王玮[1]2001年在《鸡传染性支气管炎病毒新疆分离株S1基因分子克隆及其重组鸡痘病毒表达载体的构建》文中研究表明为研究新疆IBV的分子流行病学的背景及遗传背景，发展有效地新型的疫苗，我们从新疆乌鲁木齐市爆发传染性支管炎的鸡群中分离出一株病毒，通过电镜观察、动物回归实验及血凝特性研究等实验确定为鸡传染性支气管炎病毒（IBV-XJ_3）。用RT-PCR扩增出了IBV-XJ_3的免疫原基因S1，将其克隆到pUC19载体中，经蓝白斑筛选、酶切鉴定、PCR鉴定筛选出重组阳性质粒。经测序后，用软件GENERUNNER、CLUSTAL X及TREEVIEW，与GENEBANK中选出的IBV的8株国外参考株，5株国内分离株的序列进行遗传变异分析发现：IBV-XJ_3与8株国外参考株的同源性均小于80％，与国内株JX/99/01的同源性达87％，与国内疫苗株QX同源性达96％，与其他国内分离株同源性均小于80％，证实IBV-XJ_3为不同于国外参考株的变异株。在此基础上，我们构建了IBV-XJ_3S1基因的鸡痘病毒表达载体，为今后基因工程疫苗的研制打下了基础。
田浪[2]2009年在《禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究》文中研究说明禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗,对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上,本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测,筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段,构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因,将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法,构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒,并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究,为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位(主要是中和抗原表位)和T细胞表位(主要是CTL抗原表位),同时结合文献研究报道,共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7(S1:24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA;S2:1-65AA;N:1-120AA、N:290-410AA)。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5'端引入Kozak序列,3'端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序,分析表明,构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析,成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因,分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等,国内外未见报道,该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料,为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立,以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化E.coli Rosetta,采用IPTG进行诱导,研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达,Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件,确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L,诱导时间为3 h,诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板,筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL,抗体最佳稀释度1∶40,酶标二抗(HRP标记兔抗鸡IgG)最佳稀释度1∶3000,血清样品阴阳性临界值为0.133,建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究,表达产物有良好免疫反应活性,建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,该方法安全、灵敏度高(血清稀释度可达1∶300)、特异性强,优于常规的IBV抗体检测方法,国内外未见报道,为IBV抗体的检测提供了新的方法。