陈晓栋[1]2002年在《纤维化相关细胞因子受体在瘢痕疙瘩中表达的研究》文中研究指明瘢痕疙瘩本质上是一种皮肤伤口的病理愈合过程，其最显着的特征是成纤维细胞持续活化所产生的细胞外基质(ECM)成分，尤其是胶原的过度堆积，导致真皮的纤维化。本研究立足于瘢痕疙瘩纤维化的效应细胞——成纤维细胞，研究了瘢痕疙瘩在部分纤维化相关细胞因子受体、促血管生成的胸苷磷酸化酶和极具潜在治疗价值的结缔组织生长因子方面的表达情况，及其与正常成纤维细胞的差异。全文研究内容共分叁个部分： 第一部分：纤维化相关细胞因子受体在瘢痕疙瘩中表达的研究 选取了部分具代表性的促进纤维化的细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍化生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化和Western blot分别检测上述叁个细胞因子受体在瘢痕疙瘩组织和瘢痕疙瘩来源成纤维细胞中的表达情况。结果发现在瘢痕疙瘩组织中，表达增高的有转化生长因子-βⅡ型受体(TβRⅡ)和血小板衍化生长因子受体(PDGFR)-β。而TβRⅠmRNA和蛋白表达与正常对照并未明显增多。PDGFR-α在瘢痕疙瘩中的表达似与瘢痕疙瘩的临床生长状态有关。在边缘充血、浸润生长明显的皮损，PDGFR-α呈强烈表达；而在边缘稳定、无明显浸润态势之皮损，PDGFR-α呈低表达。在瘢痕疙瘩组织中IGF-ⅠR表达似与瘢痕疙瘩发生的诱因有关。其中急性损伤后的瘢痕疙瘩中表达明显增高，而在缓慢发生的瘢痕疙瘩中表达没有改变。体外成纤维细胞培养Western blot结果显示瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)中TβRⅡ、PDGFR-α和-β表达明显高于正常成纤维细胞(NFs)，而TβRⅠ和IGF-ⅠR在KFs和NFs中表达无明显差异。综合上述结果，我们得出下列结论：①TβRⅡ水平的增高可能赋予了KFs对TGF-β更高的敏感性，从而产生大量的细胞外基质，最终导致瘢痕疙瘩的形成；②两种PDGF受体的表达增高导致KFs对PDGF敏感性的提高，决定了PDGF在瘢痕疙瘩发病机制中的作用；③IGF-ⅠR在KFs中的表达可能主要取决于局部微环境因素，而不是遗传背景所致。
雷睿[2]2017年在《缺氧诱导因子-1α及其相关信号通路促进瘢痕疙瘩形成的作用机制研究》文中研究表明研究背景瘢痕疙瘩是创口过度愈合导致的一种病理性纤维化形成,表现为超出创口边缘的持续性瘤样增生并侵犯邻近组织,常伴疼痛及瘙痒,不能自行退化。单纯手术切除后也极易复发,常造成外观畸形和功能障碍,严重影响患者身心健康与社会功能,是整形外科界长期以来的重大难题之一。尽管国内外众多学者进行了大量研究,但至今其病因及发病机制仍未完全明了。目前普遍认为瘢痕疙瘩处于相对缺氧的状态,而瘢痕疙瘩形成过程中炎症反应及高代谢状态又加剧了组织缺氧。因而推测缺氧在瘢痕疙瘩发生发展过程中起重要作用。缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是介导细胞缺氧应激反应与调节缺氧细胞生物学行为的核心因子,它是一种异源二聚体,主要由功能性亚基HIF-1α和结构性亚基HIF-1β两个亚单位组成。作为低氧应答的中枢性调控因子,HIF-1α表达严格地受氧浓度调节。在常氧条件下,HIF-1α蛋白可经泛素-蛋白酶解途径被迅速降解;而缺氧时则抑制其降解,使HIF-1α蛋白表达增加,并通过入核与靶基因特定DNA序列结合而激活靶基因表达,引起细胞对缺氧的一系列适应性反应。大量研究表明HIF-1α能够直接或间接地调节上百种缺氧适应性基因的表达,在肿瘤及血管生成、细胞能量代谢、创面愈合、炎症反应、纤维化疾病、肿瘤放化疗抵抗等方面发挥着重要作用目前国内外对瘢痕疙瘩中缺氧及HIF-1α诱导的信号通路机制的研究还很少。本课题根据瘢痕疙瘩的生物学特性与恶性肿瘤类似的特点,借鉴HIF-1α在肿瘤学、创面愈合及纤维化疾病领域的研究成果;结合我们前期研究结果:人瘢痕疙瘩组织中HIF-1α及TLR4表达水平显着高于正常瘢痕,HIF激动剂去铁胺(DFO)能诱导大鼠皮肤出现与瘢痕疙瘩类似病理性修复,主要表现为成纤维细胞过度增殖。在此研究基础上本论文进一步深入研究,从分子水平检测缺氧条件下HIF-1α与瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学改变的关联,明确HIF-1α及其调控的复杂网络缺氧信号通路在瘢痕疙瘩形成中的作用和机制,并在动物模型上证明HIF-1α抑制剂可以明显减少瘢痕疙瘩的生长,为瘢痕疙瘩临床防治及HIF-1靶向新药研发提供依据。研究目的1.比较瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织中HIF-1α的表达定位及表达差异情况。2.比较体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤组织中成纤维细胞HIF-1α的表达定位及表达差异情况。3.明确缺氧条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞HIF-1α的表达情况及其调控的缺氧通路对其细胞增殖、周期及凋亡的影响;明确HIF-1α对瘢痕疙瘩的过度生长特性有着重要的调控作用。4.明确HIF-1α在瘢痕疙瘩成纤维细胞中调控的缺氧通路包括TGF-β/Smαds通路、TLR4/MyD88/NFκB通路、ERK通路之间存在的相互作用关系并促进瘢痕疙瘩的形成发展。5.动物裸鼠移植瘢痕疙瘩模型证明HIF-1α抑制剂(2-甲氧基雌二醇,2-ME2)减少瘢痕疙瘩组织。研究方法1.