（射洪县人民医院肿瘤科 四川 遂宁 629200）
【摘要】目的：建立结肠癌sw480耐奥沙利铂细胞系(sw480/L-OHP),并研究生物学特性。方法：应用人结肠癌细胞系sw480，以反复诱导、逐渐递增奥沙利铂(L-OHP)浓度的方法，体外培养建成sw480/L-OHP。用CCK-8法进行细胞增殖实验检测其多药耐药性；RT-PCR检测抗凋亡基因survive、多药耐药基因MDR1的表达水平；Western blot检测P-糖蛋白、MRP1的表达。结果:sw480/L-OHP对奥沙利铂耐药，并对多种抗癌药物产生交叉耐药性；与亲本细胞相比sw480/L-OHP的MDR1、survive的基因表达均显著升高；sw480/L-OHP的MRP1蛋白表达没有明显变化，但P糖蛋白表达显著升高。结论：sw480/L-OHP细胞对奥沙利铂耐药，并对多种化疗药物呈不同程度交叉耐药性特征，具备耐药细胞生物学特性，可用于对人结肠癌耐药机制与逆转等方面的研究。
【关键词】sw480；多药耐药；奥沙利铂；MDR1；MRP1
【中图分类号】R735.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）03-0016-03
Colon cancer drug resistance cell line sw480 / L - the establishment of OHP and biological characteristics research Hu Min. Shehong people's hospital, Sichuan Suining 629200, China
【Abstract】Objective Establish sw480 colon cancer cell line oxaliplatin into resistance (sw480 / L - OHP), and study the biological characteristics. Methods Using human colon cancer cell line sw480, induced by repeated, gradually increasing oxaliplatin into L - (OHP) concentration, the method of in vitro culture built sw480 / L - OHP. Using method of CCK 8 cell proliferation experiment testing the multi-drug resistance; Rt-pcr detection of antiapoptotic gene survive, multi-resistant MDR1 gene expression level; Western blot test P - glycoprotein, the expression of MRP1. Results Sw480 / L - OHP of oxaliplatin into drug resistance, and produce cross resistance to a variety of anti-cancer drugs; Compared with parental cells sw480 / L - OHP MDR1 gene expression were significantly elevated, survive. Sw480 / L - OHP MRP1 protein expression was not significantly change, but significantly increased expression of P glycoprotein. Conclusions Sw480 / L - OHP cells of oxaliplatin into drug resistance, and for a variety of chemotherapeutic drugs in different degrees of cross resistance characteristics of drug-resistant cell biological characteristics, can be used to people and reversal of drug resistance in colon cancer.
【Key words】Sw480; Multi-drug resistance; Oxaliplatin into; MDR1; MRP1
结肠癌是常见的消化道肿瘤之一，随着经济发展，生活水平提高，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势。含有奥沙利铂的folfox方案是结肠癌的一线化疗方案，能延长患者的生存期及改善生存质量。但一线化疗失败后，其他二线方案有效率极低，这其中与肿瘤细胞获得性产生化疗耐药性或者本身具有耐药性有关[1]。为了对结肠癌产生化疗多药耐药进一步研究，有必要首先构建结肠癌耐药细胞株。我们选用sw480结肠癌细胞株成功建立sw480/L-OHP细胞株并对其生物学特性进行了研究。
1.材料与方法
1.1 材料
结肠癌sw480细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞研究中心。奥沙利铂（L-OHP）购于美国sigma公司。CCK-8购于上海碧云天生物技术公司。引物合成于上海生工生物工程技术公司。P-gp抗体（sc-73354），MRP1抗体(sc-71600)购于santa cruz公司。
1.2 耐药细胞株（sw480/L-OHP）的构建
测定人结肠癌细胞株sw480的奥沙利铂半数致死浓度(IC50)，以IC50为依据确定构建耐药亚株时所需使用的L-OHP起始诱导浓度。将对数生长期的sw480细胞培养于含0.25 umol/L奥沙利铂的L-15培养液中，让细胞生长并稳定传3代，进入下一浓度0.5 umol/L。采用反复诱导，逐渐提高药物浓度，最终让细胞在2.0 umol/L的药物浓度中稳定生长2～3个月。即为所要构建的耐药细胞株sw480/L-OHP。
1.3 流式细胞仪测定细胞周期分布
取对数生长期的sw480和sw480/L-OHP细胞，用无血清培养24小时同步化，然后用含10%胎牛血清培养基培养24小时，经胰蛋白酶消化、PBS缓冲液洗、加70％乙醇固定4小时4 ℃贮存，加入PI染液冰浴30 min，用BD公司FACsvantage型流式细胞仪分析细胞周期。
1.4 CCK-8细胞增殖法检测耐药指数和交叉耐药性
采用CCK-8法分别检测sw480和sw480/L-OHP细胞对多种化疗药物的敏感性：用酶标仪于450 nm处测定各孔光吸收值(OD值)。抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值。用改良寇式法计算IC50:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4),Xm:lg最大剂量；I:lg(最大剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn:最小阳性反应率。计算耐药指数(IR)=耐药细胞IC50／亲本细胞IC50。
