中南大学湘雅医学院检验系 长沙 410003
【摘 要】目的 检测3，5，4’-三羟基二苯乙烯（3，5，4'-trimethoxystilbene，TMS）对胰腺癌PANC-1、SW1990、原代细胞增殖和凋亡的影响。方法 分别培养胰腺癌PANC-1细胞、SW1990细胞、原代细胞，用吉西他滨（GEM）做对照，设置不同浓度的TMS组、不同浓度的白藜芦醇（Res）组，共8组，用MTT法测定对细胞的增殖影响，用流式细胞术测定对细胞凋亡的影响。结果 TMS干预PANC-1、SW1990、原代细胞24h后，经MTT法测定显示对其生长具有显著的抑制作用，其强度呈剂量依赖性改变。流式细胞术检测显示对其细胞凋亡百分率（％）显著高于Res组，其作用程度呈剂量依赖型改变。结论 TMS可明显抑制人胰腺癌细胞 PANC-1、SW1990和原代细胞的增殖，并诱导其凋亡。
【关键词】三羟基二苯乙烯；白藜芦醇；胰腺癌细胞；增殖；凋亡
胰腺癌作为一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病隐匿、进展迅速、恶性化程度高[1]。近年来，在我国发病率和死亡率呈逐渐上升趋势。2015年，胰腺癌在中国癌症相关死亡人数已居第六位[2]。2017年，胰腺癌在世界范围的癌症相关死亡人数已上升至第四位[3]，术后的5年生存率仅为8%，癌症转移者的平均生存时间为6个月[4]。根据美国癌症协会统计预测，在2030年之前，其将成为癌症相关死亡人数的第二位[5]。目前对胰腺癌的治疗主要是以手术与吉西他滨相结合的核心手段为主的综合治疗，可其临床效果并不理想，术后平均生存时间不超过6个月。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种广泛存在于葡萄、花生、虎杖等多种食用和药用植物中为抵抗外来侵害时产生的一种植物毒素（phytoalexin），具有心血管保护，抗炎，免疫调节，抗菌抗病毒等多种功能。其生物利用一直是研究热点，但是由于其代谢时间过短等原因，未能有效开发利用。本课题组以Res为原料，通过甲基化反应合成的3，5，4'-三羟基二苯乙烯（3，5，4'-trimethoxystilbene，TMS），增大其脂溶性，易于透过细胞膜，提高了生物利用度。我们拟通过检测不同浓度TMS对人胰腺癌细胞系体外增殖和凋亡的影响，探讨其用于胰腺癌治疗的可行性。
1 材料
1.1 药品与试剂
3，5，4’-三羟基二苯乙烯（TMS）由我校化工技术学院研制，PBS（pH7.4，500ml/瓶，Sigma）；MTT Assay试剂盒（Sigma），小牛血清购自杭州四季青公司，DMEM培养基（北京中山生物公司）
1.2 仪器
流式细胞仪 超净工作台CO2培养箱倒置显微镜、酶标仪、离心机。
1.3 细胞
胰腺癌细胞株PANC-1（ATCC CRL-1469）、SW1990（ATCC CRL-2172）、原代培养细胞：收集手术切除人胰腺癌组织，进行胰腺癌细胞的原代培养。先将上述组织块PBS漂洗 2 次，无菌组织剪剪成1mm3，加入 0.175%Ⅳ型胶原酶、1%牛血清白蛋白、无血清 DMEM培养基37℃消化过夜。消化离心，加入含10%胎牛血清的 DMEM培养基分瓶培养，取传代 1 次后的细胞进行下一步处理。
2 实验方法
2.1 分组
分别将对数生长期的PANC-1细胞、SW1990细胞、原代细胞分为8组，即空白对照组、吉西他滨（GEM）对照组（2μmol/L）、TMS低浓度组（TMS 5μmol/L）、TMS中浓度组（TMS 10μmol/L）、TMS高浓度组（TMS 20μmol/L）、Res低浓度组（TMS 50μmol/L）、Res中浓度组（TMS 100μmol/L）、Res高浓度组（TMS 200μmol/L），每组设6个复孔。空白对照组细胞仅加入完全培养基（含10%小牛血清DMEM），其余组细胞加入含有相应设定药物的完全培养基。
2.2 MTT法检测TMS对胰腺癌PANC-1、SW1990、原代细胞的增殖抑制作用
