王明[1]2010年在《免疫抑制剂及凋亡细胞诱导移植免疫耐受的实验研究》文中认为研究背景：器官移植是目前治疗器官终末期疾病的最有效的治疗措施,但是移植术后的排斥反应仍是阻碍患者和移植物长期存活的主要原因,传统免疫抑制剂的应用虽然能够有效地抑制急性排斥反应,但是在移植物的慢性排斥方面仍是不能解决其根本原因,并且长期服用免疫抑制剂会增加患者感染、中毒、肿瘤等疾病的发生率,且费用昂贵。因此,解决器官移植术后排斥反应的关键在于诱导受者对供者移植物的免疫耐受,免疫耐受是机体免疫系统在接触某种抗原后所产生的对该抗原的特异性免疫无应答状态,一旦此种免疫无应答状态形成后便无需任何免疫抑制剂维持,从而从更本上解决移植后的排斥反应,达到移植物与宿主能够长期共存的目的。但是,目前摆在移植免疫学界的难题就是如何才能够诱导受者的移植免疫耐受?据此孙尔维等人提出了利用供体凋亡细胞诱导受者免疫耐受的假说。该假说认为凋亡细胞能主动性地调节机体的免疫功能,凋亡细胞通过给其APC主动性地传递吞噬信号"eat me signal"使得吞噬细胞能够快速摄取凋亡细胞并将其所携带的供者抗原被特异性地浓集与受者APC内,从而短时间内提供大量供者MHC抗原,有效地被受者APC提呈给T细胞,最终促进调节性T细胞(Treg)的产生,抑制辅助性T细胞的产生来诱导机体的免疫耐受。国外Fsdok等人也发现巨噬细胞大量吞噬凋亡细胞时,可以抑制一些炎性因子的分泌,促进了TGF-β、IL-10等一些免疫调节因子的产生。Voll等人发现在细菌脂多糖刺激外周血淋巴细胞的反应中加入凋亡细胞不仅能够抑制IL-2、IL-1B、TNF-α等炎性因子的分泌,而且能够促进免疫抑制因子IL-10的产生。本课题组已经成功建立了供者凋亡细胞预输注诱导小动物心脏、肝脏移植免疫耐受模型,但是单纯输注凋亡细胞对大动物的移植模型诱导免疫耐受的作用并不明显,同样,国内外众多学者对诱导成年大动物移植免疫耐受进行了多次尝试,均没有理想的结果,但是凋亡细胞联合免疫抑制剂对大动物移植免疫耐受的诱导实验尚未见报道。目前就如何建立成年大动物和临床诱导免疫耐受已经成为了移植免疫学界的主攻方向和目标。因为大动物免疫系统比较复杂,排斥反应强烈,且购买及饲养价格都比较昂贵,故本课题欲先采用小鼠建立皮肤移植模型,小鼠皮肤移植模型排斥反应较为强烈,并且小鼠免疫系统简单,易操作,费用较为低廉,给受者小鼠预输注凋亡细胞并联合低剂量的免疫抑制剂诱导其免疫耐受,并通过检测其在不同免疫抑制剂作用下的全血中细胞因子的变化来探讨其机制和原理,为下一步大动物和临床诱导免疫耐受做一个探索性研究。本课题为国家自然科学基金(供者凋亡细胞诱导移植免疫耐受的机制)资助项目。本实验利用同种异基因小鼠皮肤移植作为移植模型,皮肤移植是目前可行的器官移植中排斥反应最为强烈的模型,因观察周期短,操作简便,手术成功率高,可控性强等诸多优点而被广泛应用于移植模型的建立；凋亡细胞的制备有多种方法,目前一般采用紫外线照射、抗体诱导、化疗药物诱导、射线诱导、激素诱导等方法,本实验采取地塞米松药物诱导法。地塞米松作为糖皮质激素类药物具有调节细胞生长、发育、死亡以达到维持机体组织细胞平衡稳定的作用。地塞米松诱导淋巴细胞及其它免疫细胞的凋亡较其它方法稳定、易操作已有较多文献报道。第一部分地塞米松诱导供体胸腺细胞的凋亡的初步研究目的：摸索使用地塞米松作为诱导剂对小鼠胸腺细胞凋亡的诱导作用,为下一步实验找到一种稳定性高、可控性强、凋亡率高的诱导方法。方法：将健康成年小鼠胸腺研磨制成细胞悬液,用血球计数板计数后用RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清)调整细胞浓度为1×106／ml,将所获细胞分装进4个培养皿中进行不同处理：一组置于紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后5%C02孵箱37℃恒温培养4小时。另外叁组分别加入浓度为1×10-7M、2×10-5M、2×10-3M的地塞米松后置于5%CO2孵箱37℃恒温培养6小时；将处理后的四组胸腺细胞悬液用Annexin V-PI试剂双染后,用流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡和坏死。结果：1、不同浓度地塞米松处理后的小鼠胸腺细胞凋亡率略有不同,经1×10-7M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,用流式细胞仪检测其凋亡率为53.72%；经2×10-SM浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,检测其凋亡率为58.46%；经2×10-3M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞后,测得其凋亡率为55.72%。2、在紫外线灯下20cm处直接照射15分钟后用5%CO2孵箱37℃恒温培养4小时后的小鼠胸腺细胞,测得其凋亡率为50.29%,；结论：用地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程复杂、耗时较长,而紫外线照射法操作简便、耗时短。但是用地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡率要高于紫外线照射法,且坏死细胞较少,结果稳定,容易控制,因2×10-5M浓度的DEX处理BALB/C小鼠胸腺细胞凋亡率最高,故下一步实验给受者小鼠注射凋亡细胞采取2×10-5M浓度的地塞米松诱导。第二部分免疫抑制剂及凋亡细胞对诱导小鼠皮肤移植免疫耐受的试验研究目的：探索供体凋亡细胞与免疫抑制剂对小鼠皮肤移植免疫耐受的作用方法：1、制备供体小鼠的胸腺凋亡细胞：采用研磨法获得供者小鼠的胸腺淋巴细胞悬液,经2×10-5M DEX处理后放入5%C02孵箱37℃恒温培养6小时后,获取供体小鼠的胸腺凋亡细胞用Annexin V-PI试剂双染后,流式细胞仪检测胸腺细胞的凋亡率；2、实验分组：将受者小鼠随机分为四组：PBS对照组、凋亡细胞组、雷帕霉素(RAPA)组、RAPA+凋亡细胞联合组。输注供体胸腺凋亡细胞组别的受者小鼠分别在术前7、3、1天经阴茎背静脉输注供体小鼠的凋亡细胞悬液；接受药物处理的受者小鼠在术前3天开始灌胃给予RAPA药物,1次／d,直到所有移植皮片完全坏死时停药；3、建立小鼠背对背皮肤移植模型：将修好的供者小鼠背部皮片采用6-8针间断垂直褥式外翻缝合固定在受者小鼠背部,盖上无菌敷料后创可贴加压包扎；4、术后观察：在行皮肤移植术后第5天打开包扎观察移植皮片存活情况,若植皮与宿主的背底部愈合,色泽一致,无炎症和充血,有毛的皮肤毛发生长良好,则认为未发生排斥反应.50%以上皮片结痂、变硬、坏死、脱落作为排斥标准。结果：1、自体皮肤移植(手术控制组)45例,皮片存活时间>1月的存活率为95%(43／45)；2、受者小鼠术前分别预输注一次、两次、叁次凋亡细胞比较移植皮片存活时间没有统计学差异P>0.05,但是输注叁次凋亡细胞的受者小鼠移植皮片存活时间呈明显延长趋势；3、C57—>Babl/C小鼠背—背皮肤移植手术82例,其中PBS组18例,平均存活时间6.8天；凋亡组共20例平均存活时间7.4天；RAPA组共行手术22例,平均存活时间10.36天；RAPA联合凋亡细胞组共行22例,平均存活时间10.68天。