1.5 RT-PCR检测抗凋亡基因survive、多药耐药基因MDR1(abcb1)的mRNA表达
TRIzol一步法提取细胞总RNA，按反转录试剂盒说明操作，合成第一链cDNA,分别对MDR1和survive基因进行扩增，反应条件：预变性95 ℃ 5 min，变性 95℃ 30s，退火温度（见表1），延伸温度72 ℃ 30 s，重复循环32次，最后延伸72℃ 5 min。扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，用Bid-bad凝胶成像系统扫描图像结果并进行分析。
表1 RT-PCR引物及反应条件
Table1 Primer and Reaction condition
1.6 western blot检测P-糖蛋白和MRP1的表达
冰上收集2×107个细胞裂解，应用Bradford法测定蛋白浓度。取100 ug 蛋白样本，60 V恒定电压电泳。待溴酚蓝燃料进入分离胶后，用80 v恒定电压电泳，直到溴酚蓝移动到适当位置。将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人P-gp和MRP1过夜，再加入碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG抗体。室温1小时，用ECL发光试剂盒发光显像。用Bio-Rad成像系统成像并分析。
1.7 统计学方法
应用 SPSS13.0软件对数据进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 CCK-8细胞增殖法检测耐药指数和交叉耐药性
结果显示，sw480/LOHP对奥沙利铂具有显著耐药性；其对ADM、VP-16和 5-Fu具有一定的交叉耐药性。（见表2）
表2 sw480/L-OHP对多种化疗药物敏感性实验结果
Cross-resistance and resistance index of sw480/L-OHP to various anti-cancer agents
2.2 RT-PCR检测耐药基因MDR1(ABCB1)和凋亡基因survive表达水平
RT-PCR结果如图2所示，多药耐药基因ABCB1和抗凋亡基因survive在sw480亲本细胞中有少量表达。随着耐药细胞的建立过程中，随着奥沙利铂的浓度逐渐提高，两种基因的表达也逐渐增高。
图1 MDR1和survive基因RT-PCR结果(The mRNA expressions of survive and MDR1 genes)
2.3 western blot检测P-gp和MRP1蛋白表达水平
结果如图2:亲代细胞中，可以检测到少量的MRP1和P-gp。与亲代细胞相比sw480/L-OHP的MRP1没有明显变化。P-gp的表达增多。
图2 MRP1和P-gp蛋白western blot结果（The expressions of P-gp and MRP1 by western blot）
3.讨论
近年来，有关多药耐药机制的研究是肿瘤研究领域的热点。有报道称与ATP-偶联转运蛋白（P-gp和MRP1）、GSH/GST的高表达、DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的改变有关[2]。特别是ATP-偶联转运蛋白（P-gp与MRP1）研究最多，也被证实与多药耐药的发生发展密切相关[3-4]。P-gp蛋白是被MDR1（ABCB1）基因编码的，位于肿瘤耐药细胞膜上，P-gp的过表达能通过ATP依赖的药物泵介导转运药物，导致抗肿瘤药物转运到胞外，降低肿瘤药物的胞内浓度聚集[5-7]。在肝、肾、肾上腺等其他肿瘤耐药细胞中，P-gp的表达提高与获得性多药耐药有关[8]。
通过CCK-8细胞增殖实验发现sw480/L-OHP不仅对奥沙利铂药物产生了耐药性，而且对其他化疗药物也产生了不同程度的耐药，即多药耐药。RT-PCR检测：凋亡基因survive和耐药基因ABCB1随奥沙利铂作用浓度的增加而表达也逐渐提高。奥沙利铂诱导了这些基因表达增强，survive和MDR1的过表达也进一步促成了细胞耐药性。Western blot检测结果发现P-gp和MRP1在sw480亲代细胞中就少量表达。进一步表明肿瘤细胞天生就具有一定耐药性。经过奥沙利铂诱导以后。P-gp在耐药细胞中表达增加。MRP1没有明显变化，从本实验推测奥沙利铂诱导的sw480/L-OHP细胞株与P-gp表达有关，而与MRP1关系不大。
通过对该细胞株生物学特性的检测，我们证实了耐药细胞株的成功建立。Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、Notch1等信号转导途径在肿瘤发生中起着重要作用，但与耐药的相关性研究较少。后续实验我们希望发现多药耐药基因与信号转导通路之间是否存在某些联系，为多药耐药的逆转找到一条新的途径。此耐药株成功建立为我们下一步研究提供了重要的实验材料。
【参考文献】
[1] Balazs Sarkadi,Laszlo Homolya,Gergely Szakacs and Andras Varadi.Human Multidrug Resistance ABCB and ABCG Transporters: Participation in a Chemoimmunity Defense System.Physiol Rev,2006, 86(4):1179—1236.
[2] 张辉，张有成，王彬，等．结直肠癌中MEK2／ERK信号传导通路的研究.中国普通外科杂志，2004，13(4)：257—260
[3] R Perez-Tomas. Multidrug resistance: retrospect and prospects in anti-cancer drug treatment.Curr Med Chem.2006,13（16）:1859—1876.
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[8] K Mishima ,Y Nariai,Y Yoshimura .Etodolac，a selective cyclo-oxygcnase-2 inhibitor，enhances carboplatin-induced apoptosis of human tongue carcinoma cells by down-regulation of FAP-1 expression．Oral Oncol，2005，41(1)：77—8l.
论文作者:胡敏
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第3期供稿
论文发表时间:2015-6-12
标签：细胞论文; 耐药性论文; 细胞株论文; 基因论文; 蛋白论文; 浓度论文; 药物论文; 《医药前沿》2015年第3期供稿论文;