3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1、pVAX1、VR1020中,构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3.1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒,检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性,国内外未见报道,为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。4、采用本课题组获得专利(专利授权号为200410081443.4)的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒,将纯化的重组质粒溶液(1mg/mL)与脂质体溶液(10mg/mL)等体积混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,21日龄加强免疫一次,二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效价,二免后五周用IBV强毒攻击测定免疫保护率;同时对pVAX1-F疫苗免疫组不同时间的质粒分布及整合可能性进行了检测。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～21d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着(P＜0.01),但组间差异不显着。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组在免疫后7～28d,与pcDNA-F单独免疫组相比差异均显着(P＜0.05)。ELISA抗体效价结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～28d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着(P＜0.01),但组间差异不显着。质粒pcDNA-F分别与禽IL-1β、IL-2、IL-18共同免疫组在免疫后14～28d,与pcDNA-F疫苗组相比差异均显着(P＜0.05)。攻毒结果表明,pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗组的保护率分别为80%、80%和75%,前两者优于常规灭活疫苗(75%)。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组的保护率分别为85%、90%和85%,表明禽IL-2的免疫增强效果优于IL-1β和IL-18。病理切片观察DNA疫苗免疫鸡群的肾脏正常、无病理变化。疫苗质粒分布及整合安全性检测结果显示,pVAX1-F免疫接种后24h,在血液和所有检测的组织中检测到质粒,免疫后90d可在心、脾、肺等组织检测到质粒;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象。本研究研制了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的DNA疫苗,研究表明该多表位嵌合DNA疫苗能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫,免疫鸡攻毒保护率为80%,高于常规IBV灭活疫苗(75%);与禽IL-2分子佐剂共同免疫鸡群的攻毒保护率达到90%;该多表位嵌合基因DNA疫苗安全性好,未检测到与宿主基因组整合的现象。本论文开展的禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究,在国内外未见报道,该研究为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。