用Kaplan-Meier统计方法分析后PBS对照组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异(P>0.05); RAPA组与PBS组比较有显着性统计学差异(P<0.01);RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异(P>0.05);4、Babl/C—> C57小鼠小鼠背—背皮肤移植手术78例,其中PBS组共18例,平均存活时间6.5天；凋亡组共20例,平均存活时间7.3天；RAPA组共行手术19例,平均存活时间10.42天；RAPA联合凋亡细胞组共行21例,平均存活时间10.52天。用Kaplan-Meier统计方法分析后PBS组与凋亡细胞组移植皮片存活时间比较无统计学差异(P>0.05),但是凋亡组较PBS组移植皮片呈延长趋势；RAPA+凋亡细胞联用与单纯使用RAPA组比较无统计学差异(P>0.05)。结论：1、分别输注1次、2次、凋亡细胞均对小鼠皮肤移植存活时间无明显延长,但是输注3次凋亡细胞对移植物存活时间有着明显的延长趋势；2、凋亡细胞对诱导同种异基因小鼠皮肤移植免疫耐受作用不明显。3、低剂量免疫抑制剂能够延长同种异基因小鼠的皮肤移植存活时间；4、免疫抑制剂联合凋亡细胞的协同作用在小鼠皮肤移植模型上效果不明显。第叁部分：不同免疫抑制剂对全血中细胞因子分泌的机制研究目的：研究不同免疫抑制剂对全血细胞中不同细胞因子分泌的影响。方法：1.取样：取健康成人外周血加入不同浓度的免疫抑制剂培养6 h后加入10μl浓度为0.15μg／ml的佛波酯(PMA)和10μl浓度为2.5 gg／ml的离子霉素(IONO),再培养6 h(37℃,5% CO2)后离心(300 G,5 min),收集上清待测;2.利用用Bio-Plex悬浮蛋白芯片系统检测细胞因子的变化,比较不同免疫抑制剂组细胞因子的水平。3.统计：采用SPSS10.0统计分析软件对数据进行统计分析。采用单向方差分析和LSD检验比较实验组与对照组之间的差异,P<0.05有统计学意义结果：高浓度,中浓度的地塞米松(DEX)及环孢素A (CsA)都能有效抑制MCP-1的分泌,而他克莫司(FK506)和麦考酚酸(MPA)不能有效抑制细胞因子的分泌。结论：DEX和CsA可有效抑制MCP-1的分泌,而FK506和MPA对MCP-1的分泌没有影响。
范礼佩[2]2007年在《供者凋亡细胞诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的初步研究》文中认为背景在过去的几十年里，由于免疫抑制剂的发展，不仅使器官移植成为终末期肾、肝、心脏疾病可接受的治疗方式，而且显着减少了急性排斥的发生率，同时显着提高了器官移植的短期、长期生存率。然而，免疫抑制剂的应用带来了许多问题。首先，要终身连续对免疫系统进行非特异性免疫抑制。第二，当前使用的免疫抑制剂中，没有一种能完全预防急性排斥或者慢性排斥。第叁，免疫抑制剂的应用带来了肿瘤和感染的风险。第四，免疫抑制剂的应用增加了移植病人高血压的风险以及由此导致的心血管并发症。面对以上问题，新的免疫调节法增加了特异性，减少了这样的毒副作用。在最近，细胞治疗的研究取了显着的进步。特别是凋亡细胞的静脉输注能诱导实质器官的移植免疫耐受。在临床工作中，一些病人对移植物无限期地形成耐受，只须使用少量的免疫抑制剂，这说明在临床可以通过人工的方法诱导免疫耐受。我们的研究小组应用凋亡细胞诱导免疫耐受明显延长鼠心脏移植的存活时间，这一思路已经被国内外很多实验室所承认和重复。现已证明，在许多啮齿类小动物模型中，静脉输注凋亡细胞可以诱导供者特异性的移植免疫耐受，这给我们一个启示，在临床上是否也可以通过类似的方法诱导免疫耐受，从而有效延长移植物存活，减少免疫抑制剂的使用呢?为了证明这个问题，我们首先选择非人类灵长类动物进行供体凋亡细胞诱导免疫耐受的研究。但是，在成功应用供体凋亡细胞诱导非人类灵长类动物移植免疫耐受之前，首先必须解决好以下几个问题：(1)测定恒河猴的类人血型；(2)要找到诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的有效方法；(3)建立合适的与临床情况最相似、并且有利于免疫耐受研究的器官移植模型。许多文献报导传统的切除双肾的恒河猴肾移植模型术后因排斥反应、急性肾小管坏死等并症很容易导致恒河猴术后7-10天死亡，不利于免疫耐受的研究，因此，要建立有利于免疫耐受研究的恒河猴肾移植模型。本文对以上几个问题进行了研究，并初步研究了供者凋亡细胞对非人类灵长类动物同种异体肾移植移植物存活以及急性排斥反应的影响。目的研究恒河猴类人血型的检测方法；建立恒河猴同种异体肾移植模型；研究诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的方法；研究供者凋亡细胞对恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的诱导。方法1、43只恒河猴，肌注氯胺酮麻醉后，分别抽取静脉血5ml，肝素抗凝。分别收集恒河猴唾液。应用常规单克隆抗体法、凝集抑制实验法(检测唾液)、抗A抗B凝集素检测法(反向定型法)共叁种方法测定恒河猴的类人血型。2、建立恒河猴同种异体肾移植模型：4只恒河猴随机配成两对，每只恒河猴均捐出左肾，保留右肾，同时接受另一只恒河猴的左肾移植。供肾切取：沿中线切开腹部，显露左肾。上血管夹前给予肝素(100u／kg，iv)。切下肾脏后用4℃HCA保存液50ml灌注。受者手术：沿中线切开腹部，游离腹主动脉和下腔静脉远端，上血管夹前静脉注射肝素(100u／kg，iv)。肾动脉、静脉分别于腹主动脉、下腔静脉远端行端侧吻合。血管吻合过程中应用显微外科器械、7／0无损伤血管缝合线。输尿管与膀胱吻合，并临时留置双猪尾支架管。术后给予阿司匹林100mg口服，共3天。术后采用亚临床剂量免疫抑制方案：甲基强的松龙+环磷酰胺+雷帕霉素。术中、术后一天、二天静脉注射甲基强的松龙均为120mg；环磷酰胺20mg，术前4天开始，每两日一次；雷帕霉素0.4mg，手术日开始，每日一次。术后抗生素：硫酸庆大霉素(10000u／kg／d，IM)。3、在我们的研究中有一个重要的问题值得注意，即细胞凋亡后很容易发生继发性坏死，而坏死细胞对免疫的影响与凋亡细胞截然不同，因此在诱导细胞凋亡的同时应尽量减少坏死细胞。为此我们比较了高能X线法、Co60γ射线法、紫外线(UVC)照射法叁种方法，发现紫外线(UVC)照射法效果最佳，因此我们对紫外线照射法进行了详细的研究，在不同的照射时间(40，50，60分钟)、照射距离(15，20，30厘米)、不同的小牛血清浓度(10％，15％，20％)、不同的液面高度(0.106，0.142，0.177厘米)等条件下的凋亡率，确定诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的最佳条件。4、供者凋亡的单个核细胞预输注诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受：6只恒河猴随机配对分为两组，即凋亡组和对照组。凋亡组接受对照组配对供者的凋亡细胞。制备的凋亡细胞用20mlPBS液稀释后输注给凋亡组配对的受者。对照组输注PBS液20ml作为空白对照处理。每只恒河猴均接受对方左侧供肾，行肾移植术，保留右侧肾脏。(1)大量凋亡的单个核细胞制备抽取供者恒河猴外周血50ml，应用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，应用UVC法照射单个核细胞，诱导单个核细胞凋亡条件：培养皿直径为6cm，10％小牛血清培养基4ml，照射距离20cm，照射时间为60分钟。