用含有10%新生牛血清的DMEM培养基，置37℃、5%CO2的细胞培养箱中分别培养PANC-1细胞、SW1990细胞、原代细胞，并均取其对数生长期，用0.25%的胰蛋白酶消化并制备成单细胞悬液，台盼蓝染色法计算活细胞数达98%以上时，以每孔2000个细胞密度均匀接种于96孔培养板上。常规培养条件下作用48h后，每孔加MTT液20μL，继续孵育4h，去上清液，每孔加DMSO150μL，震荡10min。用酶标仪测量490nm波长时各孔的光密度（OD值）。各组取平均值，并以阴性对照组细胞（HPC-Y5细胞）活力为100%，计算各组细胞的增殖抑制率（IR）。IR（%）=（1-Atest/Acontrol）×100%
2.3 流式细胞术检测TMS对胰腺癌PANC-1、SW1990、原代细胞的凋亡率
各组细胞置37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，取出培养板，经消化获得细胞悬液。取浓度为3×105的细胞悬液，加入5mL的FITC-AnnexinV及5mL的PI（浓度250mg/mL），混匀置冰浴暗处温育10min，PBS洗2遍，上机测定TMS对PANC-1细胞、SW1990细胞、原代细胞凋亡的影响。
2.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（）。对正态分布且齐方差的两样本均数的比较用独立样本t检验，非正态分布或方差不齐的两样本均数比较则用秩和检验。两组间性别构成比的比较用 χ2检验，检验水准为双侧α=0.05。P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 胰腺癌细胞的培养观察
先消化细胞，然后加入培养液培养。2.5h后，第一排孔中的细胞数目较第二排孔中的少；24h后，第二排孔中的细胞较之第一排已经完全贴壁。2day后，第二排孔中的细胞均呈梭形，第一排孔中的细胞也多呈梭形，但数量少；4day后，较之前梭形细胞的发现胞体宽度增大、长度缩小，数目也明显增多，第一排孔中发现有少数细胞呈现出多角形并成巢状聚集。1week后，第一排孔中的成巢状聚集的梭形细胞增多并成片，仅为单层平铺；第二排孔中长满并密集排列的梭形细胞呈长梭形，部分为复层，呈现出高低起伏。
3.2 MTT 法检测TMS对胰腺癌PANC-1、SW1990、原代细胞增殖的影响
注：与GEM对照组比较，①P<0.01；与空白对照组比较，② P<0.01，③P<0.05；
流式AnnexinV/PI法检测结果显示：高、中浓度TMS组凋亡率明显高于GEM对照组（P<0.01），低浓度TMS组也有抑制效果，与空白对照组比较有显著差异，与GEM对照组比较无统计学意义（P>0.05）；高浓度Res组有显著的致凋亡效果（P<0.01），中浓度Res组与空白对照组比较有显著差异，与GEM对照组比较无统计学意义；低浓度Res组凋亡率与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），与GEM对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
4 讨论
随着科学技术的不断发展，人们对胰腺癌的认识正在逐渐深入，但因其早期发现少、病程进程迅速、患者预后差，胰腺癌作为恶性程度最高的消化道肿瘤。目前确诊后的五年生存率低于5%。自1997年以，吉西他滨来作为治疗胰腺癌进展期的一线化疗药物，能缓解患者的临床症状，但耐药现象已十分常见，治疗效果欠佳。胰腺癌因其独特的代谢特征，随着对其代谢组学的不断探索，人们逐渐认识到胰腺癌独特的代谢生物学特征与其本身的癌基因特征及肿瘤微环境中各种细胞的相互作用有关。近期研究认为糖代谢会增加胰腺癌对吉西他滨的耐药性。美国埃普利癌症研究中心 Shukla等发现，MUC1可以调节并稳定HIF-1α的表达，从而引起肿瘤细胞非氧化磷酸戊糖途径增加和嘧啶合成增加，增加三磷酸脱氧胞苷的含量，从而竞争吉西他滨的结合位点，使胰腺癌对吉西他滨产生耐药。此外，胰腺癌细胞大范围的表观遗传学改变也与非氧化磷酸戊糖途径相关。特殊的糖代谢活动可以帮助转移的肿瘤细胞迅速适应微环境。白藜芦醇，属非黄酮类多酚化合物，广泛存在于食用和药用植物中，是植物为抵抗外来侵害时产生的一种植物毒素（phytoalexin）。通过抑制多功能蛋白脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1/氧化还原因子-1（APE1/ Ref-1）的氧化还原功能，从多层次影响肿瘤的发生、发展。