摘要：食源性疾病是当前食品安全非常关心的一件事之一。加强食源性疾病监测和食品污染检测已成为当务之急。用于检测食源性病原体的传统分离，培养和生化鉴定方法复杂，费时且精度低，无法满足当前对高通量和短时间的要求。特别地，很多种调味材料都很乏味，微生物难以扩增，并且常规方法对病原体的检出率低。多重PCR技术针对性较强，准确度高，操作简单。自使用以来，它已被大量使用在生命科学研究的很多个专业。考虑到该技术的病原体检测方法已在国内外大量使用，就调味品致病菌检测中的多重PCR使用展开叙述。
关键词：调味品；致病菌；多重PCR
引言
当前，关于病原菌的多重PCR检测的研究较多，主要集中在两种类型的问题上。首先是测试样品中尽可能多的病原体。第二项研究对病原体进行了分类或追踪。然而，因为传之前的产物分析和检测的局限性，同时多组分PCR分析的优点尚未完全实现。鉴于此问题，在之前的分析中，使用了可以富集多种病原菌的浓缩液，提高了各种病原菌的检出限，进而在一定程度上使得检出病原菌的数量增加。现在，伴随着高通量检测和检测准确性的发展，多重PCR慢慢的不依靠富集培养。这种多重PCR技术更适合于检测各种高盐和高糖样品（例如调味品）中的多种病原体。
1.多重ＰＣＲ的概念及原理
多重聚合酶链反应（MPCR），也称为多重引物PCR或复合PCR，是在传统PCR技术基础上开发的一种新的PCR扩增技术。这种反应的反应原理，试剂和试剂除了在同一反应系统中添加两个或两个以上引物，分别扩大各种模板以获得不同的靶片段外，操作过程与普通PCR相同。该方法不仅保留了之前PCR方法的特殊性和针对性，而且减少了操作步骤和试剂使用的剂量，在一定程度上对检测效率进行了大幅度提高，使得检测的人力，物力和财力在一定程度上减少。自从Chamberlian等人于1988年首次提出这一概念以来，多重PCR技术已大量应用于核酸诊断的许多领域，主要包含基因敲除分析，基因突变和基因多态性分析。多重PCR反应能够在同一时间对多种病原体进行检测和鉴定，在临床混合感染的鉴别诊断中有着非常明显的优势和广泛地使用价值。
2.多重ＰＣＲ在食品病原微生物检测中的应用
对病原体的常规方法诊断主要包括细菌培养，细胞培养，电子显微镜，核酸杂交，酶联免疫吸附法和聚合酶链反应。然而，这些检测方法的缺点是检测周期长，灵敏度低，价格高，技术要求高，工作量大并且仅检测单个病原体。在实际应用中很难在短时间内进行处理。大样本。多重PCR反应灵敏，快速，适合大规模检测，可同时鉴定多种病原微生物。
2.1沙门氏菌检测
目前，用于多重PCR检测的细菌主要是肠道致病细菌，包括链球菌，大肠杆菌，布鲁氏菌和沙门氏菌。川崎等使用多种PCR方法同时检测食品中的沙门氏菌，李斯特菌和大肠杆菌o157：h7，并使用upb（通用预培养基）作为富集培养基来检测富集后的敏感性。唐玉德等设计了4对沙门氏菌特异性引物，优化了多种PCR扩增条件和样品处理方法，分别测试了61株沙门氏菌菌株，14株非沙门氏菌菌株和模拟样品。，敏感性和可行性。已建立的多个PCR测试的结果表明，所有沙门氏菌菌株均能够传播清晰且特定的预期条带，但未检测到非沙门氏菌菌株。每个反应的灵敏度平均为100cfu。食品中沙门氏菌的最低检测量为10cfu，检测时间为8-9h。与培养方法相比，阳性符合率为100％。狄辉等鉴定了三种病原体的特异性基因，包括志贺氏菌ipah基因，沙门氏菌inva基因和变形杆菌atpd基因，并利用报道的基因和序列比对设计引物并优化反应条件。建立了三种病原菌的多重PCR检测系统，以确定该方法的特异性和敏感性。结果表明，建立的多重PCR方法的灵敏度为102cfu / ml，人工模拟样品的灵敏度为103cfu / ml。最初建立了一种用于检测食品中志贺氏菌，沙门氏菌和变形杆菌的同步，简单，快速和灵敏的三重PCR方法。为食品卫生检验检疫，病原菌的监测和监督提供了一种可行的方法。
2.2病原性弧菌的检测