制备凋亡细胞后应用流式细胞计数仪检测凋亡率，同时静脉输注给受者猴，7天后行同种异体肾移植术。(2)术后免疫抑制剂的方案同前。(3)术后动态监测血常规、雷帕霉素浓度、CD4+CD25+调节性T细胞；定期行移植肾B超、CT检查和移植肾穿刺病理检查，观察移植肾存活时间。结果1、应用常规单克隆抗体法检测恒河猴类人血型没有一例出现阳性凝集反应，不能检测出恒河猴类人血型。凝集抑制实验(检测唾液)检测恒河猴唾液类人血型也未出现阳性反应。所以，单克隆抗体法、凝集抑制实验法均不能检测出恒河猴类人血型。抗A抗B凝集素检测法(反向定型法)能测出每只恒河猴的类人血型。43只恒河猴中类人A型3只(7％)，类人B型25只(58.14％)，类人AB型15只(34.88％)。而未发现类人O型。2、四只恒河猴左肾的切取和肾移植手术时间平均在两小时内完成，肾移植手术均成功，开放血流后移植肾即恢复功能，开始泌尿，术中尿量多，说明移植肾进入多尿期。术后二天移植肾彩超检查示移植肾血供良好。移植肾存活的时间分别为5，5，6，7天。移植肾均出现强烈的急性排斥反应。术后未出现血肿、感染、尿瘘、输尿血管梗阻等并发症。其中一只恒河猴移植肾出现肾动脉栓塞，移植肾存活5天；存活7天的恒河猴因肠梗阻而死亡。其余的猴切除排斥肾脏后均存活。与正常肾比较，术后移植肾明显肿大，穿刺病理和移植肾切除病理示移植肾有许多炎性细胞浸润，局灶性坏死。3、由于在前期研究中发现紫外线(UVC)照射法明显优于高能X线法和Co60γ射线法，因此我们对紫外线诱导方法进行了深入探讨。发现影响细胞凋亡的主要因素有：照射距离、照射时间、培养液的量、小牛血清浓度。对UVC照射法重复研究，发现照射距离20厘米的凋亡率显着高于照射距离30厘米的凋亡率(P＜0.0001)、照射60分钟的凋亡率显着高于40、50分钟的凋亡率(P＜0.01)，而其坏死率不超过10％、直径6cm的培养皿中培养液4ml时的凋亡率显着高于培养液5ml时的凋亡率(P＜0.01)，而其坏死率显着低于培养液3ml时的坏死率(P＜0.05)、用10％的小牛血清培养液时的凋亡率显着高于用15％、20％的小牛血清培养液时的凋亡率(P＜0.005)。4、供者凋亡细胞预输注后恒河猴同种异体肾移植结果：4(1)、恒河猴外周血50ml，可分离出单个核细胞数为8×10~7-8.5×10~7个，经UVC照射后获取的细胞总数(即为静脉输注的细胞总数)为7.2×10~7-7.5×10~7个。其凋亡率为40-60％，坏死率为5-10％。4 (2)、移植肾存活时间：凋亡组为7(手术原因死亡)，19，30天，对照组为5(移植肾动静脉血管栓塞)，6，14天。4 (3)、凋亡组：99523术后6天B超示移植‘肾血流不丰富，移植肾轻度肿大，大小53×25×35mm，活检病理示急性排斥。术后7天死亡，死亡原因为肠梗阻，其诱因是手术中结扎了肠系膜下动脉。97387和00209术后7天B超示移植肾血流丰富，移植肾大小和结构正常，大小分别为41×28×32mm、52×24×38mm，活检病理见少量淋巴细胞浸润。对照组：99581术后5天行移植肾B超检查，发现移植肾明显肿大，大小约55×25×40mm。活检病理检查显示移植肾大量淋巴细胞浸润，广泛局灶性的坏死。98447术后5天行B超检查示移植肾大小为：43×18.3×37mm，无血供；即行移植肾CT检查，静注造影剂后，移植肾不显影，说明移植肾无血供。手术探查切除移植肾，术中见移植肾呈紫黑色，肾动脉无搏动。肾动脉有血栓形成。切除移植肾送病理检查显示移植肾坏死。00473术后7天行B超检查示移植肾结构正常，大小为53×41×39mm，移植肾血流丰富，穿刺活检病理见少量淋巴细胞浸润。术后14天复查移植肾B超示血流丰富，阻力指数0.74。活检病理见大量淋巴细胞浸润。4 (4)、CD4+CD25+淋巴细胞亚群的监测：凋亡组受者97387、00209的CD4+CD25+的百分率在术前为3.49％和3.19％；术后一周达到高峰，分别为11.79％和13.58％，约是术前的3-4倍。对照组00473的CD4+CD25+在术前、术后相对稳定。结论1、本研究对比了单克隆抗体法、凝集抑制实验法和抗A抗B凝集素检测法(反向定型法)检测恒河猴类人血型的情况，实验结果显示反向定型法测定恒河猴类人血型敏感，有效；恒河猴类人血型分布以B型最多(58.14％)，AB型次之(34.88％)，A型最少(7％)；而无类人O型。而单克隆抗体法和凝集抑制实验法不能检测恒河猴类人血型。2、保留一侧肾的恒河猴肾移植模型与以往模型相比有以下优势：(1)保留了受体的原肾，更见符合临床情况，因为在临床上对于受体原肾均不予切除，这样不但可以减少创伤，而且更有利于术后恢复；(2)保留原肾更加有利于术后维持内环境的稳定，减少围手术期护理的难度；(3)移植物排斥时，将排斥的移植物切除后受体猴可以长期存活，这不但更好地模拟了临床情况，而且减少了受体猴不必要的死亡，更加符合动物的伦理学；(4)由于受体猴能够长期存活，更有利于我们长期对受体猴进行免疫学的长期随访观察，是我们进行免疫耐受研究的良好模型。3、诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡，紫外线照射法比高能X线和γ射线法敏感，效果好。紫外线照射诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的最佳条件是用含10％小牛血清的1640培养液，直径6cm的培养皿中加培养液4ml，照射距离20cm，照射时间为60分钟。4、凋亡组的移植肾存活时间比对照组长，说明可能存在部分免疫耐受，但是，凋亡组和对照组均出现急性排斥反应，说明术前输注供者的凋亡细胞没有诱导出完全的免疫耐受。5、凋亡细胞输注可诱导CD4+CD25+T调节细胞升高。凋亡组的CD4+CD25+T调节细胞升高可能是移植肾存活时间延长的原因。
姚冰[3]2003年在《供体凋亡细胞预输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中提出研究目的： 探讨肝硬化大鼠肝移植动物模型的建立方法，及其与正常大鼠肝移植免疫学变化可能存在的不同影响。进一步研究预输注通过处理后的供者凋亡细胞是否可以诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受，为临床诱导肝移植的免疫耐受提供新的思路和可行的方法。 材料与方法： 一、供、受体均为SD大鼠，用四氯化碳蓖麻油溶液制作大鼠肝硬化模型，用双袖套法制作大鼠原位肝移植模型进行实验，建立肝硬化大鼠的原位肝移植模型。采用自制套管，供受体SD大鼠均取腹部横切口，受体无肝期前预置门静脉缝扎牵引线，肝上下腔静脉采用血管膜端端“叁定点”吻合法，门静脉及肝下下腔静脉采用袖套吻合法，用自制“小针钩”排气。观察肝硬化大鼠7周后的肝脏病理结果，及其行原位肝移植后的成功率。 二、Wistar大鼠10只，随机分2组。正常组：正常Wistar大鼠不作处理，取脾脏分离脾细胞。地塞米松组(Dex)：地塞米松连续3天，第4天取脾脏分离脾细胞。采用AnnexinV联合PI双标法流式细胞仪测定细胞凋亡情况。 叁、供体为Wistar大鼠，受体为SD大鼠。实验分正常组、正常手术对照组伽一Control组)、肝硬化手术对照组(C一Contr01组)，地塞米松体内处理组(Dex组)、脾细胞组(SpC组)和地塞米松体内处理的脾细胞组(Dex一sPC组)。