第一部分通过RT-PCR、Western Blot及免疫组化检测瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织中HIF-1α的表达差异;体外培养人瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞,RT-PCR和Western Blot检测瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)与正常皮肤组织成纤维细胞(NFs)中HIF-1α的表达差异。使用1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气混合气体作为培养细胞供应气体,构建缺氧模型,通过Western Blot、免疫荧光检测缺氧与常氧条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞的HIF-1α的表达差异。2.第二部分利用RNA干扰技术沉默HIF-1α的表达,不同条件处理细胞后将瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)分为常氧组,缺氧组,con-siRNA组(缺氧Control siRNA对照组),HIF-1α-siRNA组(缺氧HIF-1α siRNA沉默组),分别通过CCK8试验、流式细胞仪检测上述四组细胞的增殖、周期及凋亡情况。3.第叁部分通过Western Blot分别检测常氧组,缺氧组,con-siRNA组(缺氧 Control siRNA 对照组),HIF-1α-siRNA 组(缺氧 HIF-1α siRNA 沉默组)瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)中的HIF-1α、TGF-β/Smad信号通路、TLR-MyD88-NF-κB通路及ERK1/2通路的相关蛋白的表达差异,并通过Elisa检测上述四组细胞上清液中TGF-β1、CTGF、VEGF、IL-6及IL-8的表达差异;然后用NF-κB抑制剂处理KFs细胞后再次检测相关信号通路蛋白的变化。4.第四部分BALB/C裸鼠移植瘢痕疙瘩组织模型造模成功后,予以连续腹腔注射HIF-1α抑制剂(2-甲氧基雌二醇,2-ME2)21天,大体观察比较瘢痕疙瘩的形态大小及相关组织学分析。研究结果1.第一部分瘢痕疙瘩组织中HIF-1α广泛分布在其真皮层以及表皮基底层和少量棘层细胞中,主要环绕细胞核存在于细胞质中,而正常皮肤成纤维细胞中几乎观察不到HIF-1α的存在。瘢痕疙瘩组织及KFs中HIF-1α在转录水平和蛋白水平均高于正常皮肤组织及NFs,P<0.05;常氧条件下KFs中HIF-1α表达极低,仅见少量分布于细胞浆,而在缺氧条件下KFs表达HIF-1α蛋白水平显著增高,在细胞核与细胞浆中均明显表达增多。2.第二部分KFs在缺氧条件下表达HIF-1α的水平显著高于常氧组;缺氧组KFs较常氧组细胞增殖速度明显加快、G1期细胞百分比相似、凋亡细胞百分比相似;HIF-1α-siRNA转染KFs细胞后,而缺氧组KFs细胞HIF-1α表达降低,其增殖速度随之减慢、G1期细胞百分比显着升高,凋亡细胞百分比较也显着升高;而con siRNA组较缺氧组在细胞增殖、周期及凋亡均相似,无显着性差异。3.第叁部分缺氧组 KFs 中表达 TGF-βIIR、TLR-4、MyD88 及 p-Smad2/3、NF-κB、ERK1/2 的水平及该组细胞上清液中 TGF-β1、CTGF、VEGF、IL-6、IL-8的含量均明显高于常氧组,P<0.05;而当HIF-1α基因表达被干扰后,缺氧租KFs细胞中上述蛋白的表达又明显降低,P<0.05;consiRNA组上述蛋白的表达与缺氧组无明显差异。另外,当使用NF-κB抑制剂处理KFs细胞后我们发现不仅TLR4/Myd88/NF-KB通路被抑制,TGF-β/smad通路也随之被抑制,其下游分子TGF-β、CTGF,VEGF的表达均降低。4.第四部分HIF-1α抑制剂在活体裸鼠体内对瘢痕疙瘩具有一定的抑制作用。瘢痕疙瘩组织移植于裸鼠肩胛区皮下21天后予以HIF-1α抑制剂腹腔注射干预3周后可见瘢痕疙瘩体积明显少于溶剂对照组及空白对照组,其主要抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长,Masson染色显示HIF-1α抑制剂组瘢痕疙瘩组织染色明显少于溶剂对照组及空白对照组。结论1.瘢痕疙瘩组织及其成纤维细胞表达HIF-1α水平均高于正常皮肤组织及成纤维细胞。缺氧条件下KFs表达HIF-1α蛋白水平显著高于常氧。2.缺氧条件下HIF-1α表达增高能明显促进KFs细胞的增殖活力,减少细胞凋亡水平。3.缺氧条件下HIF-1α可以:1.激活TGF-β/Smad信号通路促进下游TGF-β、CTGF和VEGF的表达;2.激活TLR4-MyD88-NF-κB信号通路促进下游IL-6的表达;3.激活ERK1/2促进下游IL-8的表达,进而促进瘢痕疙瘩形成。另外,在KFs细胞中HIF-1α诱导的TLR4-MyD88-NF-Kb通路可能与TGF-β/Smad通路有着crosstalk 作用。4.HIF-1α抑制剂(2-ME2)裸鼠腹腔注射21天后,其皮下移植的瘢痕疙瘩组织体积明显减小,胶原纤维较为疏松。
陈晓栋, 张国成[3]2002年在《促纤维化细胞因子与瘢痕疙瘩》文中研究说明瘢痕疙瘩成纤维细胞是具有独特遗传素质的成纤维细胞亚群 ,对 β 转化生长因子、血小板衍化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子 Ⅰ、结缔组织生长因子等具有与正常成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞不同的反应。这种反应的差异极可能源自相关细胞因子受体水平的改变