3，5，4'-三羟基二苯乙烯（3，5，4'-trimethoxystilbene，TMS）是本课题组以Res为原料，通过甲基化反应合成的。本文用针对胰腺癌的PANC-1细胞，研究不同浓度的TMS对其增殖抑制的影响，并用Res作平行对照。结果显示：对PANC-1细胞，5μmol/L的TMS的生长抑制率达到了（11.02±4.71）%，较对照组的（5.33±3.88）%作用强，差别有显著性，P<0.05；和100μmol/L的阳性药物Res对照组的（10.98±4.48）%作用强10倍（不知道怎么出来的?），差别具有高度的显著性，P<0.01；并且其作用强度呈剂量依赖性，10μmol/L TMS的生长抑制率为（13.36±6.16）%，20μmol/L的TMS的生长抑制率为（19.54±8.54）%，对胰腺癌的SW1990、原代细胞的作用呈同样的影响。证明TMS对胰腺癌的PANC-1、SW1990、原代细胞均有诱导其凋亡的作用。
当前，随着对Res作用机制研究的认识，使其在各个领域的对研究都日益深入和广泛，而较之Res，通过本实验首次显示，TMS对于胰腺癌的PANC-1、SW1990、原代细胞均具有更好的致凋亡作用，甚至高达10倍之上。而在此之前并没有文章阐述这一作用，对于TMS是否为具有抗肿瘤细胞作用的化合物，及其是否还有更多的作用和其作用的机制还需要更系统和深入的研究。同时，是否可以通过联合用药更好的解决当前的一线抗癌药物的耐药性也是非常值得研究和探讨的。
参考文献：
[1]Jiang J，Yu C，Chen M，et a1.Reduction of miR-29c en— hances pancreatic cancer cell migration and stem cell-like phenotype[J].Oncotarget，2015（6）：2767—2778.
[2] CHEN W，ZHENG R，BAADE P D，et al. Cancer statistics in China，2015 [J]. CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132. DOI：10. 3322 /caac. 21338.
[3] Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer Statistics，2017. CA Cancer J Clin 2017；67：7–30.
[4] Poplin E，Wasan H，Rolfe L，Raponi M，Ikdahl T，Bondarenko I，et al. Randomized，multicenter，phase II study of CO-101 versus gemcitabine in patients with metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma：including a prospective evaluation of the role of hENT1 in gemcitabine or CO-101 sensitivity. J Clin Orthod 2013；31：4453–61.
[5] Rahib L，Smith BD，Aizenberg R，Rosenzweig AB，Fleshman JM，Matrisian LM. Projecting cancer incidence and deaths to 2030：the unexpected burden of thyroid，liver，and pancreas cancers in the United States. Cancer Res 2014；74：2913–21.
作者简介：魏丹，1978 年生，女，硕士研究生，主要从事免疫、微生物研究。
通信作者：高戈，博士，讲师。
论文作者:魏丹,高戈
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年5期
论文发表时间:2018/9/20
标签：细胞论文; 胰腺癌论文; 对照组论文; 作用论文; 凋亡论文; 浓度论文; 培养基论文; 《兰大学报（医学版）》2018年5期论文;