正常组SD大鼠只采尾静脉血作肝功能对照;N一Control组供体和受体大鼠均不作处理;C一Control组供体不作预处理，受体为肝硬化大鼠;Dex组术前10天用地塞米松腹腔注射处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，不输供体大鼠脾细胞;SpC组不用地塞米松处理供体大鼠，受体为肝硬化大鼠，术前7天输供体大鼠脾细胞(5xl夕);Dex一sPc组术前10天用地塞米松腹腔注射预处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，术前7天经阴茎背静脉输注供体大鼠脾细胞(5、107)。观察各组大鼠移植术后的存活时间，术后1周肝功能(ALT、TBIL)及病理变化。 结果: 一、(l)肝硬化大鼠7周肝脏病理结果证实为肝硬化(见附图l:正常肝脏，2:肝硬化肝脏，3:肝硬化病理切片，4:肝硬化病理切片)。病理可见肝细胞变性、坏死，细胞索排列紊乱，纤维组织大量增生，将肝实质分割成大小不同的假小叶。(2)行大鼠原位肝移植术26次，其中正式实验20次。改进后正式实验，供体手术时间25一35 min，平均29 min;袖套准备及肝脏修整时间8一13 min，平均10 min;受体手术时间45~60min，平均5 1 min;无肝期14~23 min，平均17 min。正式实验Zd存活率9oo’0(15/20)，l周存活率85%(17/20)。 二、地塞米松体内处理后的脾细胞凋亡率(33.5肚624%)，较正常大鼠脾细胞凋亡率(0.7肚0.11%)明显增高(P<0.ol)。 叁、(l)各组大鼠术后存活时间:N一Control组(n=7) MST二10天、C一Control组(n=8)MST=17天和Dex组(n=8)MST=16天，术后存活时间无明显差别;Spc组(n一8) MST=28天，较N一Control组、C一Contr01组和Dex组存活时间明显延长;Dex一SpC组(n=8)MST>60天，较其它各组均显着延长。(2)各组大鼠术后1周肝脏急性排斥反应的病理变化:N一Control组、C一Conirol组和Dex组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在6一9之间，排斥反应较SpC、Dex一spC组重;SPC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在4一6之间，排斥反应较前叁组轻，较Dex一SPC组重;Dex一SpC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在3一5之间，排斥反应最轻。(3)各组大鼠术后1周肝功能变化:N一eontrol组、e一eontrol组、oex组、Spe组和nex一spC组肝功能TBIL和ALT较正常组均升高;N一Control组、C一Control组和Dex组肝功能示TBIL和ALT较spc组和Dex一SPC组均明显增高;SpC组肝功能示TBIL和ALT稍低于N一Control组、C一Control组和Dex组，高于Dex-SpC组;Dex一SpC组肝功能示TBIL和ALT明显低于N一Control组、C一eontrol组、nex组和SpC组。 结论: 改进的双袖套法大鼠原位肝移植术可在单人直视下进行，安全确切实用。所有吻合均应无张力、保持原位，耐心细致的手术操作是模型成功的关键。 地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注能够诱导肝硬化大鼠同种异体肝移植免疫耐受。地塞米松诱导供体脾细胞凋亡，预输注的脾细胞不仅提供了凋亡细胞，也提供了供体抗原，受体吞噬细胞吞噬凋亡脾细胞可以产生免疫抑制，受体抗原提呈细胞在免疫抑制的环境下加工和处理抗原，产生免疫无反应性，从而对随后植入的移植物产生免疫耐受。 凋亡细胞预输注可以诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受，提示肝脏在诱导肝移植免疫耐受过程中并非起主要作用。
谢金敏[4]2007年在《供体凋亡淋巴细胞预输注诱导猪肝移植免疫耐受的实验研究》文中研究指明研究背景目前,原位肝移植(Orthotopic liver transplantation,OLT)是治疗终末期肝病最有效和常规措施。然而,尽管由于外科技术的标准化、免疫抑制剂的不断研发和应用,移植物的长期存活率没有明显提高。器官移植术后的排斥反应仍是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。免疫抑制剂的应用,虽然有效地抑制了急性排斥反应,但长期应用免疫抑制剂必然会给移植病人带来许多副作用和潜在的危险性,如增加感染、肿瘤的发生率,也不能有效地控制可导致移植物失功的慢性排斥反应的发生。因此,诱导受者对供者器官特异性免疫耐受是解决排斥反应最理想的措施,相对免疫抑制疗法,诱导免疫耐受的优势是从根本上避免了排斥反应,又不影响机体的正常抗感染和免疫监视功能,同时避免了药物毒性。而且,耐受的诱导对于最终克服异种移植免疫学障碍也许是最佳途径,因为异种移植免疫抑制需长期高水平的、非特异性的免疫抑制剂来维持。因此,诱导移植免疫耐受性,控制移植物排斥反应,保护移植器官的功能,这无论在同种移植和异种移植中都是十分重要的课题。目前在啮齿类动物,已有许多可行的策略成功诱导出血管化移植物的长期存活。但应用这些策略过渡到临床,由于在大动物模型中得不到相同的结果,却受到了限制。国内外学者对诱导免疫耐受的尝试甚多,但结果均不甚理想,机制尚不明确,更没有成熟可应用于临床的方案。因此,如何成功地在成年大动物和临床诱导免疫耐受成为免疫学家和移植学家的主攻方向和目标。细胞凋亡是机体内普遍存在的一种生理和病理现象。近来越来越多的研究表明凋亡细胞能够主动调节机体的免疫功能,并能通过调节机体细胞免疫和体液免疫的途径诱导免疫耐受。我们已成功的建立小动物移植模型并验证了供体凋亡细胞预处理受者能够诱导免疫耐受,并提出了一个新的观点:肝脏是特异性吞噬凋亡细胞的场所,凋亡细胞有局部免疫抑制的作用,吞噬了凋亡细胞的肝脏抗原递呈细胞在局部免疫抑制的环境下递呈抗原给T细胞,而诱导对被吞噬抗原的免疫耐受。现进行大动物实验来验证我们的发现,同时进一步探索凋亡细胞诱导免疫耐受的机制。第一章非转流小型猪原位肝移植模型的建立目的:探索建立简便稳定的小型猪原位肝移植模型,为我们大动物免疫耐受的实验提供平台。方法:用非静脉转流的方法建立中国小型猪原位肝移植模型。实验过程分为供体手术、供肝修整、受体手术、围手术期处理四部分。供体采用基础麻醉,经腹主动脉取血备受体输血用,采用肝动脉及门静脉双灌注的方法进行供肝灌注。受体采用气管插管+静脉复合全麻,切除受体肝脏,先吻合肝上下腔静脉、门静脉后结束无肝期,然后依次吻合肝下下腔静脉、肝动脉,采用套管法吻合胆总管。结果:共进行中国小型猪原位肝移植手术18例,平均手术时间(179.6±14.3)min,平均无肝期(27.3±3.4)min,术中平均失血量422ml,平均输血量444ml,本组无术中死亡,术后当天死亡1例,死亡原因为急性肺水肿,术后第二天死亡1例,死亡原因为胆总管吻合口胆瘘,术后7天存活率88.9%。术中无肝期门静脉及下腔静脉的阻断,导致血液动力学波动明显,代谢功能发生急剧变化:无肝期平均动脉压、中心静脉压与无肝期前比较有明显下降(P＜0.01);无肝期及新肝期出现酸中毒,PH值及碱剩余下降,手术结束时平均动脉压及中心静脉压恢复,经药物调整后血清钾下降,酸碱逐渐恢复正常。结论:(1)移植肝脏修整时保留肝上下腔静脉周围的膈肌环,并行一周的锁边缝合,保证植入后吻合口无漏血,同时防止血管扭曲引起的回流不畅。