陈莹[4]2014年在《Duffy抗原趋化因子受体（DARC）在瘢痕疙瘩成因中的作用》文中指出一、研究背景及目的瘢痕疙瘩是一类创伤异常愈合所致的疾病,主要以纤维组织异常增殖以及胶原纤维过量沉积为主要标志,通常在创伤后持续存在,不能自行消退,且常超过原创伤范围,侵犯周围正常的皮肤组织。瘢痕疙瘩不仅会导致持续的瘙痒以及疼痛等症状,还会导致功能异常甚至畸形,严重影响外观,给患者带来严重的心理及生理的困扰。因此,瘢痕疙瘩是整形外科面临的重大难题之一。但由于瘢痕疙瘩形成的病因尚不十分明确,对于瘢痕疙瘩的预防及治疗方案也尚难统一。所以,找寻瘢痕疙瘩的主要致病因子是诊断及治疗瘢痕疙瘩的关键。目前针对瘢痕疙瘩的研究多集中在以下3个方面：(1)细胞外基质蛋白的沉积以及降解,(2)细胞因子和生长因子,(3)凋亡通路。我们既往的研究已经对凋亡通路有了一定的探索,但仍然未能找到瘢痕疙瘩形成的关键原因。鉴于各种细胞因子与瘢痕疙瘩形成关系密切,因此我们针对细胞因子中的趋化因子及其受体进行了新的探索。趋化因子是一类与炎症介质密切相关的小分子蛋白质家族,与多种器官的炎症反应,肿瘤转移还有组织纤维化密切相关。趋化因子可促进炎症反应,血管形成,协助白细胞从血液循环进入组织,在炎症反应中,趋化因子可为细胞提供相互联系,趋化因子信号转导是炎症细胞从血管中迁移粘附血管壁的关键因素。关于趋化因子与瘢痕疙瘩的研究已经展开。MGSA/GRO α以及其受体CXCR2仅在瘢痕疙瘩组织中检测到表达,而增生瘢痕和正常上皮组织中则没有检测到其表达。并且其免疫组化的染色阳性率与该区域炎症反应的程度呈正相关。此外还有报道关于MCP-1及其受体CCR2过度活跃与各种纤维化的病理过程密切相关,并且在多种纤维化疾病中起着关键作用。而趋化因子需与其相应受体结合而发挥作用。DARC(Duffy antigen receptor for chemokines; Dufy antigen/receptor for chemokines, DARC)即达菲抗原受体或称达菲抗原/趋化因子受体,是一个重要的趋化因子诱骗受体,该受体首先是在血友病患者中发现。它是红细胞膜上的糖蛋白,能够结合CC族和CXC族趋化因子的杂性趋化因子受体。作为典型的趋化因子诱骗受体,DARC只与具有促进血管生成作用的趋化因子结合,由于缺乏位于第2个胞内环上的与G蛋白偶联受体相似的7次跨膜糖蛋白,与配体结合后并不引起细胞信号转导和细胞代谢的改变。有研究发现除了在红细胞上有表达外,DARC同样也在内皮细胞、淋巴结、淋巴管上皮细胞、血管静脉和肺、肾上皮细胞中同样有表达。DARC在炎症反应中发挥着重要的作用,主要通过对其受体的调节,调控白细胞的归巢,影响炎症反应,炎症反应可以上调DARC的表达,而DARC的表达也可以对炎症反应进行调控。DARC在不同时期发挥的不同作用主要包括：1)趋化因子释放入血；2)血液中趋化因子的改变；3)血浆中趋化因子的转录后调控；4)趋化因子相关的DARC开／关比率；5)依赖DARC的转运机制。DARC的表达还与许多肿瘤呈负相关,如前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌以及食管癌中都发现DARC高表达患者其预后优于低表达者。尽管瘢痕疙瘩是一种良性的上皮纤维异常增殖性肿瘤,没有恶性征象,但瘢痕疙瘩的某些特征,包括持续性生长,超出原有创伤范围,切除后容易复发等,又与恶性肿瘤有一定相似性。至今尚未有关于DARC与瘢痕疙瘩相关性,以及其在瘢痕疙瘩形成过程中所占的地位的报道,鉴于DARC对趋化因子调节的重要地位和其在炎症反应,以及肿瘤发生发展中所起的作用,瘢痕疙瘩的部分恶性肿瘤征象等理由,我们猜想DARC的表达可能与瘢痕疙瘩的形成有着一定的相关性。若能弄清DARC在瘢痕疙瘩形成中的作用,势必为瘢痕疙瘩的治疗和预防打开新的思路。为了研究DARC在瘢痕疙瘩和正常皮肤中的表达情况及其在瘢痕疙瘩形成中的作用与机制,我们首先对不同的人瘢痕疙瘩和正常皮肤进行了检测,以确定它们表达DARC的情况。并且分离培养了部分瘢痕疙瘩患者和正常皮肤组织中的成纤维细胞,对其中DARC的mRNA含量及蛋白含量进行分析。此外还对其部分受体(?)IL-8,MCP-1以及与瘢痕疙瘩胶原沉积异常相关的MMP-2在瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞中的表达进行了研究,并且观察在DARC表达改变的情况下这些受体及蛋白的表达情况,还对DARC是否影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和细胞周期,及其迁移的影响进行了研究。本研究旨在为发现趋化因子受体在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及其对成纤维细胞生长、迁移的影响,并深入研究其机制,对瘢痕疙瘩的成因及从根本上治疗瘢痕疙瘩提供理论依据。二、材料与方法材料：收集2007年1月至2012年广东省中医院和南方医院病理确诊瘢痕疙瘩标本30例,以及正常对照皮肤30例。本研究事先得到南方医院相关审核部门的同意,所有研究对象签署知情同意书。指定2名对瘢痕疙瘩诊断和治疗具有丰富临床经验的整形外科医师,根据瘢痕疙瘩诊断标准,对所有研究对象进行全面的体格检查、详细的病史询问和准确的临床诊断,填写个人临床资料登记表,并严格遵照赫尔辛基宣言的规定采集他们的组织。方法：2.1瘢痕疙瘩中DARC表达的检测将组织用石蜡包埋后切成石蜡切片,经过免疫组化染色,检测组织中DARC的表达情况。检测新鲜瘢痕疙瘩及正常皮肤中DARCmRNA及蛋白含量。2.2细胞原代培养将3例瘢痕疙瘩和3例正常皮肤组织进行体外细胞培养,培养出相应的成纤维细胞。将传代小于15代的成纤维细胞用于以下实验。