1.株洲市中心医院生殖中心 湖南省株洲市 412000；
2.江西萍乡市妇幼保健医院 江西省萍乡市 337055
【摘 要】目的 采用鼠胚实验（mouse embryo assay，MEA）检测我中心新建的胚胎培养实验室的室内环境、新购置的仪器设备、培养耗材、培养液等是否符合人类胚胎体外培养的要求，对比配子体外授精法和收集2 细胞胚胎培养法两种检测法的差异性。方法 采用配子体外授精法和收集2 细胞胚胎培养法进行实验。在胚胎体外培养的过程中定时对胚胎的发育状况进行观察并拍照记录。结果 配子体外受精法的囊胚形成率为89.2±4.1%。收集2细胞胚胎培养法的囊胚形成率为86.8±1.2%两种方法的囊胚形成率之间差异无显著性。结论 我中心的培养体系符合人类胚胎体外培养的要求，鼠胚实验在新建胚胎培养室中质量控制中的作用是不可替代。
【关键词】鼠胚实验；体外受精；2细胞胚胎培养；质量控制
对于新建的胚胎培养实验室，胚胎培养实验室的环境温度和湿度，仪器设备的温度和性能，培养液、试剂耗材的质量等培养体系对配子及胚胎体外生长发育至关重要。因此在进行人类胚胎的体外操作和培养之前，要检测胚胎培养实验室的整个培养体系是否符合人类胚胎体外培养的要求。
鼠胚实验（mouse embryo assay，MEA）是对胚胎实验室的培养体系进行质量控制的方法之一。已有的研究报道鼠胚实验的可靠性受到较多因素的影响，对于是否采用鼠胚实验作为胚胎实验室质量控制方法的观点并不一致［1］。本生殖中心胚胎培养实验室在装修完成及所有的仪器设备安装调试好后，并经湖南省疾病控制中心对实验室的环境检测合格后，我们在胚胎培养实验室内进行了鼠胚实验。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1．1实验动物昆明小白鼠82只，雌性41只，雄性41只，由湖南景达实验动物科技有限公司提供。
1．1．2主要药品和试剂孕马血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）购自杭州动物药品厂，批号：141112；人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）购于杭州动物药品厂，批号141206；G-MOPSPlus、G-IVFPlus、卵裂液、囊胚液、均购于瑞典Vitrolife公司。
1．1．3实验耗材巴斯德管（ORIGIO），5mL圆底小试管（BD），10mL圆底小试管（BD），1mL注射器（BD），35 mm培养皿（BD）。
1．2实验方法
1．2．1配子体外授精法实验动物的选择与处理
（1）体外授精（in-vitrofertilization，IVF）雌鼠的选择与处理：选择8周龄以上且体重大于25g的健康昆明雌鼠，每只雌鼠腹腔注射10IUPMSG，48h后再注射10IUHCG，于13～16h后取卵子。
取卵冠丘复合物步骤：将处理后的小鼠采取颈椎脱臼法处死，打开腹腔，取出输卵管于G-MOPSPlus中，在体式显微镜下于输卵管壶腹部用1 mL注射器针头做一切口，从切口的一端轻轻挤出冠丘复合物。冠丘复合物用G-IVFPlus洗涤两遍后，按每个受精皿放15个卵子放入受精皿等待受精。
（2）体外授精雄鼠的选择与处理：选择8周龄以上且体重大于25g的雄性特征明显的雄鼠。取小鼠精子步骤：将选择好的小鼠采用颈椎脱臼法处死，打开小鼠腹腔，取出附睾及输精管，在体式显微镜下于G-IVFPlus中在附睾及输精管上打孔使精子游出，放于培养箱中放置30 min。离心处理，计数精子浓度，放于培养箱中。
（3）体外受精与胚胎培养：根据精子浓度，每个受精皿加入精子的终浓度为（1．5～2）×105/mL。受精4h后用拉制好的巴斯德管祛除颗粒细胞，把受精卵转入胚胎培养皿，进行观察后放入二氧化碳浓度为6%的培养箱继续培养。
1．2．2收集2细胞胚胎培养法实验动物的选择与处理：（1）雄鼠、雌鼠的选择与体外受精同。雌鼠注射10IU HCG后与选择好的雄鼠合笼，于第2天清晨检查雌鼠阴道口是否有阴栓，发现阴栓为成功交配的雌鼠。（3）2细胞胚胎的收集与培养：将成功交配的雌鼠，于交配后13h左右采用颈椎脱臼法处死，按无菌操作的要求打开小鼠腹腔，取出输卵管，于输卵管壶腹部用1 mL注射器针头做一切口，从切口的一端轻轻挤出2细胞胚胎，用G-IVFPlus洗涤两遍后，将2细胞胚胎转入卵裂液进行培养，在胚胎体外培养的第3天将胚胎转入囊胚液继续进行培养。
1．3统计方法