(2)在猪肝移植胆道重建中采用套管法,可以简化手术操作,效果可靠,避免了胆瘘,同时明显缩短了手术时间。(3)熟练的手术技巧,并对血管吻合进行技术改进,可缩短无肝期手术时间,是非转流条件下猪原位肝移植成功的关键。(4)无肝期保持血液动力学的稳定是手术成功的重要保证,无肝期前开始扩容,无肝期补液速度加快,此时应用血管活性药物可较好的维持血液动力学稳定,静脉血流完全开放后,则严格限制液体输入,并根据血液动力学变化随时调整输液速度。(5)非转流条件下的小型猪原位肝移植模型具有手术方法简便、易于复制,标准化程度及手术成功率高,稳定性好的优点。第二章~(60)Coγ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植免疫耐受的实验研究目的:探讨通过~(60)Coγ射线体外处理后的供者淋巴细胞预输注诱导猪肝移植特异性免疫耐受可能性的方法,为不作常规免疫抑制处理成年大动物的诱导移植免疫耐受提供可行的途径。方法:在已建立非转流小型猪原位肝移植模型的基础上,供体为中国四川版纳小型猪,受体为中国西藏小型猪,将供、受体组动物随机分为对照组与处理组进行移植手术。应用~(60)Coγ射线体外处理供猪淋巴细胞,AnnexinV/PI双标法检测~(60)Coγ射线处理后淋巴细胞的凋亡率。受猪术前7天经耳静脉输注供体~(60)Coγ射线处理过的淋巴细胞(5×10~8),或不做预输注,观察两组受体猪移植术后的存活时间,术后检测肝功能、T淋巴细胞亚型及病理。结果:(1)~(60)Coγ射线体外处理后的淋巴细胞凋亡率(48.70±6.17%),较正常淋巴细胞凋亡率(0.14±0.09%)明显增高(P＜0.01)。(2)实验结果显示处理组中位存活时间与对照组相同,中位生存时间为7天。(3)移植术后3天,处理组和对照组病理活检均呈急性中、重度排斥反应;术后6天,两组均呈急性重度排斥反应。(4)两组术后肝功能检测ALT、AST、TBil、TB及ALB测定结果均为肝细胞破坏表现。术后1、3、6天两组ALT、AST、TBiL均较术前增高(P＜0.01),TB、ALB较术前降低(P＜0.01),但两组间差异无显着意义(P＞0.05)。(5)术后1、3、6天CD4~+T、CD8~+T、CD4~+CD25~+Tr升降趋势与血常规中LYM的升降趋势大致相同,两组间差异无显着意义(P＞0.05)。结论:~(60)Coγ射线体外照射可以诱导淋巴细胞凋亡。~(60)Coγ射线体外处理过的淋巴细胞预输注未能够诱导猪同种异体肝移植特异性免疫耐受。
陈建锋[5]2001年在《供者凋亡细胞预输注诱导同种器官移植免疫抑制的实验研究》文中研究指明研究背景：尽管移植是治疗器官衰竭最有效的治疗手段之一，但是移植排斥是移植术后最严重的并发症，往往导致治疗的失败。诱导移植物的长期存活或免疫耐受是器官移植领域中的重要研究课题。目前临床上多运用免疫抑制剂打击受者免疫系统功能来抑制受者排斥反应，但其多种毒副作用以及不确定性制约着它的应用。能否通过对供者的处理达到宿主对其特异性耐受渐渐目前研究的热点。细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理和病理现象。长期以来，人们一直以凋亡细胞膜结构完整，没有释出细胞毒性内容物来解释其为何避免发生炎症反应，而对于凋亡细胞对免疫系统的主动影响却少有研究。我们以前的实验证明，凋亡细胞能主动调节机体的免疫系统，并能抑制机体对外来抗原的排斥反应。目的：本实验旨在探讨供者凋亡细胞预输注能否抑制受者对供者移植器官的排斥反应，延长供者移植物的存活时间，并检测处理组受者淋巴细胞的增殖能力。为寻找诱导器官移植免疫耐受的新方法提供实验依据。方法：紫外线照射诱导供者脾细胞凋亡。以大鼠心脏移植作为动物模型，将紫外线照射后培养8小时的供者凋亡脾细胞注入受鼠体内，分别在输注后0、3、7、14天将供鼠心脏移植至受鼠腹腔内，观察移植物存活时间。单向混合淋巴细胞培养检测受者淋巴细胞在体外对供者淋巴细胞的增殖反应能力的变化。结果：紫外线能有效诱导大鼠脾细胞凋亡；预输注供者凋亡脾细胞组移植心脏存活期明显延长，以输注7天后移植者最为显着，而输注同种活细胞或死细胞组则无此效应；单向混合淋巴细胞培养显示预输注凋亡脾细胞组受鼠淋巴细胞增殖能力明显下降。结论：凋亡细胞能主动抑制受者淋巴细胞活性，延长同种移植物存活时间，利用凋亡细胞诱导器官移植免疫耐受是一条可行的途径。
汪爽[6]2001年在《地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分 双袖套法大鼠原位肝移植 模型制作的改进 目的：探讨建立简便实用的双袖套法大鼠原位肝移植模型。 方法：在Kamada及孙君泓方法的基础上进行了改进。按照动物大小、血管粗细选择各种口径市售塑管棉棒自制成血管套管，用硬膜外麻醉导管制成胆管支架管，供受体均取腹部横切口，用输液器滴注经门静脉低压灌洗供肝，受体无肝期前在门静脉分叉上端两侧用缝线预置牵引线，肝上下腔静脉采用血管膜端端“叁定点”吻合法，门静脉及肝下下腔静脉采用袖套吻合法，用自制“小针钩”驱除气泡并协助套管插入，胆管吻合采用单管插管吻合，不分离周围组织，肝脏及肠管保持原位，术后补充少量肝素生理盐水。 结果：共行SD→SD大鼠原位肝移植手术96例，其中预备手术56例，正式实验40例。改进后正式实验，供体手术时间平均29min，袖套准备时间平均10min，受体手术时间平均51min，无肝期平均17min；2d存活率95％（38/40），1 wk存活率92.5％（37/40）。 结论：（1）改进的双袖套法大鼠原位肝移植术可在单人直视下进行，安全确切实用，简化了操作，提高了手术成功率。（2）自制血管套管简单易行；与直切口相比，腹部横切口可使暴露更加充分；肝上下腔静脉“叁定点”缝合法吻合确切，成功率高；所有吻合均应无张力、保持原位；自制“小针钩”排气效果确切迅速。（3）肝上下腔静脉吻合是受体手术的难点，良好的胆管吻合是受体长期存活的保障，耐心细致的手术操作是模型成功的关键。第二部分 地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注 诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究 目的：探讨通过地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注诱导大鼠肝移植特异性免疫耐受的可能性，为对成年动物不作常规的免疫抑制处
