳞翅目害虫具有高效毒杀作用的Bt蛋白。但若在生产上仍用常规栽培管理法，品种的产量潜力就不能正常发挥，甚至在不同的生态棉区造成产量显著降低。本文以市售Bt杀虫粉剂为原料，纯化、结晶出高纯度的Bt晶体蛋白，依此得到Bt蛋白抗体，制备出Bt蛋白试剂盒，并对转Bt基因抗虫棉与常规非抗虫棉进行了棉花在不同时空的抗虫性研究，旨在为抗虫棉的检测提供快速、有效的检测方法，并为抗虫棉的田间管理提供理论基础。其研究结果如下：1．以市售的Bt蛋白粉剂为原料，采用碱解、层析和乙醇沉淀的生物化学的方法提取纯化Bt晶体蛋白。结果表明，在pH10.5时，碱解程度最高，采用60％饱和度的硫酸铵沉淀可以去除大多数的多糖，G-50层析柱将Bt蛋白(130KD)与其他蛋白分开，上清用1.2-1.5倍的95％乙醇沉淀，即可得到晶体状Bt蛋白，冻干称重，得率为1.338g／KgBt蛋白粉剂。考马斯亮蓝法测定蛋白纯度为91％，SDS-PAGE测定晶体蛋白的分子量为130KD。2．采用实验室饲养棉铃虫的方法，棉铃虫的初孵虫、一铃虫、二铃虫48小时的死亡率为100％，三铃虫48小时的死亡率为88％，四铃虫48小时的死亡率为76％，生物活性达18000IU／mg。3．实验用2Kg重的新西兰大白兔，采用免疫学制备抗体的方法，由兔血清以饱和硫酸铵沉淀提取蛋白，再以A—50层析后，加冷的95％乙醇沉淀制备抗体，所得抗体的滴度为32(琼脂凝胶扩散法)，完全可作为试剂盒使用(要求滴度不低于16)。4．所制备的Bt蛋白试剂盒与进口的Agdia试剂盒做实验对比，结果表明：自制试剂盒Bt蛋白浓度线性范围为1750～28000 ng·ml~(-1)，而Agdia试剂盒Bt蛋白浓度线性范围为2250～36000 ng·ml~(-1)，可见自制试剂盒检测灵敏度比Agdia试剂盒的检测灵敏度稍高，但检测范围比Agdia试剂盒稍窄。自制试剂盒的精确度稍差，稳定性不是很好，有待进一步实验探索。5．对转Bt基因抗虫棉与非抗虫棉在不同时间和不同的器官进行取样，用自制的Bt蛋白试剂盒检测(棉花叶取主干茎叶)，结果显示，同一时期，同一棉株上，倒1叶Bt毒蛋白含量较低，倒2叶较高，倒3叶最高，而倒5叶较倒3、4叶又有所下降，表明Bt基因在叶片中的表达产物随叶龄的变化而变化。在不同的生长时期，随着幼苗的生长，Bt蛋白的表达量也随之增加，均可达到抗虫的最低限度，特别是蕾期和结铃期，棉花叶中的Bt蛋白含量最高，但到吐絮期以后，Bt蛋白的表达量逐渐降低，棉花叶中的Bt蛋白含量最低，已经低于抗虫所要求的最低限度，不同生长时期棉花叶Bt蛋白表达趋势为：初花期＞蕾期＞花铃期＞苗期＞吐絮期。9种组织对棉铃虫初孵幼虫的抗性顺序为：功能叶＞嫩叶＞幼蕾＞幼铃＞幼叶＞花瓣＞花蕊＞苞叶＞老叶。6．同一位置不同时期的棉花叶子(倒2叶，完全展开功能叶)，经ELISA检测结果显示：抗虫棉在生长初期，棉花叶子中Bt蛋白的表达就开始活跃，随着棉株的不断生长，抗虫棉的表达能力也逐步加强，到棉花的蕾期、花期达到最高点。但到了絮期以后，抗虫棉的表达量又开始快速下降，后期对Bt蛋白的表达水平远远低于抗虫棉生长初期的该蛋白表达平均水平。
王保民[2]2000年在《Bt毒蛋白免疫检测试剂盒的制备及应用》文中指出本文从苏云金杆菌HD—1、HD—73、304A(b)于171K EM~+三个菌株经发酵培养制备了胞晶混合物，胞晶混合物经液体双向法分离出伴胞晶体，伴胞晶体经等电点沉淀纯化出CryIA、CryIA(c)、CrylA(b)三种杀虫晶体蛋白。用CryIA、CryIA(c)、CryIA(b)杀虫晶体蛋白制备出三种兔抗血清，其中抗CryIA的双扩效价为1／32，抗CryIA(c)、CryIA(b)的双扩效价为1／16。三种抗血清的ELISA效价分别为＞1／100000、＞1／100000、＞1／100000。抗血清经辛酸—硫酸铵法沉淀，再用离子交换柱纯化后，分别用生物素和辣根过氧化物酶标记。用CryIA杀虫晶体蛋白免疫小鼠制备单抗，筛选出了11个单克隆株系。在用样品进行抗体特异性检测后，仅有一个单克隆株系B4E6D8和抗CryIA、CryIA(c)多抗的特异性高，用所纯化和标记的抗体建立了三种检测转Bt基因抗虫棉花的毒蛋白检测试剂盒，检测极限均达到1个ng／ml以下。用所制备的试剂盒对中国农科院植保所、中国农科院棉花所、南京农业大学、邯郸市农科院棉花所的大量抗虫棉花样品进行了盲测，所有测定都正确找出了阴性对照，阳性测定结果与田间表现完全一致。本试剂盒的质量完全达到了国际同类水平，其开发成功，对于我国的抗虫棉花、玉米、水稻的杂交育种工作提供了强有力的手段。对转Bt作物的安全运用以及种子质量监测都会起到巨大的作用。