2.3运用siRNA干扰DARC表达取处于对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞接种于六孔板中,待其长至板底的60%-80%时依据转染试剂所提供步骤,各孔分别用细胞培养液+转染溶液；control siRNA+转染溶液,以及DARC siRNA+转染溶剂进行转染,转染后24h及48h分别检测DARC mRNA及其蛋白的表达,并进行其余相关实验。2.4细胞增殖影响将瘢痕疙瘩成纤维细胞按5000个/孔的浓度将处于对数期的细胞种至96孔板,基础培养基100m1,每孔设3个对照；分别在12h,24h,48h,72h对细胞增殖进行检测；在每孔细胞中加入10μCCK-8溶液,细胞培养箱内继续孵育1.5h；MD5多功能酶标仪在450nm测定吸光度。2.5细胞周期检测将细胞计数1×105/瓶的NF(正常皮肤成纤维细胞组),KFC(瘢痕疙瘩成纤维细胞空白对照组),KFP(瘢痕疙瘩成纤维细胞阴性对照组),KFS(瘢痕疙瘩成纤维细胞干扰组)细胞在转染后24h进行细胞周期检测我们通过流式细胞仪对细胞周期的变化进行检测。2.6细胞迁移的改变我们通过划痕实验和transwell实验对正常皮肤成纤维细胞以及转染后的瘢痕疙瘩成纤维细胞进行检测,观察其迁移能力和增殖能力改变的情况。2.7细胞上清液中蛋白的检测我们通过ELASA检测正常皮肤成纤维细胞以及转染后的瘢痕疙瘩成纤维细胞中IL-8, MCP-1和MMP2蛋白的表达及变化情况。叁、结果3.1DARC为胞膜和细胞浆着色,在正常皮肤及瘢痕疙瘩组织的阳性染色组织中,均可见部分染色的成纤维细胞的细胞浆及细胞膜。对比30例瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中成纤维细胞DARC表达情况,发现瘢痕疙瘩成纤维细胞的DARC高表达率高于正常皮肤组织。3.2通过进一步对3例瘢痕疙瘩组织和3例对照正常皮肤组织中DARC RNA以及蛋白的检测,同样发现瘢痕疙瘩组织中DRAC含量在mRNA水平与蛋白水平均高于正常皮肤。在对体外培养的3组瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞进行DARC RNA及蛋白检测后,发现其DARC表达与组织中的表达规律基本一致。3.3转染后的细胞生长曲线测定比较,发现转染DARC siRNA对细胞增殖并无明显影响,并且瘢痕疙瘩与正常细胞成纤维细胞生长增殖无显着差异。流式细胞仪检测发现DARC siRNA转染对细胞周期无明显影响,此外瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移能力弱于正常皮肤来源的成纤维细胞,而干扰DARC后瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移能力有了一定提高,但仍稍低于正常皮肤成纤维细胞。3.4DARC表达减低对IL-8, MCP-1, MMP-2mRNA的表达无明显影响。DARC表达减少可以增加MCP-1蛋白的分泌。我们研究发现DARC的表达高低对IL-8以及MCP-1mRNA的表达无明显影响。而当对DARC进行干扰后,我们发现与对照组相比,MCP-1在细胞上清中的含量增加,但仍稍低于正常皮肤来源的成纤维细胞。而DARC干扰对细胞上清液中IL-8以及MMP2蛋白的含量无明显影响。四、讨论我们的研究结果显示,虽然有一定的恶性肿瘤表型,但与恶性肿瘤不同的是,DARC在瘢痕疙瘩组织中无论在蛋白水平还是在转录水平均高于正常皮肤组织。说明瘢痕疙瘩的形成过程与恶性肿瘤细胞不同,不是各种致瘤因素所致,可能与伤口的异常愈合相关。创伤愈合需要复杂的细胞间相互作用,以及其调控因子的调节。组织创伤修复机制的变化受制于皮肤创伤的愈合。瘢痕疙瘩中常出现细胞迁移,增殖,炎症反应,细胞外基质蛋白与细胞因子的合成及分泌异常。炎症反应是创伤愈合过程的组成部分,一方面可以作为抗感染的免疫屏障,另一方面可以导致纤维增生,闭合创面。趋化因子在创伤愈合过程中的炎症反应和组织修复中都发挥着重要的作用。而皮肤由于感染等外在因素导致的慢性炎症反应常常是瘢痕疙瘩形成的重要诱因。趋化因子对白细胞聚集的有效调控的关键在于对其运动的趋化调节,即在准确的时间到达准确的位置,并且对其的功能在一定的时间和范围进行有效控制。趋化因子是通过与其受体的相互作用对白细胞产生趋化和激活作用,从而发挥其在炎症反应中的重要功效。瘢痕疙瘩中DARC表达改变,对成纤维细胞的的生长增殖无明显影响。而瘢痕疙瘩成纤维细胞体外培养伤口愈合能力弱于正常皮肤,这也是瘢痕疙瘩伤口愈合异常的表现。在对DARC进行干扰后,成纤维细胞的迁移能力有一定提高。说明DARC可能通过对其相应的配体的结合,而影响成纤维细胞的迁移,导致伤口延迟愈合。在对DARC相应配体及MMP-2的检测中,我们发现瘢痕疙瘩成纤维细胞中IL-8, MCP-1, MMP-2的mRNA含量高于正常皮肤成纤维细胞,但仅有MCP-1在细胞上清中的表达低于正常皮肤成纤维细胞,并且MCP-1的表达受DARC的调控。在组织创伤后的炎症反应中,趋化因子的主要作用是诱导炎症因子在合适的试剂到达合适的位置,为了达到这样的效果,趋化因子的调控必须精确。炎症反应区域趋化因子及其受体的表达上调对于局部炎症细胞的快速聚集有重要意义。我们认为在瘢痕疙瘩成纤维细胞中,DARC可能通过与MCP-1的结合,引起MCP-1的分泌减少。导致局部炎症反应不平衡,形成慢性炎症反应。而DARC并不在基因水平上影响其配体的表达,DARC对其配体的下调作用是一种翻译后的调控因素,是发生在蛋白质水平的,而这种作用并不影响细胞内的信号通路,不影响细胞的增殖等生物学行为,是一种趋化因子的翻译后调控。本实验首次对诱骗受体DARC在瘢痕疙瘩中的表达,及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长、迁移的影响进行了研究,并初步探讨了相关机制,为瘢痕疙瘩的病因研究打开了新的思路,也为进一步研究趋化因子及其受体在瘢痕疙瘩中形成中的作用奠定了一定的实验基础。