张振[7]2008年在《供体凋亡细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的研究》文中进行了进一步梳理研究背景胰岛移植重建胰岛素分泌系统,是一种有望彻底根治糖尿病的治疗方法。2000年,Edmonton方案的成功,标志着胰岛移植取得了突破性的进展,从而带动了胰岛移植临床试验性治疗在世界范围内广泛展开。但是免疫排斥以及免疫抑制剂所带来的副作用和潜在危险性仍是难以克服的障碍。目前普遍认为,解决异体移植排斥反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官产生免疫耐受。由于移植免疫耐受的机制十分复杂,尽管诱导免疫耐受的方法众多,但均未能达到完全可靠持久的特异性耐受。细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理和病理现象,是正常器官和组织发育、清除有害的、过量的和无功能细胞、维持自身稳态的必要环节。现有研究表明:凋亡是机体免疫状态保持平衡和稳定的重要作用机制,凋亡细胞对免疫系统存在着主动的调节作用。凋亡细胞能分泌脂类趋化因子,改变自身胞膜结构表达“eat-me”信号,诱导吞噬细胞对其进行清除;同时凋亡细胞被抗原提呈细胞吞噬后,通过吞噬细胞分泌抑制性免疫因子如TGF-β、PGE_2、IL-10等,造成了特殊的抗原识别微环境,可以促使相关淋巴细胞针对凋亡抗原产生免疫耐受,而不会引起炎性免疫应答。据此,孙尔维等提出利用供体凋亡细胞输注来诱导供体特异性免疫耐受的理论设想。我们课题组以前的工作证实,凋亡细胞在体外对T淋巴细胞活化增殖有直接抑制作用;凋亡细胞预输注可以显着延长大鼠心脏移植模型、肝移植模型存活时间。因此,我们拟应用供体凋亡脾淋巴细胞静脉输注的方法,来诱导糖尿病大鼠同种异体胰岛移植的免疫耐受,以探求延长胰岛移植物存活的方法。目的初步探讨凋亡细胞静脉输注诱导胰岛移植免疫耐受,延长胰岛移植物存活时间的方法,为寻找诱导胰岛移植免疫耐受的方法开辟新的途径,提供新的依据。方法1、直线加速器照射对体外培养大鼠脾细胞凋亡的影响:采用研磨法获得Wistar大鼠脾淋巴细胞悬液。将脾细胞悬液加入细胞培养瓶,分四组,A组为对照组,B、C、D组应用Varian医用直线加速器照射,各组吸收剂量分别为:1.5Gy、2.0Gy、3.0Gy。各组细胞处理后置于37℃,5%CO_2恒温培养箱培养。分别在培养后4h、8h、12h应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;2、大鼠胰岛细胞的分离纯化:采用胶原酶P胰管灌注消化,短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化Wistar大鼠胰岛;3、建立糖尿病动物模型:以STZ(链脲佐菌素)(56mg/kg·体重)经腹腔一次性注射,制备SD大鼠实验性糖尿病模型(连续2次血糖＞16.7mmol/L);4、供体凋亡细胞输注对糖尿病大鼠胰岛移植物的影响:以雄性Wistar大鼠为供体,雄性SD大鼠为受体。将糖尿病SD大鼠随机分为Hank's液注射(A组)、正常供体脾细胞预输注(B组)、供体凋亡脾细胞预输注(C组)及供体坏死脾细胞预输注(D组)四组。各组在预处理7天后行胰岛移植,将1000IEQ的胰岛细胞移植入各组糖尿病大鼠的肾包囊内,比较各组移植物生存时间上的差异。同时各实验组分别在预处理后第7天(即胰岛移植术前)、胰岛移植术后7天、14天、排斥后应用放射免疫法测定大鼠血清胰岛素水平。供体凋亡脾细胞预输注糖尿病SD大鼠则在不同的移植时期(包含血糖正常期、排斥期两个时期)手术将移植物载体肾取出;其余各实验组在糖尿病SD大鼠移植物排斥后2天,取出其移植物载体肾,做胰岛素的免疫组化检测。5、供体凋亡细胞输注对胰岛移植糖尿病大鼠淋巴细胞增殖反应的影响:将糖尿病SD大鼠按上述方法分组,各组分别于预处理后第7天(即胰岛移植术前)、胰岛移植术后7天、14天、排斥后取大鼠脾脏,分离淋巴细胞,经刀豆蛋白A(ConcanavalinA ConA)刺激培养,利用CFSE(2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)细胞染色法观察受体淋巴细胞增殖反应程度。结果1、直线加速器高能X线照射Wistar大鼠脾细胞,吸收剂量2.0Gy组各个时间点的凋亡率有差异(F=5.930,P=0.026),且与对照组、1.5Gy组比较凋亡率有差异(P值均＜0.050),以2.0Gy组、8小时的凋亡率较高。2、每条Wistar大鼠胰腺经分离、纯化后平均可获取的胰岛细胞团数量为(1063.91±84.74)IEQ,DTZ(双硫腙)染色显示纯度为(70.51±6.20)%。高糖刺激时胰岛β细胞胰岛素的释放量为低糖刺激时的2.72倍。3、以STZ(56mg/kg·体重)一次性经腹腔注射的方法,可成功诱发SD大鼠的试验性糖尿病,糖尿病模型建模成功率为94%。4、输注凋亡细胞组与输注Hank's液组、输注正常细胞组、输注坏死细胞组之间的移植物存活时间有差异(P值均＜0.050)。平均存活天数为32天,最长达42天,以输注凋亡细胞组胰岛移植物存活时间最长。正常脾细胞输注组较输注Hank's液组及坏死细胞组也有所延长。预输注Hank's液及坏死细胞组则无此效应。5、预输注凋亡细胞组移植前胰岛素水平与移植后7天、移植后14天有差异(P值均＜0.050),以移植后7天、14天较高。移植后14天输注凋亡细胞组与输注正常细胞组的胰岛素水平有差异(T=3.439,P=0.009),以凋亡细胞组胰岛素水平最高,而预输注Hank's液及坏死细胞组各时间点的胰岛素水平无差异(P值均＞0.050)。6、供体凋亡细胞预输注组胰岛移植物在受体血糖正常时取出做组织切片,经Insulin免疫组织化学染色证实有表达胰岛素阳性的胰岛细胞团存在,呈棕褐色。而在被排斥后取出的移植物进行免疫组化检测,则未发现胰岛素阳性的胰岛细胞团存在。输注Hank's液组、输注供体正常细胞或坏死细胞组的移植物在被排斥后取出行Insulin免疫组化染色检测,亦无胰岛素阳性细胞存在。7、预输注凋亡细胞组移植前的淋巴细胞增殖指数与移植后14天、排斥后有差异(P值均＜0.050),以移植前的增殖指数最低,移植前、移植后7天各组淋巴细胞增殖指数有差异(F=29.943,P=0.000),以输注凋亡细胞组的增殖指数最低,这种抑制效应至移植后14天仍存在,排斥后则消失。结论1、直线加速器高能X线照射能在体外简便安全有效诱导大鼠脾细胞凋亡。2、采用胶原酶P胰管灌注消化,短期低温培养后Ficoll-400不连续梯度纯化能分离、纯化出较大数量且功能良好的大鼠胰岛细胞。3、预输注供体凋亡细胞能显着延长同种异体大鼠胰岛移植物的存活时间。应用供体凋亡细胞诱导胰岛移植免疫耐受是一条可行的途径。4、以体外淋巴细胞增殖实验证实,预输注供体凋亡细胞对受体鼠淋巴细胞经丝裂原ConA刺激的增殖反应具有抑制作用。
孙尔维[8]2008年在《供者凋亡细胞诱导移植免疫耐受机制研究》文中认为背景器官移植是终末期器官功能衰竭的重要治疗手段,移植排斥反应是影响预后的关键因素。临床上主要通过免疫抑制疗法防治移植排斥反应,但存在感染、严重毒副反应和费用高昂等缺点。理论上,诱导针对移植抗原的特异性免疫耐受是防治移植物排斥反应的最佳途径。诱导移植免疫耐受的前提是:①使受者免疫系统接触供者的移植抗原;②对受者免疫系统进行调控,使其耐受供者抗原。迄今为止所建立的免疫耐受诱导方法在小动物模型均取得一定疗效,但在大动物模型尚未见成功报道,也难以临床应用。因而,亟待探索诱导移植免疫耐受的新策略。近10年来,凋亡细胞对免疫系统的调节作用受到高度关注。现已证明,凋亡细胞可诱导移植免疫耐受,其理论基础为:(1)抗原提呈细胞(APC)可快速摄取凋亡细胞;(2)APC可更有效地提呈凋亡细胞所携带的供者抗原;(3)局部微环境的作用。作者的课题组既往的研究结果发现:①凋亡细胞在体外可显着抑制T细胞活化,静脉输注供者凋亡细胞可抑制针对供者移植抗原的特异性淋巴细胞增殖(MLR);②静脉注射供者凋亡细胞可明显延长心脏、皮肤和肝脏移植物存活,而无需应用免疫抑制剂;③受者吞噬细胞是供者凋亡细胞诱导免疫耐受的重要介导细胞等。国内外其他实验室也相继证明输注供者凋亡细胞是诱导移植耐受的有效策略。应用供者凋亡细胞诱导免疫耐受是一个新的研究领域,有许多问题尚待探讨。如输注的供者凋亡细胞在受者体内如何分布,被体内何种细胞吞噬,抗原提呈如何进行,受者体内的T细胞功能亚群如何变化及其机制和意义,以及能否应用到临床等。