郭艾英[3]2006年在《应用ELISA检测转基因棉花中Bt蛋白的研究》文中进行了进一步梳理本论文以转Bt(Bacillus Thuringiensis)抗虫基因的所表达的杀虫晶体蛋白为检测目标，建立了双抗夹心酶联免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测转基因棉花中表达的Bt Cry1Ac基因型蛋白。 抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素。该实验比较两种液体培养基(1／2LB、1／2NB)，两种培养条件(28℃，150r／min和28℃，200r／min)对三种苏云金芽孢杆菌(HD-1、HD-2、HD-73)进行培养，经碱液裂解后比较等电点沉淀和高速离心方法提取Bt蛋白的产量和纯度。实验得出三种菌体在1／2NB培养基，28℃，200r／min培养三天，蛋白产量均较高，高速离心得到的蛋白收率低于等电点沉淀法，但其纯度较高，满足作为抗原的条件，因此本实验选用了HD-73菌株经高速离心方法得到的特异产Bt Cry1Ac的蛋白作为抗原。 在抗体的制备中选用将蛋白直接溶于液体缓冲液中直接进行免疫和将蛋白电泳后切下蛋白带进行免疫大白兔。结果表明，切胶免疫的大白兔其免疫反应较溶液免疫的强烈，但抗血清效价较低。实验中选择了溶液免疫得到的抗体作为第一抗体，将抗体与常用的腊根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记得到第二抗体即酶标抗体，从而建立了抗体-抗原-酶标抗体的双抗夹心ELISA方法，其检测限为0.005μg／mL，线性范围为0.015-0.25μg／mL。在与其它5种Bt Cry蛋白(Cry1C、Cry2A、Cry3A、Cry3Bb1、Cry9C)没有交叉反应。 在检测六种棉花样品(GK-12、GK-22、NON、抗虫棉、双价棉、石远321)时，采用了三种提取缓冲液(Tris-硼酸、Na_2CO_3缓冲液、PBST)提取样品中的Bt蛋白，得出Tris-硼酸缓冲液是较佳的Bt蛋白的样品提取缓冲液。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法来验证所建立的ELISA实验检测样品结果的正确性和可行性，选用了常用的花椰菜花叶病毒的35S(Cauliflower Mosaic Virus，CaMV-35S)、Cry1Ab+Cry1Ac、Cry1Ac(检测基因)和18S rRNA(内参基因)的特异性引物对六种棉花样品中的DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明GK-12、GK-22、抗虫棉、双价棉和石远321为转Bt Cry1Ac基因棉花，NON为非转基因棉花。
顾炜炜[4]2007年在《Bt蛋白酶联免疫分析技术研究》文中提出转基因作物由于具有抗虫害、抗除草剂等优良品质，目前在一些国家已大规模商品化生产。随着人们对转基因食品安全性认识的不断深入，各国在积极发展转基因技术的同时，加强了对转基因产品的监控和管理。中国和世界一些国家采用了转基因产品标识制度，因此研发转基因成分的快速检测技术具有重大实际意义。本研究以转抗虫基因产品中的表达产物—Bt杀虫晶体蛋白作为研究对象，利用免疫分析技术，建立了定量检测Bt系列蛋白的直接竞争ELISA检测技术，并研制其产品，为转基因产品的快速、大批量检测和基因标识制度提供了技术支撑。本研究利用Bt(BtCrylAc、BtCry2Aa／2Ab)蛋白作为免疫原免疫小鼠制备了多克隆抗血清，并通过饱和硫酸铵盐沉淀法进行纯化，其效价分别为52000和50000(间接非竞争ELISA方法)，与不同Bt蛋白交叉反应率均小于0.3％，亲和常数(K)均大于10~9，符合建立ELISA分析技术的质量要求。