贺秀媛[3]2002年在《鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究》文中进行了进一步梳理细菌、病毒等所产生的生物性毒物对机体的代谢、繁殖机能有着重要的影响，目前对细菌毒素的研究比较透彻，已经上升到分子水平，特别是通过病原微生物全基因组序列的测定，使人们从更高层次上把握病原微生物的致病机理及其规律成为可能。到目前为止，已完成了近10个细菌全基因组序列的测序工作，更多细菌的全基因组序列正在进行中。细菌全基因组序列测序工作的完成将给人类分析和研究编码细菌毒性蛋白的毒力基因、认识和阐明毒性蛋白的毒理带来新的机遇。而对病毒这方面的研究相对滞后，为了探讨病毒对细胞、组织的毒性作用及其毒理，分析病毒基因组中主要结构基因在致病和免疫中的功能，研制阻断病毒与细胞融合的药物及其有效的疫苗，为其防制提供全新的思路，就必须以基因组的分析为基础。本研究首先分离鸡传染性支气管炎病毒我国地方流行毒株(IBV-LX4)，然后进行形态学和生物学特性的鉴定并进行蚀斑纯化。在此基础上，根据国内外已发表的IBV基因序列，分别设计特异性引物，应用不同引物进行反转录合成cDNA，分片段对IBV的主要结构基因进行PCR扩增，并分别将各个目的片段克隆到pUC19载体上，在大肠杆菌DH5α中实现目的基因的分子克隆，经蓝白斑筛选、限制性内切酶分析、PCR鉴定，筛选出重组阳性质粒，并对各个目的基因片段进行序列测定，从而获得IBV主要结构基因全序列。通过计算机分析软件，对我国IBV地方流行毒株LX4的主要结构基因全序列、分子特征及遗传变异进行分析比较，并初步分析预测传染性支气管炎病毒主要结构蛋白上可能存在的T细胞和B细胞表位。实验结果表明： 1．生物学特性：鸡胚尿囊液经离心、磷钨酸负染后，电镜观察该病毒为典型的冠状病毒；该毒株的第一代尿囊液对鸡胚无肉眼可见的致病作用，当继代到第5代后，胚体严重病变；病毒在鸡胚中随着接种时间的延长，其效价增高，96h可达到48h的2倍；该毒株可在CEF上生长，但不能形成明显的蚀斑；经1％胰酶处理后可凝集鸡红细胞；鸡胚的第四代尿囊液病毒回归动物体，病死鸡肾脏呈典型的花斑肾，腺胃则未见肉眼可见的病变。证明分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。 2．S1基因：其全序列共1614bp(从起始密码子ATG到S前体蛋白裂解位点)，编码537个氨基酸，其氨基端有一编码18个氨基酸的信号肽序列，第12～13位氨基酸残基构成了信号肽的切割位点，14～19位与111～124位氨基酸残基为S1蛋白的跨膜区域。S1蛋白中含有19个高度保守的潜在的糖基化位点及17个半胱氨酸。同源分析结果显示不同毒株S1基因均存在基因缺失、基因替换和基因插入等变异现象。S1基因除与QX的亲缘关系较近外，与其它参考株的同源率均低于80％，可能为一株国内流行性的变异株。 3．S2基因：核苷酸序列全长2023bp，编码625个氨基酸，包含完整的阅读框架，其中SZ C端约560—595位之间的35个氨基酸高度疏水，216～232位氨基酸残基与412～417位氨基酸残基为其另外的两个跨膜区。SZ基因序列中含有 19个半肤氮酸，13个糖基化位点。在 SZ与 SI交界处的切割序列为 HANRR。SZ N端第一个氨基酸为色氨酸（Ser），C端 560～587为一山正电荷组成的区域，古有两个长的 a－螺旋。SZ较为保守，其变异主要表现为点突变，且C端比N端的保守程度更大。与其他毒株之问核昔酸序列的同源性为幻％－引％，氨基酸序列的同源率为86％～N％。 4．A／I基回。序列全长678hi，，编码：125个氨基酸，包含完整的阅读框架，含有两个糖基化位点，9个高度保守的半肤氨酸，25～35位、52～95位之间的氨基酸残基为其两个跨膜区域，35～45位与88～98位之间的氨基酸残基为其两个信号肽，41位、92位氨基酸处为信号肽的切割位点。问源分析发现不问毒株间M基因存在着缺失、插入、及点突变等变异现象，且5”末端易发生变异，3”木端较为保守；与其他毒株 IBV M 基因核昔酸序列的同源性为 85％－100％，氨基酸序列的同源性为83％～100？／o。 5．N基因：全序列为1230hp，编码409个氨基酸，包含完整的开放阅读框架。其变异主要表现为基因缺失、基因替换和基因插入，且变异没有集中区域的高变区。与其他毒株间（除V18／91外）核昔酸序列的同源性为85％～99％，氨基酸序列的同源率为83％～91％。 综合以上实验结果，本实验得出以下结论： l）生物学实验证实国内地方分离株 I．X4为鸡传染性支气管炎病毒。 幻首次克隆并测定了我国地方分离株LX4的主要结构基因核合酸序列，实验证实编码纤突蛋白巧）、膜蛋白 ＊）和核蛋白＊）的基因均存在基囚插入、缺夫与点突变现象，而SZ基因仅表现为点突变。 3）各结构基因的变异程度不同，纤突蛋白SI基因的变异最大，纤突蛋白SZ的变异次之，膜蛋白基因最为保守，其N端前42位氨基酸较易变异，C端更为保守。核蛋白中间比两端保守。基于SI基因高变区（前500m）。整个引基因、N基因的基因分型结果是一致。 4）LX4株纤突蛋白裂解位点处氨基酸的组成为 Hll］ll；UI，这种序列的毒株不同于已报道的其它传染性支气管炎病毒。 引首次预测了其主要结构蛋白