最重要的是对于供者凋亡细胞诱导移植免疫耐受这一现象的深刻理论意义及其对自身免疫性疾病、肿瘤等疾病和移植物排斥的治疗意义。为此,本课题拟对上述问题进行研究。课题分为以下四个部分一、供者凋亡细胞在受者体内的分布及其局部免疫调节作用目的:研究供者凋亡细胞输注后在受者体内的分布、吞噬和诱导器官内局部免疫调节的情况。方法:近交系C57BL(H-2~b)和Balb/c(H-2~d)分别作为供者和受者。首先将C57BL脾细胞以2μM CFSE染色,然后以1μM地塞米松(Dex,Sigma)诱导凋亡。部分实验中凋亡细胞以Annexin-V免疫磁珠(Miltenyi)进行富集。将2×10~7 C57BL脾细胞以CFSE标记后诱导凋亡,静脉注射给Balb/C小鼠,在不同时间采集受者肝脏、脾脏和血清标本。应用组织学和流式细胞术分析供者凋亡细胞在受者体内分布,同时应用Bioplex或ELISA的方法测定肝脏和脾脏组织,以及血清内细胞因子浓度。与此同时,将CFSE~+的凋亡C57BL脾细胞与从Balb/C小鼠肝脏内分离的APC在体外共培养,并以荧光显微镜、免疫组织化学和流式细胞术分析不同APC吞噬供者凋亡细胞的情况。结果:供者凋亡细胞主要分布于受者的肝脏,而脾脏内分布很少。静脉注射后30—60分钟,供者凋亡细胞聚集在肝脏,并且在90分钟之内被清除。而输注受者凋亡细胞在其自身体内的分布情况与供者凋亡细胞类似,表明供者凋亡细胞在受体体内的分布主要取决于凋亡的特性,而非供者特性。体内和体外实验均表明,肝脏内的叁种APC,包括肝窦状内皮细胞(LSEC),枯否氏细胞(KC)和树突状细胞(DC)均能有效地吞噬供者凋亡细胞。输注供者凋亡细胞后,不同时间检测肝脏、脾脏和血清内的IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-12,TNF-α,IFN-γ,GMCS和TGF-β,发现尽管在肝脏和脾脏内均出现Th1反应,但是在受者体内诱导一个强烈和持久的Th2反应,而在其血清内未检测到类似反应。结论:输注供者凋亡细胞后诱导移植耐受的机制之一是被肝脏内的吞噬细胞所吞噬,并在局部诱导Th2反应。二、供者凋亡细胞对受者体内细胞毒性杀伤和调节性T细胞(Treg)的影响目的:明确供者凋亡细胞对受者体内细胞毒性杀伤和Treg有何影响。方法:近交系雌性C57BL/6j(H-2~b)和Balb/c(H-2~d)分别作为供者和受者。用不同浓度的CFSE对供者和受者细胞进行染色后,将其混合并作为靶细胞输注入受者体内,一定时间后,采外周血流式细胞术测定标记供者细胞的清除情况,应用标记供者细胞清除率与标记受者细胞的清除率来计算供者细胞的杀伤率。并在同种异体皮肤移植模型、免疫抑制模型和裸鼠模型中验证体内淋巴细胞毒性方法。成功建立体内细胞毒性测定方法后,观察了输注供者凋亡细胞对受者体内细胞毒性杀伤和Treg的影响。给Balb/c受鼠注射2×10~7 C57小鼠凋亡脾细胞(活细胞、坏死细胞作对照),一周后采集外周血标本,用流式细胞仪的方法检测Treg。同时,给受者注射CFSE标记的供者和受者脾细胞混合物,2小时后采外周血,流式细胞仪测定体内细胞毒性杀伤。结果:在体内细胞毒性杀伤模型的建立方面,发现输注1×10~7-1×10~8CFSE~+的细胞后,可以在受者体内方便地检测到标记细胞。在同种异体供者皮肤移植预先致敏的受者,供者细胞在1-2小时内被清除,而未经致敏的动物清除速度明显低于致敏动物,4小时后才开始被清除,24小时显着清除,72小时才全部被清除。受者体内清除供者细胞的能力与同种异体排斥反应的发生时相一致。在免疫抑制或裸鼠体内,对供者细胞的清除降低。预先注射活细胞和坏死细胞的受者动物,供者靶细胞很快被清除,而输注凋亡细胞的受者动物体内,供者靶细胞不被杀伤。表明注射供者活细胞和坏死细胞后,受者体内针对供者细胞的毒性明显增强,而注射凋亡细胞的动物,毒性没有增强。注射供者凋亡细胞后,受者动物体内Treg比例也明显增加。结论:体内细胞毒性检测方法是一个准确、方便、快捷的体内细胞毒性杀伤检测方法。与活细胞和坏死细胞相比,注射供者凋亡细胞后受者体内细胞毒性杀伤功能明显受到抑制,其机制可能与受者体内Treg比例增加有关。叁、供者凋亡细胞对同种异体恒河猴肾移植存活的影响及对Treg的影响目的:了解输注供者凋亡细胞能否预防恒河猴同种异体肾移植排斥反应,延长移植物存活,解析Treg在凋亡细胞延长移植物存活中的意义。方法:首先分析了恒河猴的类人类血型情况,对比了常规单克隆抗体法、凝集抑制试验法和反向定型法。结果发现反向定型法,即不测定红细胞上的抗原,而测定血清中的抗体,可以鉴定恒河猴的血型情况。恒河猴同种异体肾移植模型的建立,采用保留受者自体肾的方法。供者手术:麻醉后摘取左肾,HCA液灌洗后备用。受者手术:麻醉后将供肾静脉和动脉分别与受者下腔静脉和腹主动脉吻合,输尿管与膀胱吻合,术后输尿管内置双J管。供者细胞凋亡的诱导方法,我们摸索了高能X线、Co60γ射线和紫外线照射法。确定大量制备供者凋亡细胞的最佳条件为:培养皿直径6cm、10%小牛血清培养基、UVC照射距离为20cm、照射时间为60分钟。为了探讨供者凋亡细胞对恒河猴同种异体肾移植存活的影响。我们给受者静脉输注7.2-7.4×10~7凋亡的供者外周血单个核细胞(PBMC),一周后行供者特异性肾移植手术,对照恒河猴给予等量PBS。术后采用甲基强的松龙(MP)+环磷酰胺(CHX)+雷帕霉素(RAPA)叁联免疫抑制,其中RAPA术后每日一次,共14天,剂量约为临床剂量的五分之一。手术后以B超、CT等观察受者移植肾存活情况,同时连续观察受者外周血Treg的比例。结果:对比单克隆抗体法、凝血抑制实验法和反向定型法,发现反向定型法测定恒河猴类人类血型敏感、有效。43只恒河猴类中人类血型的分布依次为B型(25只,占58.14%),AB型(15只,占34.88%),A型(3只,占7%)。未发现类人O型。对于恒河猴同种异体肾移植模型,4只恒河猴手术过程顺利,术中及术后未用免疫抑制剂,术中见有泌尿,术后2天移植肾彩超血供正常。一只猴第3天出现移植肾区明显肿大,检查发现移植肾静脉血栓,予以切除。一例术后7天因排斥并发肠梗阻死亡。其余两例移植肾存活5天排斥。3只用于研究供者凋亡细胞输注对肾移植存活的影响的恒河猴均接受相同的叁联免疫抑制治疗(MP+CHX+RAPA)。输注供者凋亡细胞两只猴中一只移植物存活14天,1只移植物存活33天,一只猴仅输注PBS而没有输注供者凋亡细胞,移植肾存活14天。检测受者猴PBMC中Treg的比例显示,输注供者凋亡细胞的两只动物,PBMC中Treg的比例明显高于未输注供者凋亡细胞的动物,其中Treg升高幅度最高者的移植物存活时间最长。结论:反向定型法是检测恒河猴类人类血型的可靠有效方法。输注供者凋亡细胞有可能延长恒河猴肾移植物存活,其机制可能与受者体内Treg的比例的提高有关。四、“细胞死亡”免疫识别模型的建立目的:建立新的“细胞死亡”免疫识别模型。方法:文献调研、结合本课题组10年的研究,进行理论论证。结果:建立“细胞死亡”免疫识别模型的四项基本原则,并与传统的“自我非我”选择模型、以及最近提出的“危险信号”模型和“感染性非我”模型进行对比。应用“细胞死亡”免疫识别模型可以更加方便地解释自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫、胚胎免疫、肝脏免疫以及免疫系统中Treg的作用等。观点:机体对所接触抗原产生免疫应答或免疫耐受,不取决于抗原性质是否“自我非我”,也不取决与是否存在感染或有无危险信号,而是取决于抗原提呈过程中的细胞死亡方式:细胞凋亡诱导免疫耐受,而细胞坏死诱导免疫应答。