五、结论5.1.与恶性肿瘤细胞DARC表达相反,DARC在瘢痕疙瘩组织成纤维细胞中表达高于正常皮肤组织的成纤维细胞；5.2.DARC并不对瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖产生影响,但我们的研究发现DARC可能会抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移,造成创口愈合异常,对其进行干扰后瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移能力有一定提高。5.3.DARC可能通过某种转录后调控的方式,抑制MCP-1的分泌,使成纤维细胞MCP-1分泌减少,由于DARC表达异常,导致其相关趋化因子调控异常,造成炎症反应不平衡,形成持续的炎症反应,导致组织损伤和慢性炎症形成,是瘢痕疙瘩形成的可能因素。
郭帅[5]2006年在《胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体在瘢痕疙瘩中的表达》文中研究表明目的:本研究通过观察胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其受体IGF-ⅠRα在瘢痕疙瘩中的表达情况,以探讨IGF-Ⅰ及其受体与瘢痕疙瘩发病的关系,从而为临床治疗提供理论基础。方法:应用免疫组织化学SABC法检测8例瘢痕疙瘩组织、8例增生性瘢痕、8例成熟瘢痕和8例正常皮肤中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠRα的定位和表达,然后进行统计学分析。结果:所有皮肤组织的表皮层中均有IGF-Ⅰ和IGF-ⅠRα的表达。正常皮肤成纤维细胞中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠRα均为阴性。IGF-Ⅰ蛋白在成熟瘢痕、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞中阳性率分别为为9.65%、68.45%、70.83%,瘢痕疙瘩组和增生性瘢痕组与成熟瘢痕组之间比较均有非常显着性差异(P <0.01);而瘢痕疙瘩组的IGF-Ⅰ蛋白阳性率与增生性瘢痕组没有显着性差异(P >0.05)。IGF-ⅠRα蛋白在成熟瘢痕、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞中阳性率分别为6.55%、53.03%、68.93%。瘢痕疙瘩组和增生性瘢痕组与成熟瘢痕组之间比较均有非常显着性差异(P <0.01);瘢痕疙瘩组的阳性表达率与增生性瘢痕组有显着性差异(P <0.01)。结论:IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR在瘢痕疙瘩中的过量表达可能是瘢痕疙瘩形成的发病机制之一。
魏斌[6]2008年在《瘢痕疙瘩发病机制初步探讨：siRNA沉默成纤维细胞PTGS2基因表达的实验研究》文中研究表明目的:研究瘢痕疙瘩的发病机理,在基因水平上探索防治瘢痕疙瘩的新途径。1.利用real time PCR验证特异性靶基因在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中的表达差异;2.利用siRNA沉默特异性表达基因,并在基因和蛋白水平验证干扰效果;3.用全基因组芯片检测siRNA沉默特异性表达基因后,成纤维细胞基因表达变化效果。方法:1.瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织成纤维细胞的培养。2.利用RealTimeRT-PCR验证PTGS2、NFKBIA、CCNA2、MIF、EGFR和FDPS在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中的表达差异。3.成纤维细胞转染条件优化实验4.对筛选出的靶基因PTGS2进行siRNA干扰。5.在基因和蛋白水平验证siRNA沉默效果。6.用全基因组芯片检测成纤维细胞靶基因被siRNA沉默后基因表达变化。结果:1.与前期研究所做的基因芯片结果对照,筛选出PTGS2基因与基因芯片结果一致,且差异明显。2.siRNA干扰后,PTGS2基因在mRNA和蛋白水平表达明显下调。3.成纤维细胞PTGS2基因沉默后全基因组芯片检测与沉默前相比,发生差异表达变化的基因,按1.5倍差异共有189个,其中上调115个,下调74个。按2倍差异共有14个基因,其中5个下调,9个上调。结论:1.PTGS2基因与瘢痕疙瘩的发病机理有着密切的关系。2.siRNA干扰技术提供了在基因水平上探索防治增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的新途径。