在某些沿海环境或海鲜中，会发生多种感染，例如霍乱弧菌，副溶血性弧菌，创伤弧菌，模拟弧菌和溶藻弧菌。尽管一些学者针对上述病原体弧菌构建了多种PCR检测方法，但可以同时检测和区分上述五种重要病原体弧菌的检测方法。减。王琦等设计了针对霍乱弧菌ompw基因，副溶血性toxr基因，vulnificus vvha基因，v。奇异VMH基因和algolyticus gyrb基因的特异性引物作为靶基因。弧菌的多重PCR检测。评价结果表明，特异性为100％，霍乱弧菌，副溶血性弧菌和模拟弧菌的检出限为100cfu / ml。创伤弧菌和溶藻弧菌的检出限为1000cfu / ml，多重PCR的检出率明显高于传统的分离培养法（56％vs 17％）。姜应红等。通过扩增霍乱弧菌（vc），副溶血性弧菌（vp）和单核细胞增生性李斯特菌（lm）的特定核酸片段，建立了vc，vp和lm。在多重PCR方法中，相应的扩增片段分别为588、450和234bp。该方法特异性强，灵敏度高，简便快捷，可同时检测上述病原菌。接种食品的检测灵敏度达到103cfu / ml。
2.3其他菌株的检测
毕水莲等建立了快速检测弓形虫，弓形虫和弓形虫的多重PCR方法。在16个鸡标本中，检测到7个样品中的弓形虫，3个样品中的弓形虫和1个样品中的弓形虫。本实验建立的多重PCR方法操作简单，检测周期短，特异性高，灵敏度高，可同时检测和监测鸡的弓形虫，弓形虫和弓形虫。徐小科等设计了耐热核酸酶基因nuc，纤维蛋白原结合蛋白基因clfa和smai限制性片段特异性序列的引物，并建立和优化了葡萄球菌的检测方法。金黄色葡萄球菌（SA）多重PCR系统。作者建立的多重PCR方法可以特异性，快速地检测出sa。
3.案例分析
3.1样品
样品编号为15-1，15-2，每个测试样品包含一个小瓶，小瓶中包含冻干的白色细菌球。本次评估共有2个样本。
3.2试剂和仪器
营养液，中间体菌液，MacConkey琼脂（MAC），曙红蓝琼脂（EMB），三糖铁（TSI）琼脂，抗生素生化试剂盒，无菌双蒸馏水以上试剂均采用北京路桥。北京卓诚威胜公司生产的5种腹泻大肠杆菌DNA提取试剂盒，多重PCR试剂盒，实时荧光PCR试剂盒均采用实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD），凝胶成像仪（BIO-RAD），电泳。
3.3测试方法
按照GB4789.6-2016《国家食品安全标准□食品微生物学□大肠杆菌感染试验》 开始试验。
3.3.1样品前处理和预样品待处理
样品放回室温，无菌打开瓶盖，将瓶中的白木耳完全溶解于50ml无菌生理盐水中作为样品。
3.3.2无菌取25 mL样品，加入225 mL营养肉汤的无菌袋中，摇匀。营养肉汤浓缩液在36℃下放置18 h（延长浓缩时间）。取1 mL（增加样品量），植入于30 mL肠杆菌肉汤管中，42℃升高18 h。
3.3.3分离富集液划线于MAC和EMB琼脂平板上，36℃升高24 h，观察菌落特性。
3.3.4生化鉴定挑选平板上10个可疑菌落，接种TSI斜坡。同时分别植入蛋白胨水，尿素琼脂（pH 7.2），KCN□肉汤和营养琼脂平板，36℃培养24 h。
3.3.5 PCR确证试验使用
1μL植入环是用于刮擦营养琼脂板的殖民地，200年暂停μL消毒蒸馏水，充分分散的悬浮细菌，离心机在13000 r / min 3分钟，和上层的填充。添加50μL完全动摇混合核酸提取，维持在100°C的金属浴10分钟，离心机在13000 r / min 3分钟，取上层清液，2μL作为模板PCR检测。
4.结果分析
4.1平板分离结果结果如下：
4.2可疑菌落生化鉴定结果如下
注：“-” 表示无生长，“+” 表示生长。10个可疑菌落生化结果相同。
4.3 可疑菌落PCR验证试验结果如下
注：“-”表示无条带或曲线，“+” 表示有条带或曲线。
5.结语
多重PCR技术在调味品致病菌中的检测有着非常明显的有点，多重PCR技术的应用在一定程度上和调味品的安全有着非常大的影响。多重PCR技术在调味品的大规模使用，能够满足食品安全检测的需要。
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论文作者:陈家杰
论文发表刊物:《基层建设》2019年第25期
论文发表时间:2019/12/4
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