汪艳[9]2006年在《供体凋亡淋巴细胞诱导移植耐受的免疫学机制初探》文中研究指明免疫耐受是解决移植排斥反应的根本方法之一。目前采用的耐受诱导方法多以中央和外周耐受理论为基础形成，但由于各种原因尚未取得预想的结果。凋亡是生物体内的基本生理现象之一，对于维持机体内在平衡非常关键。研究已发现，凋亡是机体维持免疫系统稳定的重要作用机制，而且凋亡细胞对炎性反应的抑制性调节作用是一种主动的过程：凋亡细胞通过分泌趋化因子、变换细胞膜表面特征“eat-me”分子，诱导吞噬细胞对其进行清除，同时在清除过程中通过巨噬细胞等分泌炎症抑制性因子，如TGFβ、IL-10、PGE_2等造成一个特殊的免疫微环境。正常生理状态下，此过程可以促使相关淋巴细胞对其特征性抗原识别激活后产生免疫耐受，而不是引起炎性免疫应答。根据凋亡细胞能够主动引起免疫耐受这一现象，孙尔维等首次提出利用供体凋亡细胞输注受体诱导供体特异性免疫耐受的理论设想。由此，本课题组前期研究开展了供体凋亡脾淋巴细胞对大鼠心脏、肝脏移植模型诱导耐受的实验研究，发现一定数量的供体凋亡脾淋巴细胞预输注可以诱导大鼠心、肝脏移植模型产生特异性免疫耐受，延长移植存活时间。该发现初步验证了孙尔维等的理论设想，但对于供体凋亡细胞输注如何诱导机体产生非特异性免疫耐受，其内在作用的关键环节和机制是什么，都尚未可知。同时，类似的相关机制研究，国内外都未有报道可以用来参照和解释，而了解供体凋亡细胞诱导移植耐受的内在机制对于深入掌握该理论的中心环节、进一步完善该理论设想，进而指导更有效地实现耐受诱导有
张永革[10]2003年在《地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中研究指明地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受的实验研究 目的：探讨通过地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注是否可以诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受，为临床诱导移植免疫耐受提供新的思路和可行的方法。 方法：用四氯化碳蓖麻油溶液制作大鼠肝硬化模型，用双袖套法制作大鼠原位肝移植模型进行实验，供体为Wistar大鼠，受体为SD大鼠。实验分正常组、正常手术对照组(N-Control组)、肝硬化手术对照组(C-Control组)，地塞米松体内处理组(Dex组)、脾细胞组(SpC组)和地塞米松体内处理的脾细胞组(Dex-SpC组)。正常组SD大鼠只采尾静脉血作肝功能对照；N-Control组供体和受体大鼠均不作处理；C-Control组供体不作预处理，受体为肝硬化大鼠；Dex组术前10天用地塞米松腹腔注射处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，不输供体大鼠脾细胞；SpC组不用地塞米松处理供体大鼠，受体为肝硬化大鼠，术前7天输供体大鼠脾细胞(5×10~7)；Dex-SpC组术前10天用地塞米松腹腔注射预处理供体大鼠共3天，受体大鼠为肝硬化大鼠，术前7天经阴茎背静脉输注供体大鼠脾细胞(5×10~7)。观察各组大鼠移植术后的存活时间，术后1周肝功能(ALT、TBil)及病理变化。Annexin V/PI双标法检测地塞米松体内处理后供体大鼠的脾细胞凋亡情况。 结果：(1)各组大鼠术后存活时间：N-Control组(n=7)MST=9天、C-Control组(n=8)MST=18天和Dex组(n=8)MST=15天，术后存活时间无明显差别；SpC组(n=8)MST=34天，较N-Control组、C-Control组和Dex组存活时间明显延长；Dex-SpC组(n=8)MST＞100天，较其它各组均显着延长。(2)各组大鼠术后1周肝脏急性排斥反应的病理变化：N-Control组、C-Control组和Dex组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在6—9之间，排斥反应较SpC、Dex-SpC组重；SpC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在4-6之间，排斥反应较前叁组轻，较Dex一SPC组重;Dex一SPC组肝脏急性排斥反应的病理RAI评分在3一5之间，排斥反应最轻。(3)各组大鼠术后l周肝功能变化:N一Control组、C一Control组、Dex组、SpC组和Dex一spC组肝功能TBil和ALT较正常组均升高;N一Control组、C一Control组和Dex组肝功能示TBil和ALT较SpC组和Dex一SPC组均明显增高;spC组肝功能示TBil和ALT稍低于N一Contr01组、C一Control组和Dex组，高于Dex-spe组;oex一spe组肝功能示TBil和ALT明显低于N一eontrol组、e-Co咖1组、Dex组和SPC组。(4)地塞米松体内处理后的脾细胞凋亡率(32.40士5.61%)，较正常大鼠脾细胞凋亡率(0.77士0.n%)明显增高(只0.01)。 结论:地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注能够诱导肝硬化大鼠同种异体肝移植免疫耐受。地塞米松诱导供体脾细胞凋亡，预输注的脾细胞不仅提供了凋亡细胞，也提供了供体抗原，受体吞噬细胞吞噬凋亡脾细胞可以产生免疫抑制，受体抗原提呈细胞在免疫抑制的环境下加工和处理抗原，产生免疫无反应性，从而对随后植入的移植物产生免疫耐受。
参考文献：
[1]. 免疫抑制剂及凋亡细胞诱导移植免疫耐受的实验研究[D]. 王明. 南方医科大学. 2010
[2]. 供者凋亡细胞诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的初步研究[D]. 范礼佩. 第一军医大学. 2007
[3]. 供体凋亡细胞预输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 姚冰. 第一军医大学. 2003
[4]. 供体凋亡淋巴细胞预输注诱导猪肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 谢金敏. 第一军医大学. 2007
[5]. 供者凋亡细胞预输注诱导同种器官移植免疫抑制的实验研究[D]. 陈建锋. 第一军医大学. 2001
[6]. 地塞米松体内处理后的供者脾细胞预输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 汪爽. 第一军医大学. 2001
[7]. 供体凋亡细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的研究[D]. 张振. 南方医科大学. 2008
[8]. 供者凋亡细胞诱导移植免疫耐受机制研究[D]. 孙尔维. 华中科技大学. 2008
[9]. 供体凋亡淋巴细胞诱导移植耐受的免疫学机制初探[D]. 汪艳. 第一军医大学. 2006
[10]. 地塞米松体内处理的供体脾细胞预输注诱导肝硬化大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 张永革. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
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