采用SPSS13．0软件对实验数据进行均数分析，并对两种方法的囊胚形成率进行卡方检验。P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2．1配子体外授精法囊胚结果
采用配子体外授精法共进行了7批次实验，共获得2细胞胚胎240枚，经体外培养发育成囊胚的胚胎共214枚，平均囊胚率为89.2±4.1%，每批次的囊胚率大于80%（表1）。
2．3两种方法的囊胚形成率的比较
配子体外授精法的囊胚形成率89.2±4.1%与收集2细胞胚胎培养法的囊胚形成率86.8±1.2%比较，差异无显著性（χ2 = 1.56，P =0.21，P＞0.05）。
3 讨论
新建胚胎培养实验室的质量控制过程中受到鼠品系、实验室工作人员的操作技能、胚胎实验室的物理环境（包括整个实验室的温度、湿度，培养箱的温度湿度和CO2浓度及操作台面温度等因素）、试剂、耗材等因素的影响［2］。在操作过程中，应尽量减少
可控因素变化的影响，以利于鼠胚实验能真正的达到检测培养体系是否符合人类胚胎培养的要求。本实验的结果显示，（1）采用配子体外授精法和收集2细胞胚胎培养法的鼠胚囊胚率均大于80%，研究报道囊胚形成率达到80%即可以做为胚胎实验室培养体系符合要求的标准，（2）采用两种方法的质量控制结果没有差异，因此以上两种方法均可以用于胚胎实验室的质量控制。但我们认为体外受精囊胚培养法更适宜用于新建实验室的质量控制。其原因在于：（1）已有的研究结果显示1细胞鼠胚胎比2细胞鼠胚胎对胚胎发育的影响因素更为敏感，更有利于检测出不利因素对胚胎发育的影响［3]。（2）配子体外授精法是对体外受精的全过程进行的质量控制，更有利于发现体外培养体系中存在的问题。（3）行小鼠配子体外受精是对实验操作者技术能力的检验，并可以培训和提高实验室技术人员的技术能力。尽管胚胎实验室质量控制的方法还有人精子存活实验等方法，其中精子存活实验用于检测试剂、耗材的内毒素比较适宜，但对于检测新建的胚胎培养室的培养体系而言具有局限性，将精子存活实验作为胚胎培养实验室正常运行后的试剂和耗材的常规质量控制方法是目前普遍的做法［4］。对于新建的胚胎培养实验室的质量控制采用鼠胚实验中的体外授精法能更好的检测整个培养体系，这也是目前国内外同行所公认的新建胚胎培养实验室的质量控制方法［5]。此外，在进行鼠胚实验的同时对所用试剂、耗材进行精子存活实验更有利于整个培养体系的检测。
综上所述，鼠胚实验在新建胚胎培养室的质量控制中有着重要作用，在做人的体外受精前用鼠胚实验检测实验室的温度、湿度，培养箱的温度湿度和CO2浓度及操作台面温度等因素）、试剂、耗材等因素是否符合人类胚胎培养的要求这既是生殖伦理的要求，也是对技术人员的要求。只有用鼠胚实验检测中囊胚率均大于80%，胚胎培养实验室的整个培养体系才能为人类胚胎的生长发育提供相对适宜的条件，才可能培养出生长发育潜能好的胚胎。鼠胚实验在新建胚胎培养室中质量控制中的作用是不可替代。
参考文献：
[1]Morbeck DE． Importance of supply integrity for in vitrofertilization and embryo culture［J］． Semin Reprod Med，2012，30（3）：182-190．
[2]张宁，王喜良，李侠． 鼠胚生物学分析在IVF 实验室质量控制中的应用［J］．中国优生与遗传杂志，2005，13（7）：123-124．
[3]Claassens OE，Wehr JB，Harrison KL． Optimizing sensitivityof the human sperm motility assay for embryo toxicitytesting［J］． Hum Reprod，2000，15（7）：1586-1591．
[4]Gardner DK，Reed L，Linck D，et al． Quality control in humanin vitro fertilization［J］．Semin Reprod Med，2005，23（4）：319-324．
[5]刘东云，韩伟，黄国宁．如何进行IVF实验室的质控［J］．广东医学，2010，31（19）：2481-2483．
作者简介：
夏华强，男，（1974年-）
基金项目：株洲市年度医疗卫生领域指导性计划（编号2014YW01）资助。
论文作者:夏华强1,肖素梅2,廖聆燕1
论文发表刊物:《航空军医》2015年4期
论文发表时间:2015/12/2
标签：胚胎论文; 体外论文; 囊胚论文; 实验室论文; 质量控制论文; 细胞论文; 方法论文; 《航空军医》2015年4期论文;