王晶钰[4]2006年在《鸡肾型传染性支气管炎病毒陕西分离株N、M和S1基因的分子遗传变异研究》文中认为传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是鸡的一种急性、高度传染性的病毒性呼吸疾病,以气管啰音、咳嗽和打喷嚏为特征畛跞衔狪B主要是幼鸡的一种疾病,但后来发现该病在育成鸡和产蛋鸡群中也普遍存在。IB可引起鸡的增重和饲料报酬降低,参与混合感染引起气囊炎使肉鸡在加工过程中被淘汰,引起产蛋鸡的产蛋率和蛋品质量下降,该病的高度传染性和传染性支气管炎病毒众多的血清型,使免疫预防复杂化并增加了防控成本。因此具有重要的经济意义。传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)是冠状病毒科(Coronariyidae)冠状病毒属(Coronavirus)的成员,其基因组RNA由大约27 600个核甘酸组成,全序列已被克隆和测序。IBV粒子含有纤突糖蛋白(S)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N) 3种主要结构蛋白。S蛋白由S1和S2两种糖蛋白组成,血凝抑制(HI)抗体和大部分病毒中和(VN)抗体由S1诱导产生。20世纪60年代和70年代,美国和澳大利亚就报道了明显不同于已知Mass血清型的几种IBV血清型。此后,在亚洲和欧洲也发现了多个新的IBV血清型。近年来,我国IBV分离株大多为肾变型,主要分离株为肾型变异株,给免疫防控带来了很大困难。因此,对肾型IBV分离株的致病性和分子生物学特性进行测定,特别是对肾型IBV分离株的主要结构基因N、M、S1的遗传变异进行研究,将对我国IB的免疫预防等起到推动作用。作者针对肾型IBV分离株,主要进行了以下研究:1.对陕西省流行的肾型IBV进行了分离鉴定。从陕西省20个发生呼吸道疾病的病鸡场中分离到18株病毒。通过鸡胚感染,HA试验,干扰NDV试验,耐酸碱试验,电镜观察,血清学鉴定,证明其中13株是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。动物感染试验及EID50试验发现,8个IBV分离株(BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG)具有很强的嗜肾性,可引起感染鸡肾肿大,呈花斑样,肾小管和输尿管有尿酸盐沉积。血清中和试验表明,IBV分离株的血清型与W118毒株相同,而与IBV H120、H52和W93株有一定的差异。2.用RT-PCR对8个肾型IBV分离株的N基因进行了扩增,均获得1160bp左右的目的条带,与预期相符。8个分离株的N基因测序后与GenBank登录的7个IBV参考毒株的N基因比较发现,部分IBV陕西分离株N基因与参考毒株的同源性在85.5%～87.3%,差异性较大,说明我国IBV地方分离株N基因变异有不断加大的趋势,氨基酸推导序列表明,N蛋白突变以散在的点突变形式为主,其变异特点与组织嗜性无明显相关性。系统进化分析表明,WH、YX、YL株与参考毒株Ark99及Gray在同一进化分支上,差异较小;BJ、WG、G株3个毒株则形成一个独立的进化分支,与我国疫苗毒株W93、H120及其他参考
杜元钊[5]2003年在《新城疫—禽流感H9二联灭活疫苗的研究》文中进行了进一步梳理自1998年秋冬始于河北省石家庄地区的低致病性禽流感(LPAI)爆发,传播速度很快,短期内即成燎原之势,在近一年的时间里已波及到包括我国主要养禽地区的20多个省、市、自治区。经鉴定各地分离的毒株主要为H9N2亚型。这次全国范围的大流行,已历经数年,至今尚未平息。发病种鸡群和蛋鸡群损失严重,产蛋率下降10-60%不等,个别鸡群甚至绝产；育雏鸡、育成鸡及肉鸡也可感染发病,表现呼吸道症状,受害鸡群死淘率急剧上升,根据鸡群并发和继发感染及饲养管理状况的不同,死淘率在10-80%之间,一般在20%左右。近年来我国部分地区的禽流感血清学调查发现,H9亚型阳性群占禽流感阳性鸡群总数的93.89%,进一步说明这种禽流感的广泛性和严重危害性。基于上述情况,我国迫切需要针对H9亚型的禽流感疫苗,用于控制日益严重的H9亚型禽流感在我国的大范围流行。目前我国新城疫发病流行也非常严重,有时与H9亚型的禽流感病毒混感,给养鸡业造成更大损失。同时基层养鸡户防疫频繁,应激反应大,免疫程序难以制定,急需一针防两病的鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗。我们在成功研究出禽流感(H9亚型)灭活疫苗基础上,又研制出鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗。一、禽流感(H9亚型)灭活疫苗毒种的筛选培育和鉴定在1998-1999年期间,我国主要养禽地区5个省、市鸡群分离鉴定出8株H9N2亚型禽流感病毒(AIV),进行了系统的常规生物学和分子生物学特性鉴定,从中筛选、培育出对鸡胚的毒力稳定、产生的毒价高、免疫原性强、交叉保护性好的F株(A/Chicken/Shanghai/F/98)作为研制疫苗的候选毒株F株基因组全长序列测定和各基因的遗传分析表明,其HA、NA、M和NS4个基因均属于CkBj94分支,同源率分别为96.7%、96.4%、97.5%和98%。1、在1998-1999年期间从我国主要养禽地区5个省、市有产蛋下降的产蛋鸡群和有呼吸症状及超常死亡的鸡群分离8株AIV(F、S、A1、H1、D1、D2、J1、J2),初次分离时鸡胚死亡时间36-60小时,HA滴度22-24不等,血清亚型鉴定均为H9N2亚型,4周龄SPF雏鸡致病性试验确定均为低致病性。2、测定了这8个毒株的主要保护性抗原HA基因的全长序列,由其推导的氨基酸序列同源性在95%以上,在HA基因遗传发生树上这些毒株与CkBJ94一道形成一个独特的分支,提示有共同来源；8株病毒的交叉HI试验、交叉鸡胚中和试验和雏鸡交叉保护试验均表明,它们之间能提供交叉保护。3、在8株病毒中,选择初次分离时毒价高、鸡胚死亡时间一致的F株在SPF鸡胚中连续继代培育,第5代(E5)时鸡胚液病毒滴度达HA210,至第10代(E10)时HA滴度大于210。经系统鉴定,它对鸡胚的毒力稳定,(90%以上鸡胚在接种后72-96小时内死亡),产生病毒的滴度高(HA大于210),免疫原性强(7日龄SPF鸡免疫后HI滴度>5log2),交叉保护性好,具有优良的疫苗毒株特性。4、通过RT-PCR和51/31RACE法扩增、各片段克隆测序和序列拼接,得到了F株的基因组全长序列,8个基因长度分别为PB12341bp、PB22341bp、PA2233bp、HA1742bp、NP1565bp、NA1458bp、M1027bp、NS8906bp,并对各基因进行遗传分析,其HA、NA、M、NS4个基因均属于CkBJ94分支,同源率分别为96.7%、96.4%、CkBj94株。二、鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的研制和生产用新城疫LASOTA株和H9N2亚型AIV F株为毒种,经实验室研究、田间试验、中间试制和区域试研制出对不同品种和年龄的鸡安全而免疫效力高的新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗,可以达到与各自单苗具有相同免疫效果。已取得了国家新兽药证书和农业部颁发的生产批准文号,累计生产应用2亿羽份以上,产生了巨大的经济效益和社会效益。1、使用Millipore超滤浓缩机的4#膜浓缩新城疫和禽流感抗原,各浓缩1/2-1/3,测定HA效价,NDHA>1024,AIHA>512,按1：1比例配苗。2、二联苗效力试验表明,叁批疫苗每羽份新城疫分别含有127、131和127PD50,达到英国兽药典每羽份≥50PD50的要求。禽流感的免疫抗体水平及攻毒保护均达到单苗的要求。免疫鸡日龄太小(小于10日龄),鸡体免疫应答反应较差,效力检验最好采用3-4周龄易感鸡。3、抗体产生时间试验表明,无论免疫剂量多大,疫苗免疫后前4天都测不出抗体,免疫后7天,抗体开始缓慢上升,11天后,抗体上升加快,至21天基本达到高峰。免疫剂量大的,抗体继续上升；免疫剂量小的,抗体滴度就不再上升。相同剂量免疫时,免疫鸡日龄越小,抗体上升越慢,上升幅度越小。攻毒试验表明,免疫后11天攻毒,只有部分免疫鸡被保护,14天攻毒时,大部分免疫鸡保护,21天后方能完全保护。免疫剂量与免疫期试验表明,在一定免疫剂量范围内,免疫保护期与免疫剂量成正相关。免疫剂量偏低时,免疫保护期短；免疫剂量大时,免疫保护期适当延长。二联苗的免疫剂量和免疫期分别定为：商品肉鸡5日龄免疫,0.2m1/羽,出栏前免疫一次；蛋雏鸡和种雏鸡开产前免疫2次,14日龄首免,0.2m1/羽,可保护至60日龄,50-60日龄二免,0.5m1/羽,可保护至开产；或于21-30日龄免疫一次,0.5m1/羽,也可保护至开产。产蛋鸡开产前免疫一次,0.5m1/羽,可保护整个产蛋期。4、中间试制：在易邦公司生物制品GMP车间共试制10批次总量为540万羽份,成品检验全部合格。5、区域试验在江苏、山东、天津、河北等省、市的数十个养禽企业进行区域试验,共免疫800余万羽,临床保护率接近100%,取得很满意的效果。叁、H9亚型禽流感发病机理研究：与大肠杆菌联合感染的致病协同作用用H9N2亚型AIV和禽源性大肠杆菌进行联合感染实验研究,结果发现两者之间有强烈的致病协同作用：AIV(H9N2亚型)单独感染症状轻微,不死亡或死亡率很低,但是与禽源性大肠杆菌,甚至是低致病性的大肠杆菌联合感染均可发生严重死亡,病变出现早、恢复慢且更为严重。1、H9N2亚型AIV和禽源性大肠杆菌联合感染时能产生致病协同作用：AIV单独感染(105.17ELD)时死亡率为6.25%,大肠杆菌(037)单独感染(3x107CFU)时死亡率为62.5%,联合感染时死亡率为81.25%。这种致病协同作用在低致病性的禽源大肠杆菌和AIV之间更为显着,单独感染和联合感染的死亡率分别为20.0%、13.3%和100%。2、H9N2亚型AIV和禽源大肠杆菌联合感染SPF鸡的动态病理变化：单独接种的两组接种后1-96小时内无死亡,联合感染组死亡率为24%：联合感染组死亡率为24%；联合感染组大体病变和显微病变比单独接种的两组出现得早、恢复慢且更为严重。