刘杜鹃[7]2013年在《BMP-7与TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表达及意义》文中提出目的：通过免疫组织化学(SP法)检测骨形态发生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,BMP-7)与转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)在瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常皮肤中的表达,并进行统计学分析,探讨BMP-7与TGF-β1在瘢痕疙瘩形成中的作用。方法：采集临床标本52例,分为瘢痕疙瘩组(n=17),扁平瘢痕组(n=19),正常皮肤组(n=16)。标本经石蜡包埋、切片后应用免疫组织化学法(SP法)检测各标本切片中BMP-7与TGF-β1的表达,分析BMP-7与TGF-β1在叁组实验标本中的表达差异及相关性,用SPSS18.0统计软件进行相应统计学分析。结果：①BMP-7在瘢痕疙瘩组中的阳性表达率为17.6%；在扁平瘢痕组中的阳性表达率为63.2%；在正常皮肤组中的阳性表达率为81.3%。BMP-7在瘢痕疙瘩组的表达水平与正常皮肤组相比有显着差异(P<0.01)；BMP-7在瘢痕疙瘩组的表达水平与扁平瘢痕组相比有显着差异(P<0.01)；BMP-7在扁平瘢痕组的表达水平与正常皮肤组相比无统计学意义(P>0.05)。②TGF-β1在瘢痕疙瘩组中的阳性表达率为94.1%；在扁平瘢痕组中的阳性表达率为52.6%；在正常皮肤组中的阳性表达率为6.3%。TGF-β1在瘢痕疙瘩组的表达水平与正常皮肤组相比有显着差异(P<0.01)；TGF-β1在瘢痕疙瘩组的表达水平与扁平瘢痕组相比有显着差异(P<0.01)；TGF-β1在扁平瘢痕组的表达水平与正常皮肤组相比有显着差异(P<0.05).③BMP-7与TGF-β1在瘢痕疙瘩组中的表达具有相关性(P<0.01),呈负相关性(R=-0.681)。结论：①BMP-7在瘢痕疙瘩中低表达。②TGF-β1在瘢痕疙瘩中高表达。③在瘢痕疙瘩中,BMP-7与TGF-β1的表达呈负相关。
杨圣菊[8]2007年在《β-1，4半乳糖基转移酶-I与瘢痕疙瘩胶原合成的初步研究》文中研究指明目的:研究β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase-I,β-1,4GalT-I)在瘢痕疙瘩中的表达变化,以及β-1,4GalT-I与胶原合成的关系,初步探讨β-1,4GalT-I在瘢痕疙瘩纤维化进程中的作用。方法:收集瘢痕疙瘩标本10例,同时以正常人皮肤6例、增生性瘢痕7例作对照,常规制备冰冻切片,H-E染色、饱和苦味酸-天狼猩红偏振光法观察组织学结构及胶原的形态与分布,运用形态学图象分析软件计算组织中I、III型胶原的比例;试剂盒法检测标本中的羟脯氨酸(Hydroxyproline, HP)含量,估算其中胶原蛋白的含量,观察瘢痕疙瘩胶原合成情况;采用半定量RT-PCR法观察瘢痕疙瘩中β-1,4GalT-I的表达变化,以各泳道中β-1,4GalT-I与GAPDH条带的光密度比值表示β-1,4GalT-I mRNA的相对表达量,使用Stata7.0统计学软件进行单因素方差分析和两两比较,并应用相关分析判断各组织中β-1,4-GalT-I mRNA表达量与组织中胶原含量的相关性。结果:⑴与正常人皮肤相比,瘢痕疙瘩中真皮乳头层丰富,网状层增厚,含有大量胶原纤维束,粗大致密,排列密集,呈漩涡状的结节或板层状,其中成纤维细胞、毛细血管以及炎症细胞亦增多。⑵偏振光显微镜显示瘢痕疙瘩组织中含有大量且粗大致密的,发出强烈的红或黄色双折射光的I型胶原纤维,呈大块状或条索状分布,多呈波纹状平行排列,构成致密的宽带状纤维结构,约占(71.53±4.03)%;在I型胶原纤维束的周围区域可见散在的、发弱的绿色双折射光的、呈疏网状的III型胶原细纤维,约占(28.47±4.03)%,I、III型胶原比例为(2.56±0.53);与正常人皮肤组比较均有统计学意义(P<0.05);与增生性瘢痕组比较差异无显着性(P>0.05)。⑶瘢痕疙瘩组织中HP含量为(10.98±1.55)μg/mg,明显高于正常人皮肤组织(5.38±0.47)μg/mg,差异有统计学意义(P<0.01),与增生性瘢痕组(10.21±1.25)μg/mg比较差异无显着性(P>0.05),提示瘢痕疙瘩和增生性瘢痕纤维化程度明显高于正常人皮肤组。⑷瘢痕疙瘩组织中β-1,4-GalT-I mRNA的相对表达量为(0.2995±0.0825),也明显高于正常人对照(0.0451±0.0287),差异有统计学意义(P<0.01),与增生性瘢痕组(0.2769±0.0975)比较差异无显着性(P>0.05);β-1,4-GalT-I表达的高低与组织中胶原的含量具有相同的变化趋势,二者成正相关关系(r=0.9507,P<0.01)。结论:β-1,4-GalT-I表达的高低与瘢痕疙瘩组织中胶原合成密切相关,β-1,4-GalT-I可能参与了瘢痕疙瘩的发病过程并在胶原合成过程中发挥重要作用。目的:研究瘢痕疙瘩组织中β-1,4-糖苷键的合成及定位,探讨糖蛋白半乳糖基化作用在瘢痕疙瘩形成中的作用。方法:提取组织蛋白利用Lectin blotting法观察Galβ-1→4GlcNAc在瘢痕疙瘩组织中的表达;再利用特异性结合Galβ-1→4GlcNAc的RCA-I凝集素免疫荧光组织化学法检测Galβ-1→4GlcNAc在瘢痕疙瘩组织中的表达与定位,并与I型前胶原α1共定位,比较β-1,4-糖苷键在叁组组织中的表达变化。结果:⑴糖链染色结果发现,瘢痕疙瘩组织中的Galβ→1,4GlcNAc糖链结构与正常人皮肤组织之间有着细微的差别,在约30KD和40KD处的糖蛋白表达略增高,这表明瘢痕疙瘩组织中的部分糖蛋白半乳糖基化发生了相应的改变。⑵荧光显微镜下观察组化结果发现RCA-I受体——Galβ-1,4GlcNAc group基本均匀分布在瘢痕疙瘩组织成纤维细胞胞膜和细胞浆内,与正常人皮肤相比,该受体的表达量明显增加;增生性瘢痕组织成纤维细胞中有类似的表现。⑶RCA-I受体与I型前胶原α1有很好的共定位,主要位于成纤维细胞细胞膜和细胞浆内,在增生性瘢痕组织成纤维细胞中分布大致相同,表达量也明显增加,。结论:Galβ-1,4GlcNAc在瘢痕疙瘩组织中的表达量发生了变化,提示Galβ-1,4GlcNAc可能参与了瘢痕疙瘩修复过程中纤维过度形成的修饰调控。