采用改良的过碘酸纳简易法对Bt蛋白进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，经紫外分光光度法鉴定，结果表明：两种抗原(BtCrylAc、BtCry2Aa／2Ab)的标记率分别为0.52和0.65，克分子比分别为1.29和0.9。在进一步进行包被条件、抗体(抗血清)和酶标抗原工作浓度优化的基础上，建立了Bt蛋白的直接竞争ELISA检测技术，并进一步研制了直接竞争ELISA试剂盒，结果如下：(1)BtCrylAc蛋白直接竞争ELISA检测技术及产品：测定范围为50ng／ml～1600ng／ml，灵敏度为50ng／ml；添加回收率在95.56～102.27％之间，平均回收率为98.74％，与间接ELISA方法测得的结果无显著差异；试剂盒的板内变异系数在2.25～7.20％之间，平均变异系数为4.78％，板间变异系数在2.62～10.21％之间，平均变异系数为6.71％；试剂盒在4℃下可保存6个月以上。(2)BtCry2Aa／2Ab蛋白直接竞争ELISA检测技术及产品：测定范围为40ng／ml～1750ng／ml，灵敏度为40ng／ml；添加回收率在96.56～98.52％之间，平均回收率为97.33％，与间接ELISA法检测结果也无显著差异；试剂盒的板内变异系数在1.55～7.17％之间，平均变异系数为3.36％，板间变异系数在3.78～7.39％之间，平均变异系数为5.45％；试剂盒在4℃下可保存6个月以上。
佚名[5]2004年在《转Bt与CpTI基因抗虫作物免疫检测试剂盒的制备及应用》文中研究指明第一完成单位:中国农业大学作物化学控制中心(北京市圆明园西路2号,邮编:100094)针对我国转Bt与CpTI基因抗虫作物迅速发展,但其检测与评价技术缺乏的实际情况,进行了免疫检测试剂盒的研究,取得了如下结果:1.从苏云金杆菌HD-1中提取纯化了CryI
杨影丽[6]2013年在《Bt基因玉米转化体目标蛋白表达效应研究》文中提出转Bt抗虫基因玉米是全球商品化最快的抗虫转基因作物之一，它通过转入苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白基因使玉米自身产生抗虫蛋白，对靶标害虫欧洲玉米螟有很好的控制作用。目前，越来越多转Bt基因作物如抗虫棉、抗虫玉米等在全球大规模商业化的种植，其对生态环境及土壤生态系统的风险评价备受关注。本研究的出发点旨在探讨大田自然条件下转Bt基因玉米不同转化体之间Bt蛋白表达差异性，以及同一转化体中不同生育期及不同器官Bt蛋白表达的动态规律，并对转Bt基因抗虫玉米土壤微生物类群的结构和功能多样性的动态变化进行了分析，为现阶段转Bt基因玉米生态安全风险评价提供理论参考依据。主要研究内容有：2011年和2012年，在河南省农业科学院现代农业研究开发基地种植转Bt基因玉米，于苗期、拔节期、抽穗期、灌浆期、完熟期采样，选用以玉米杂交种PA×PB幼穗为受体经农杆菌介和基因枪介导法获得的转Bt基因玉米，及其亲本非转基因玉米PA×PB作为对照。研究大田自然状态下转Bt基因玉米对土壤微生物群落结构和功能的影响，以及各生育期转基因玉米植株不同器官组织Bt蛋白的表达量。主要研究方法为传统微生物分离培养法、Biolog微平板法和酶联免疫法。（1）利用酶联免疫法测定转Bt基因玉米Cry1Ab和Cry1Ac两种蛋白表达的时空动态规律，以及对其所占可溶性总蛋白比例进行了测定，并对植株各组织器官外源Bt蛋白含量进行了相关分析。结果表明：不同地区不同转化事件Bt蛋白的表达量不同；同一转基因事件的不同植株间表达量有所不同，差异明显；相同的生育期内，同一植株不同组织器官Bt蛋白的表达量差异显著，叶片外源基因蛋白表达量比较高，苞叶最低；玉米发育不同生长阶段，Bt蛋白在叶片中的表达量不同，蛋白表达量随着玉米的生长周期的延伸呈上升趋势，杀虫蛋白表达的时段性跟玉米的生育期有关。