于威[1]2001年在《人血小板因子4在家蚕细胞和幼虫体内的表达》文中认为人血小板因子4(Human Platelet Factor 4，简称hPF4)是一种发现于骨髓 巨核细胞和血小板α-颗粒的蛋白质。PF4是一种典型的多功能蛋白，目前已发 现PF4具有抗肿瘤、中和肝素抗凝作用、免疫调节活性、组织损伤修复、诱发 炎症反应等多种生物学功能。近年来人们对PF4进行了广泛的研究，目前PF4 已越来越受到基础医学和临床医学的重视。 本研究首先将hPF4基因在大肠杆菌中进行了高效表达。通过PCR及酶切 反应将PF4基因克隆到大肠杆菌热诱导表达载体pBV221中，获得了大肠杆菌 表达载体pBV-PF4，并在JM109菌株中进行了热诱导表达，表达产物经Western 杂交检测具有很强的兔疫活性，在约7.8kD处有一条明显的条带，与目的蛋白 的分子量大小一致，表明PF4基因在大肠杆菌中得到了表达。ELISA检测结果 也表明表达产物具有明显的免疫活性，表达量达到 9.968μg/ml菌液。 此外，我们还首次将hPF4基因在家蚕杆状病毒表达载体系统中进行了表 达。将克隆到的PF4基因通过适当的酶切后插入转移载体质粒pBacPAKS的多 克隆位点中，获得重组转移载体pBacPAK-PF4，然后将pBacPAK-PF4与已酶切 线性化的杆状病毒BacPAK6共转染家蚕培养细胞，二者在细胞内发生同源重组， 通过空斑筛选得到了纯化的重组病毒rBacPAK-PF4。DNA点杂交和Southern杂 交结果均证实了PF4基因已经插入到了杆状病毒基因组中。我们首先在家蚕培 养细胞中表达了PF4基因，Northern杂交结果表明PF4基因在家蚕培养细胞中 发生了转录，rBacPAK-PF4以10MOI的滴度感染2×106细胞，表达产物采用体 外培养的血管内皮细胞ECV304对其生物学活性进行测定，测活结果表明家蚕 培养细胞中表达第 3天的表达量达到了最高值，为 6.088μg/2×106个细胞，胞 内表达产物对血管内皮细胞的生长抑制率达到90.6%。ELISA检测结果表明， 表达产物能与兔抗人PF4一抗发生免疫反应，表达的PF4蛋白具有兔疫活性。 Western杂交在约8kD和17kD处有两条特异性的条带，表明PF4在BmN细胞 中的表达产物可能以两种形式存在，其中17to的蛋白可能是在产物后加工过程 中糖基化等修饰比较完全所致，8kD蛋白可能是糖基化程度较低所致。 二互 ＃rBacPAKPF4在家蚕培养细胞中的表达量与接种病毒的MOI也具有一定的相关性，表达量随MOI的增加呈对数增长趋势。 同时我们也在家蚕幼虫和蛹中对hPF4进行了表达，二者的表达结果相似，都是在感染第 5天的活性最高，其中在蚕血淋巴中的表达量约为 29刀2 u g／ml，对内皮细胞生长的抑制率可达到92．3％。蚕血淋巴的Western杂交结果与在家蚕培养细胞中表达产物的杂交结果极为相似，都是在约 skD和 17kD处有两条特异性的条带，表明 PF4在蚕血淋巴中可能也是以加工后的成熟蛋白和未加工的蛋白两种形式存在。同时也采用了ELISA检测法对蚕体的表达产物进行检测，测定结果也与细胞检测结果相似。 我们还对hPF4蛋白在家蚕培养细胞、蚕体和大肠杆菌内的表达情况进行了比较，结果表明：蚕血淋巴的表达量要高于大肠杆菌的表达量，约为其2．9倍；一条蚕的表达量约等于6瓶家蚕培养细胞的表达量。 家蚕表达载体系统与现有的几种较成熟的真核表达系统相比，其突出的特点就是表达的高效性。PF4在临床上应用的有效剂量较高臼0 p g／Kg入 运用家蚕表达系统表达PF4蛋白可获得大量有生物活性的PF4蛋白，恰好可以满足在临床上的大剂量应用，且可以大幅度降低成本，为今后在临床上肿瘤化疗中的广泛应用打下基础。
于威, 金勇丰, 吴玉澄, 张耀洲[2]2001年在《人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达》文中指出将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞
段毅涛[3]2012年在《大肠杆菌中多顺反子表达人血小板因子4》文中认为血小板第4因子(platelet factor4, PF4)是CXC趋化因子家族中的一员，储存于血小板α颗粒，血小板活化后得以释放。除了肝素中和作用外，PF4有多种生物功能：对人单核细胞和中性白细胞的趋化性，参与成纤维细胞的黏附，免疫调节和抑制肿瘤细胞的生长等。PF4属于小分子多肽，在体内易降解，半衰期短，因此其克隆、表达等常遇到一些困难，在一定程度上制约了其工业化生产。本文采用多顺反子串联表达策略，提高PF4的表达量，为其工业化生产、深入研究和临床应用奠定基础。