曾碧薇[9]2012年在《瘢痕疙瘩形成中TLR4、7与Smad信号通路的相关性研究》文中研究表明[背景]瘢痕疙瘩(Keloid)是以皮肤损伤后真皮异常纤维增生反应为特征的病理性组织,表现为超过损伤境界的持续性瘤样瘢痕增生,不会自行退化,手术切除后也极易复发。目前研究显示瘢痕疙瘩与TGF-β受体启动的Smad信号通路密切相关；TLR4、7可能通过Smad信号通路对瘢痕疙瘩的形成起到调控作用。[目的]探究TLR4、7在瘢痕疙瘩中的表达以及它们的表达与Smads是否有相关性,有助于进一步了解临床瘢痕疙瘩的形成机制,并为进一步治疗瘢痕疙瘩提供研究基础。[方法]通过免疫组化、RT-PCR.和WesternBlot分别检测瘢痕疙瘩组织和非病理性瘢痕组织中TLR4、7, Smad4、7,细胞外基质(ECM)中胶原蛋白(GOL)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达量进行检测并对比分析其相关及差异性。[结果]组化染色显示：瘢痕疙瘩组织中TLR4表达较非病理性瘢痕组织增加,而TLR7在瘢痕疙瘩中表达量降低；Smad4、CTGF和GOL在瘢痕疙瘩组织中均明显增加；RT-PCR和WesternBlot检测结果发现瘢痕组织中TLR4,Smad4,CTGF, GOL转录和蛋白水平均较非病理性瘢痕组织明显增加,而TLR7、Smad7水平低表达或没有相应的增高。[结论]TLRs可以通过TLRs-TGF-β-Smads信号通路参与瘢痕组织纤维化过程。TLR4在瘢痕疙瘩组织中的表达明显高于非病理性瘢痕组织,并通过Smad4增加引起TGF-p及后续CTGF和GOL表达的增加,提示TLR4通过Smad4通路的高表达可能促进了瘢痕疙瘩的形成。而TLR7、Smad7在瘢痕疙瘩组织中低表达或未见相应的增高,提示激活TLR7、Smad7可能有抗瘢痕作用。
朱华宇[10]2018年在《长链非编码RNA-UCA1通过miR-18a靶向YAP1调控乳腺癌曲妥珠单抗耐药》文中进行了进一步梳理【背景】据美国癌症协会最新流行病学调查数据显示,乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤首位。人表皮生长因子受体2(英文名为Human epidermal growth factor receptor-2,英文简称为HER2)在约20%~25%乳腺癌患者中过度表达,与疾病进展及预后密切相关,是乳腺癌治疗的重要靶点之一。HER2靶向药物—曲妥珠单抗(Trastuzumab,商品名Herceptin,赫赛汀)在乳腺癌治疗中具有较大的临床获益。最近的研究发现非编码RNA在调控肿瘤耐药方面发挥重要作用。微小RNA(miRNA)通过靶向降解靶mRNA调控基因表达。我们连续的研究表明,miR-200c(Bai et al,Int J Cancer,2014)、miR-221(Ye et al,BMB Rep,2014)和miR-375(Ye et al,BMC Cancer,2014)等广泛参与乳腺癌HER2靶向治疗的耐药调控。这些结果说明miRNA在乳腺癌HER2靶向治疗耐药中扮演重要角色。然而,miRNA仅仅是转录后调节的一个作用环节,并不能完全解释乳腺癌HER2靶向治疗耐药相关基因的异常表达。近年来,长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)被证明在多种疾病中调控基因异常表达,且与肿瘤细胞增殖、迁移、血管生成、侵袭、转移和抗肿瘤药物耐药性有关。然而,是否有与曲妥珠单抗耐药有关的LncRNA同时调控细胞恶性转化?LncRNA与miRNA以及靶基因的mRNA如何相互作用?这些RNA调控网络又是如何参与乳腺癌耐药?这些问题目前仍未阐明。瘢痕疙瘩是一种皮肤良性肿瘤,其特征是成纤维细胞过度生长和胶原过度沉积在受损伤的皮肤细胞外基质中。许多研究表明PPAR-γ激动剂在肾脏、肝脏、胰腺和肺部具有抗纤维化作用,表明PPAR-γ激动剂可能成为一种有前途的控制纤维化疾病的药物。人工合成的PPAR-γ激活剂,如曲格列酮等能激活PPAR-γ。PPAR-γ是核受体,能够与靶基因的DNA上的过氧化物酶体增殖激素应答元件(PPRE)结合激活转录,从而调节多种生理现象。然而,尽管我们认识到PPAR-γ激动剂抗纤维化的功能,但是在瘢痕疙瘩成纤维细胞中PPAR-γ激动剂抗纤维化作用的分子机制仍有待确定。研究显示,部分微小RNA(miRNA)具有调控纤维化的作用。我们连续的研究表明,miR-21和miR-145广泛参与皮肤纤维化进程。然而,是否有与PPAR-γ激动剂治疗抗纤维化作用有关的miRNA参与瘢痕发生?PPAR-γ激动剂如何在瘢痕疙瘩中调控miRNA?miRNA以及靶基因又是如何参与PPAR-γ激动剂拮抗瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原生成?这些问题亟需解答。【目的】通过本研究的实施,鉴定乳腺癌曲妥珠单抗耐药细胞中与耐药相关的长链非编码RNA,并筛选出受到该长链非编码RNA调控的miRNA分子以及靶基因,进而从LncRNA“海绵吸附”miRNA的机制出发,探讨长链非编码RNA在乳腺癌耐药过程中的功能,并为乳腺癌治疗提供新的靶点分子和策略。通过本研究的实施,验证PPAR-γ激动剂抑制瘢痕疙瘩胶原合成的现象,并筛选出受到PPAR-γ激动剂调控的miRNA分子及其靶基因,探讨靶基因Egr1对胶原生成的影响,并为瘢痕疙瘩治疗提供新的候选靶点。【方法】1.采用qRT-PCR分析UCA1、miR-18a和YAP1的表达;2.通过细胞增殖实验分析UCA1对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞增殖的影响,并测定曲妥珠单抗半数致死浓度;3.通过流式细胞术凋亡分析检测UCA1对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞凋亡的影响;4.