（2）在ELISA测定转Bt基因玉米生育期内根际土壤Cry1Ac蛋白含量的变化趋势为从苗期增加到灌浆期达到峰值后有所下降，而蛋白表达量极低。在此基础上，利用传统培养法，培养测定种植转Cry1Ac基因玉米材料和非转基因玉米土壤中三大类可培养微生物细菌、真菌和放线菌的数量和种类的变化，并采用纸片扩散法对其土壤进行抑菌圈测试。研究发现：转基因玉米土壤微生物量较非转基因玉米无显著增加（P>0.05）；真菌、细菌和放线菌菌落的数量和种类并未发生明显变化，表明转Bt基因玉米种植对土壤微环境未有显著的影响。从土壤微生物的垂直分布上看，5cm、10cm、15cm不同深度土壤剖面微生物数量有所差异，样本中以10cm层微生物数量最多，层次间差异有显著（P<0.05）。同时，纸片扩散法抑菌圈实验表明：Cry1Ac蛋白液在细菌、真菌、放线菌的培养基上均成阴性，对土壤可培养微生物无抑制作用。（3）利用Biolog法研究转Bt基因玉米土壤微生物的总体代谢活性和碳源代谢模式的多样性，并结合转Bt基因玉米不同生育期土壤微生物多样性的变化，综合分析转基因作物表达的外源毒蛋白对微生物的影响。结果表明：通过对玉米各生育期的土壤微生物培养，发现在玉米的整个生长过程中，与非转基因玉米相比，在灌浆期和完熟期转基因玉米种植对根际土壤微生物群落碳源利用能力（AWCD）、Shannon指数、Simpson指数的影响均不显著（P>0.05），而在拔节期根际土壤微生物群落碳源利用能力显著升高（P<0.05）；综合分析表明转基因与非转基因之间无显著差异，而生育期差异明显。
汪洋[7]2012年在《转Bt基因稻谷对小鼠安全性的影响》文中指出本项研究以转Bt基因的抗虫水稻作为实验饲料,而非转基因水稻为对照饲料,分别喂养昆明小鼠30天、90天,并进行如下实验,进而明确转Bt基因水稻对小鼠体内的解毒机制、凋亡情况以及免疫调节的影响,最终为该系列转基因食品在哺乳动物体内的安全性评价提供参考依据。1.运用ELISA酶联免疫技术,发现组间昆明种小鼠血液中解毒酶酶活随CrylAb蛋白进食时间的延长并无显著性变化。2.血清生化指标中,30天处理组的小鼠血液中UREA、TG、AST、ALP口ALT五个指标显著高于对照组(P<0.05),而90天组间并无显著差异；血相指标均无显著差异。3.采用流式细胞术(FCM)分析处理组与对照组间血淋巴细胞的凋亡程度和钙离子流动变化且均无显著影响。4.解剖鼠体,观测脏器病变、脏体系数并对其各脏器的四种解毒酶酶活进行检测。结果发现,90天处理组小鼠的肾脏SOD酶活与对照组间存在显著性差异(p<0.05),其余均无较大影响。研究证实,转Cryl Ab基因水稻所含的杀虫蛋白可能由于含量微小不足以激发血液代谢酶的解毒机制而且对其血液淋巴细胞没有明显的影响。尽管饲喂早期对小鼠肝脏等免疫器官可能产生了一定的影响,但90天后小鼠通过机体酶活代谢的调节使血生化指标恢复正常,缓解了转Bt稻谷对小鼠免疫系统和神经系统的影响。然而,小鼠体内的调解途径的机制如何,尚需要进一步的研究与探索。
张亚玲[8]2017年在《Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫棉的抗虫性鉴定及新Bt(Cry1C*)基因在棉花上的遗传转化》文中研究指明据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计,从1996年到2015年的20年间,全球转基因作物累计种植面积达到20亿公顷,其中,转基因棉花累计种植面积达3亿公顷。转基因作物为农户及消费者带来的利益不言而喻。转Bt基因抗虫棉的应用及推广有效地解决了棉铃虫害对棉花生产的影响。随着研究的不断深入,发现其存在几个问题:一方面,Bt基因在棉花体内的表达存在时空差异;另一方面,目前抗虫棉花品种选育普遍采用的方法是利用获得转基因应用安全证书的品种作供体,与非转基因棉花杂交,转Bt基因抗虫棉品种间Bt蛋白表达量差异较大,尤其是其杂交后代Bt蛋白的表达量差异很大,对棉花的抗虫育种造成很大困难;第三,抗虫基因单一,现有的抗虫基因主要用于防治鳞翅目的棉铃虫(Helicoverpa armigera)和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella),使得棉田其他害虫如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(Prodenia litura)、玉米螟(Pyrausta nubilalis)等对棉花的危害逐渐加重,其中,甜菜夜蛾于2001年被列入重要害虫的潜在爆发名单。