首先，根据优化后的人PF4DNA序列设计引物，重迭PCR得到人PF4DNA序列，连接T载体；其次，又设计串联单位、第一串联单位和相应引物，重迭PCR获得串联单位和第一串联单位的DNA序列，分别连接T载体，标记为pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4；再次，用同尾酶对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4酶切、连接，得到质粒pEASY-T1-2f PF4；同理，对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-2f PF4酶切、连接，可得质粒pEASY-T1-3f PF4；依次循环可得pEASY-T1-nfPF4(n=4,5,6)；最终，双酶切质粒pBV220、pET28a(+)和pEASY-T1-nf PF4(n=1,2…6)，分别连接大小片段，连接产物分别转化E. coliDH5α和BL21(DE3)，获得工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4和E. coliBL21(DE3)/pET28a(+)-nf PF4(n=1,2…6)。工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4经诱导表达，重组PF4蛋白没有表达或表达极少；工程菌E. coliBL21(DE3)/pET28a(+)-nf PF4培养至OD_(600)约为0.6时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，在23°C下诱导表达12小时，PF4包涵体和可溶性蛋白均有产生；SDS-PAGE电泳和Western blot检测全菌蛋白时，发现随着拷贝数的增加，表达逐渐增加，至4个拷贝时，趋于平衡，其中工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-nfPF4(n=4,5,6)中，重组PF4分别占菌体总蛋白的44.45%、44.03%和43.28%。选工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-4f PF4诱导表达，上清可溶性蛋白经Ni亲和纯化柱和凝胶脱盐柱后其纯度可达95%以上；纯化的融合蛋白经肠激酶酶切和质谱鉴定，确为PF4。用集落形成试验验证重组人PF4的活性，发现融合蛋白可抑制HEL细胞集落的形成，抑制率为55.6%。本论文从解决重组小分子多肽药物产量低、纯化困难和纯化后的目标产品末端不能完全忠实于野生型氨基酸序列等技术难题入手，有效地改进了PF4生产工艺，同时也为其它小分子多肽药物生物合成提供了崭新的思路。
郑小坚[4]2003年在《猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因融合表达载体的构建及初步表达》文中研究说明猪瘟病毒(CSFV)囊膜糖蛋白E2是CSFV的主要保护性抗原，可诱导产生中和抗体和保护性免疫。本研究将CSFV F114株的E_2基因克隆进GST融合原核表达载体pGEX-4T-1的EcoRI和BamHI位点，获得重组原核表达载体pGEX-4T-E_2。以大肠杆菌BL21为宿主菌进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示，在约63kD处有一特异性条带，其分子量与由目的基因所推导的蛋白质分子量相符，推测为E_2与GST融合表达基因产物。将E_2基因克隆进杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californiamultiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)转移载体pAcSecG2T的EcoRI和BamHI位点，获得了带有核型多角体病毒囊膜蛋白gp67信号肽序列与GST-E_2融合表达杆状病毒重组转移载体pAcSecG2T-E_2。在脂质体的介导下，pAcSecG2T-E_2载体与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6共转染家蚕培养细胞Bm-N，空斑筛选分离纯化重组病毒(Bm-BacPAK6-E_2)。PCR检测表明所分离的重组病毒含有目的片段E_2基因。SDS-PAGE检测表明，在感染重组病毒后，无论是家蚕细胞，还是家蚕幼虫、蛹的血淋巴中都可以检测到一条分子量约为63kD的特异性条带，推测为外源基因的表达产物。本研究在原核细胞与家蚕杆状病毒表达系统中均成功地融合表达了CSFV F114E_2基因，为进一步纯化表达的E_2抗原蛋白和CSFV诊断试剂的开发应用奠定了基础，为研制CSFV新型亚单位疫苗进行了有益的探索。
黄金山[5]2007年在《家蚕核多角体病毒Bac-to-Bac系统的构建及Bm21的功能分析》文中研究说明本论文构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)的Bac-to-Bac系统，在此基础上构建失活chitinase与v-cathepsin的Bac-to-Bac系统；并运用bacmid系统，对BmNPV的orf21进行功能研究，论文包括四个章节：第一章以综述的形式扼要介绍了杆状病毒的分类特征、基因组结构、病毒复制周期、致病的分子机制及杆状病毒的应用，重点介绍了杆状病毒表达载体的研究现状及应用，详细阐述了BmNPV的分子生物学研究及家蚕杆状病毒表达载体的研究与应用。第二章详细介绍了BmNPV的Bac-to-Bac系统的构建过程。