通过Transwell细胞侵袭实验分析UCA1对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞侵袭能力的影响;5.生物信息学方法预测UCA1和miR-18a、miR-18a和YAP1的结合位点;6.利用荧光素酶报告基因实验分析UCA1和miR-18a、miR-18a和YAP1的结合情况;7.采用生物素下拉实验检测UCA1和miR-18a相互结合;8.采用瞬时转染分析干涉UCA1、miR-18a和YAP1的表达对上下游基因表达的影响。1.采用qRT-PCR分析Egr1、miRNA和Col1的表达;2.通过蛋白印迹和酶联免疫吸附实验检测Egr1和Col1蛋白含量;3.通过免疫组化实验检测瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中Egr1的表达;4.通过miRNA芯片高通量筛选PPAR-γ激动剂处理后瘢痕疙瘩成纤维细胞的miRNA表达谱,筛选出能够调控胶原的miRNA分子(miR-543);5.通过瞬时转染检测miRNA对胶原分泌的影响;6.通过染色质免疫沉淀实验检测PPAR-γ在miR-543启动子区的结合;7.生物信息学方法预测miR-543启动子区的过氧化物酶体增殖激素应答元件序列,以及miR-543和Egr1的结合位点;8.利用荧光素酶报告基因实验分析miR-543和Egr1结合情况。【结果】1.qRT-PCR结果显示,长链非编码RNA-UCA1在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞中表达升高;2.UCA1干涉结果显示,干涉后长链非编码RNA-UCA1在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞中显着降低;3.细胞增殖实验和细胞侵袭实验的结果显示,UCA1干涉显着降低曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞增殖和侵袭能力;4.生物素RNA下拉结果显示,UCA1和miR-18a在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞中相互结合;5.生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验证实UCA1能“海绵吸附”miR-18a,并且这种吸附作用依赖两者的结合位点;6.qRT-PCR结果显示,降低UCA1能显着升高miR-18a的水平,而升高的miR-18a抑制YAP1的表达;7.生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验证实,miR-18a能靶向抑制YAP1,并且这种抑制作用依赖于两者的结合位点;8.qRT-PCR和蛋白印迹实验结果显示,降低UCA1和YAP1能显着抑制促细胞分裂的分子的表达,提高促药物敏感性蛋白的表达量;9.干涉UCA1实验发现,在miR-18a干涉的条件下,UCA1不能对miR-18a下游基因进行调控。1.qRT-PCR结果显示,在瘢痕疙瘩成纤维细胞中,Egr1和Col1在接受PPAR-γ刺激下降低,而miR-543表达升高;2.蛋白印迹和酶联免疫吸附实验显示,Egr1和Col1蛋白表达水平一致;3.miRNA芯片结果显示,miR-543等miRNA在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达异常,qRT-PCR证实了芯片检测结果;4.生物信息学结果显示,miR-543启动子区有过氧化物酶体增殖激素应答元件序列,在Egr1的3’UTR区有miR-543的候选结合位点;5.荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-543能结合Egr1的3’UTR;6.qRT-PCR实验结果显示,Egr1在曲格列酮刺激和miR-543抑制物同时作用时升高,在PPAR-γ抑制物和miR-543模拟物同时作用时降低;7.酶联免疫吸附实验结果显示,Col1蛋白表达变化和Egr表达变化一致。
参考文献：
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[2]. 缺氧诱导因子-1α及其相关信号通路促进瘢痕疙瘩形成的作用机制研究[D]. 雷睿. 浙江大学. 2017
[3]. 促纤维化细胞因子与瘢痕疙瘩[J]. 陈晓栋, 张国成. 国外医学.皮肤性病学分册. 2002
[4]. Duffy抗原趋化因子受体（DARC）在瘢痕疙瘩成因中的作用[D]. 陈莹. 南方医科大学. 2014
[5]. 胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体在瘢痕疙瘩中的表达[D]. 郭帅. 华中科技大学. 2006
[6]. 瘢痕疙瘩发病机制初步探讨：siRNA沉默成纤维细胞PTGS2基因表达的实验研究[D]. 魏斌. 中国协和医科大学. 2008
[7]. BMP-7与TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表达及意义[D]. 刘杜鹃. 吉林大学. 2013
[8]. β-1，4半乳糖基转移酶-I与瘢痕疙瘩胶原合成的初步研究[D]. 杨圣菊. 南通大学. 2007
[9]. 瘢痕疙瘩形成中TLR4、7与Smad信号通路的相关性研究[D]. 曾碧薇. 浙江大学. 2012
[10]. 长链非编码RNA-UCA1通过miR-18a靶向YAP1调控乳腺癌曲妥珠单抗耐药[D]. 朱华宇. 中国人民解放军空军军医大学. 2018
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