本研究测定了不同抗虫棉花品种、不同遗传背景棉花品种杂交F_1代及不同熟性棉花品种杂交F_1代棉花Bt蛋白表达量的差异,探究Bt基因在棉花中的表达及遗传规律,为抗虫棉的育种工作提供理论依据;在保证Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)基因继续发挥作用的同时,尝试将Cry1C*基因转入棉花,研究其对棉花害虫的控制效果,保证抗虫棉花的健康发展。主要结论如下:1)连续两年对6个不同抗虫棉花品种不同组织器官中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量进行测定及室内生物测定,结果表明:不同棉花品种间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量及棉铃虫幼虫校正死亡率均存在显著差异,其中冈383和鲁6269两个棉花品种Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量和棉铃虫幼虫校正死亡率均较其他几个品种高,Cry1Ab/Cry1Ac蛋白在不同品种组织中的表达规律大体相同:苗期叶片>蕾期叶片>铃期叶片>蕾期小蕾>铃期小铃;2)不同遗传背景棉花杂交F_1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但与抗虫亲本相比,F_1代显著低于抗虫亲本;二代、三代棉铃虫幼虫校正死亡率在不同杂交组合间存在显著差异,说明遗传背景对棉花的抗虫性有影响。3)不同熟性棉花品种杂交F_1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但F_1代Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量显著低于抗虫亲本鲁6269;棉花熟性与各组织中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量、棉铃虫幼虫校正死亡率均不存在显著的相关性,说明棉花的熟性对其抗虫性没有显著的影响。4)得到转Cry1C*基因棉花T_0代2株(能收到种子的),后续的转化工作仍在继续,T_1代阳性植株22株,初步筛选到Cry1C*-5-7、Cry1C*-5-8、Cry1C*-5-14三个Cry1C*蛋白表达量较高,抗虫性好的植株。
顾炜炜, 潘家荣[9]2007年在《Bt蛋白免疫检测技术研究进展》文中进行了进一步梳理在商用转基因大豆、玉米中,转Bt基因占绝大多数,由于目前越来越多的国家要求对转基因产品实行标签制度,因此转Bt基因成分的快速检测对进口转基因国显得非常重要,本文对Bt蛋白的一种快速检测技术-免疫检测技术的研究进展进行综述。
吴瑞华[10]2007年在《土壤中苏云金杆菌HBF-1菌株毒蛋白ELISA检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理本文以在我国分离获得的对丽金龟科幼虫高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)HBF-1为供试菌株，以其产生的杀虫晶体蛋白为检测目标，通过制备的抗Bt蛋白多克隆抗体，建立了土壤中HBF-1菌株毒蛋白含量的酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定方法。抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素。为了得到高纯度的杀虫晶体蛋白，本研究采用等电点法沉淀出晶体杀虫蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化粗提的杀虫晶体蛋白，得到分子量约为130kDa的电泳纯杀虫晶体蛋白，作为免疫用抗原。