成功地将含有一个Mini-F复制子、Kanamycin抗性基因、lacZ基因以及attTn7转座插入位点的8.6 kb的DNA片段置换到BmNPV基因组中的多角体基因位点，构建了能在大肠杆菌中稳定遗传的BmNPV bacmids，获得了17株不同的基因型，分别命名为BmBacJS1至BmBacJS17。将polyhedrin基因回复到与野生型BmNPV具有相似的限制性内切酶图谱的BmBacJS13中并进行了体内和体外感染性实验。实验结果表明BmBacJS13是一株具有与野生型病毒相同感染特性的bacmid。为了进一步分析BmBacJS13表达外源蛋白的性能，将egfp基因转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点，重组病毒感染细胞和幼虫后在细胞水平和虫体水平都观察到了强烈的绿色荧光。表明我们已成功构建了一套能在体内和体外表达外源基因的BmNPV Bac-to-Bac系统。第叁章对己构建的BmNPV Bac-to-Bac系统进行改良，以期提高此系统的外源基因的表达效率。利用DNA同源重组技术在大肠杆菌中用氯霉素抗性基因替代BmBacJS13中的chitinase和v-cathepsin编码区域，获得了两基因同时失活的重组bacmid—BmBacJS13ACC。将AcMNPV几丁质酶信号肽与报告基因luciferase融合，转座到BmBacJS13和BmBacJS13ACC，构建重组病毒BmBacJS13ACC-luc与BmBacJS13-luc，比较两者对外源基因的表达量的影响。结果显示：无论是分泌到胞外的还是整个细胞的Luciferase的产量，BmBacJS13ACC-luc都显着高于对照病毒，表明改造后的BmBacJS13ACC是一个更有效的表达载体。第四章利用所构建的Bac-to-Bac系统对BmNPV orf21(Bm21)的功能进行分析。Bm21预测编码55.8kDa的蛋白，RT-PCR分析显示Bm21基因的转录产物在感染后12小时检测到，并持续到感染末期，而BM21的表达在感染后36小时可以检测到；将BM21的C端与EGFP融合瞬时转染BmN细胞，显示其定位于细胞核中，病毒超感染后其定位没有发生改变。为了进一步分析其功能，运用九噬菌体Red重组系统构建了缺失Bm21的重组病毒。结果表明对照病毒与缺失病毒之间BV的生长曲线和LC_(50)无明显差异，而缺失病毒的ST_(50)比对照病毒有8小时的延长，且差异达到了显着程度。因此Bm21是病毒复制的非必需基因，但可以加速感染虫体的死亡时间。
李兵[6]2003年在《野桑蚕体内分离的NPV和BmNPV的比较研究》文中指出分离野外收集的具有典型核型多角体病毒病症的野桑蚕的多角体病毒(Wild Bombyx mori nuclear polyhedroris virus，w-BmNPV)，通过扫描电镜观察其外形和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedroris virus，BmNPV)的外形存在差异；利用野桑蚕病蚕的体液对该病毒进行空斑筛选，筛选后的病毒经家蚕细胞进行大量扩增，扩增后的病毒作为研究材料。 经电子显微镜观察，该病毒感染对象不管是家蚕和野桑蚕其外形六方形都不改变，而BmNPV在不同的环境条件下可表现为四方形和六方形的不同比例。也就是说w-BmNPV比BmNPV更稳定；同时也发现w-BmNPV的毒力比BmNPV更强。 对w-BmNPV和BmNPV以及(Antheraea paphia nuclear polyhedroris virus，ApNPV进行RAPD分析，研究结果表明，w-BmNPV和BmNPV不是同一种病毒；w-BmNPV和BmNPV的进化关系较近，而与ApNPV的进化关系较远。 通过对w-BmNPV的多角体蛋白基因polh基因的克隆和序列分析，结果发现，w-BmNPV的polh基因的ORF内有叁个碱基和BmNPV有差异，分别是+22、+703和+711，使+7位的Pro变成了Ser，使+229位的Pro也变成了Ser，+711位G变这A，没有引起该位点+231位Ala的改变。由Ser和Pro在形成蛋白二级结构的构象常数可知，w-BmNPV的多角体较BmNPV更稳定，证明了w-BmNPV的多角体蛋白较BmNPV更为稳定。
参考文献：
[1]. 人血小板因子4在家蚕细胞和幼虫体内的表达[D]. 于威. 浙江大学. 2001
[2]. 人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达[J]. 于威, 金勇丰, 吴玉澄, 张耀洲. 蚕业科学. 2001
[3]. 大肠杆菌中多顺反子表达人血小板因子4[D]. 段毅涛. 天津大学. 2012
[4]. 猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因融合表达载体的构建及初步表达[D]. 郑小坚. 苏州大学. 2003
[5]. 家蚕核多角体病毒Bac-to-Bac系统的构建及Bm21的功能分析[D]. 黄金山. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2007
[6]. 野桑蚕体内分离的NPV和BmNPV的比较研究[D]. 李兵. 苏州大学. 2003