利用该抗原分四次对新西兰白兔进行免疫，获得了高特异性的抗血清，再用辛酸—硫酸铵盐析法，获得了高免血清中的免疫球蛋白IgG，SDS-PAGE电泳结果表明，提取的IgG纯度较高，其浓度达到5.6344mg／mL。采用改良的过碘酸钠法，用辣根过氧化物酶标记IgG，制备出标记率为0.28，克分子比为0.798的酶标抗体。通过利用直接法、间接法和双抗夹心法等ELISA方法检测土壤中Bt毒蛋白的含量，综合样品检测值的相关系数CV，EC_(50)及检测率三个方面，明确双抗体夹心ELISA法均优于其它两种方法，间接ELISA法次之，从而证明双抗夹心法是一种检测土壤中Bt毒蛋白含量较适宜的方法。明确了双抗体夹心ELISA法的最佳工作条件：抗体的包被量为7μg／mL；Bt杀虫晶体蛋白的3种提取液(Tris—硼酸、Na_2CO_3缓冲液、PBST)中，以Na_2CO_3缓冲液为最佳提取液；封闭液为0.1％明胶-PBST；酶标抗体的最适工作浓度为1：800稀释；待测样品的反应时间为37℃120min；酶标抗体的时间为37℃60min；底物显色时间为室温15min。通过对该ELISA法的特异性试验、交叉性试验和重复性试验验证，证明双抗体夹心ELISA法是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法。利用优化的双抗夹心ELISA系统检测花生田里Bt蛋白的消长动态，结果表明利用双抗夹心ELISA法定量测定土壤中Bt蛋白的量能够明确反映出土壤中Bt毒蛋白含量的动态变化情况。在播种期施入Bt毒蛋白，原液及2倍稀释液土深20cm的处理在3d时达到最大含量，随后为平缓下降的趋势；原液和2倍稀释液土深2cm的处理在3d时蛋白含量上升，随后下降，在21d时检测量达到最高峰，随后下降至134d检测结束，在此过程中3～14d深土层20cm的蛋白含量明显高于浅土层2cm，随后除2倍稀释液21d、31d时有所例外，其余各处理均为深土层蛋白量高于浅土层。在开花前期施入Bt毒蛋白，四处理的蛋白含量3d达到最高，随后原液和2倍稀释液土深20cm的处理急剧下降，原液和2倍稀释液土深2cm的处理下降平缓。在开花后期施入Bt毒蛋白，四处理蛋白含量3～7d达到最高，随后呈平缓下降的趋势。因此，在不同施药时期，各处理深土层20cm的Bt蛋白量高于浅土层2cm。总之，在花生开花前期和开花后期进行灌根施药，土壤中Bt蛋白表达高峰期即为铜绿丽金龟(Anomala corpulenta Motschulsky)卵高峰期和幼虫一龄期、二龄初期，能够对金龟子幼虫达到最佳防治效果。
参考文献：
[1]. Bt蛋白试剂盒的制备及抗虫棉Bt蛋白时空表达的研究[D]. 孙锋. 安徽农业大学. 2006
[2]. Bt毒蛋白免疫检测试剂盒的制备及应用[D]. 王保民. 中国农业科学院. 2000
[3]. 应用ELISA检测转基因棉花中Bt蛋白的研究[D]. 郭艾英. 天津科技大学. 2006
[4]. Bt蛋白酶联免疫分析技术研究[D]. 顾炜炜. 中国农业科学院. 2007
[5]. 转Bt与CpTI基因抗虫作物免疫检测试剂盒的制备及应用[J]. 佚名. 农业科技通讯. 2004
[6]. Bt基因玉米转化体目标蛋白表达效应研究[D]. 杨影丽. 河南师范大学. 2013
[7]. 转Bt基因稻谷对小鼠安全性的影响[D]. 汪洋. 湖南农业大学. 2012
[8]. Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫棉的抗虫性鉴定及新Bt(Cry1C*)基因在棉花上的遗传转化[D]. 张亚玲. 华中农业大学. 2017
[9]. Bt蛋白免疫检测技术研究进展[J]. 顾炜炜, 潘家荣. 食品工业科技. 2007
[10]. 土壤中苏云金杆菌HBF-1菌株毒蛋白ELISA检测方法的建立及应用[D]. 吴瑞华. 河北农业大学. 2007
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