刘昕[6]2006年在《鸡传染性支气管炎病毒国内分离株CK/CH/LDL/97 Ⅰ的分子特性》文中指出自1995年以来，我国一些地区相继发生了一种以鸡体慢性消瘦，腺胃严重肿大，腺胃乳头出血、溃疡为特征的疾病，给养鸡业造成了巨大损失。为了研究中国IBV分子流行病学的背景及遗传变异背景，为了在分子水平上探讨IBV组织嗜性变化的机理。我们把鸡传染性支气管炎中国地方分离株“致腺胃病变型”毒株CK／CH／LDL／97Ⅰ作为研究对象，应用RT-PCR方法扩增了CK／CH／LDL／97I株的病毒基因组3′的结构蛋白(S，M，N，E)基因和非结构蛋白(3a，3b，5a，5b)基因，并进行克隆、序列测定和遗传变异分析。同时将IBV CK/CH／LDL97Ⅰ／97株通过鸡胚连续传115代致弱成一株免疫原性良好的疫苗株(备注：F115的鸡胚传代由本实验室荣骏弓研究员完成)。通过比较鸡胚传代毒第5代(F5)和第115代(F115)的致病性，以期揭示鸡胚传代致弱过程中致病力变化的规律。实验结果表明如下： 1．基因组的分子特性：CK／CH／LDL／97Ⅰ从S基因5′端到N基因3′端的核苷酸序列由6868个核苷酸组成，部分基因组序列分析表明CK／CH／LDL／97Ⅰ具有典型的禽冠状病毒S-3-M-5-N基因顺序。CK／CH／LDL／97ⅠS基因开放阅读框3501个核苷酸组成，编码一条1167个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由541和626个氨基酸残基组成。S基因推导氨基酸裂解识别位点序列为精氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-精氨酸(RRTGR)。CK／CH／LDL／97Ⅰ与参考毒株的S1基因序列比较发现，CK／CH／LDL／97Ⅰ与国内“腺胃病变型”分离株Q1(99.1％)、J2(98.9％)、T3(98.90％)的氨基酸同源性都很高。其氨基酸系统发育进化树分析发现，CK／CH／LDL／97Ⅰ与Q1、J2、T3属一个基因群；S2基因较S1基因保守，其变异主要表现为点突变：N基因ORF由1230核苷酸组成，无碱基的缺失与插入，但存在点突变，编码409个氨基酸，N基因进化树显示，CK／CH／LDL／97Ⅰ单独组成一群；M基因ORF由681个核苷酸组成，编码226个氨基酸，M基因进化树表明CK／CH／LDL／97Ⅰ的亲缘关系与国内毒株SD／97／02、CK／CH／LSHHF03较近；基因3序列分析表明ORF3a由174个核苷酸组成，编码57个氨基酸，ORF3b由195个核苷酸组成，编码64个氨基酸，ORF3c由309个核苷酸组成，编码102个氨基酸：基因5序列分析表明ORF 5a由198个核苷酸组成，编码65个氨基酸，ORF 5b由249个核苷酸组成，编码82个氨基酸，基因5进化树与M基因一致。以上结果表明：CK／CH／LDL／97Ⅰ属于我国近年出现的一种新的基因型IBV。 2．鸡胚传代与免疫致病力的变化：对F5和F115鸡胚半数感染量的测定结果表明，此病毒随着鸡胚传代次数的增加对鸡胚致病性逐渐增强。用鸡胚传代毒F5和F115分别接种15日龄SPF雏鸡后，结果显示，F5和F115对SPF雏鸡致病性差异很明显。F5接种的鸡群发病率为100％，死亡率为10％；F115接种的鸡群发病率和死亡率均为0％。从病毒分离检测结果看，F5和F115均能在鸡的上呼吸道中复制，F5接种的鸡群的上呼吸道带毒时间为15d左右；F115接种的鸡群的上呼吸道带毒时间为9d左右。从血清抗体检测结果看，F5与F115均能刺激机体产生血清抗体，SPF鸡对F5与F115感染均能产生良好的体液免疫应答，但循环抗体的滴度与抗感染力缺乏相关性。结果表明：CK／CH／LDL／97ⅠF115代鸡胚适应毒已经致弱，但具有免疫原性。可作为疫苗候选毒株。
参考文献：
[1]. 鸡传染性支气管炎病毒新疆分离株S1基因分子克隆及其重组鸡痘病毒表达载体的构建[D]. 王玮. 新疆农业大学. 2001
[2]. 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究[D]. 田浪. 四川农业大学. 2009
[3]. 鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究[D]. 贺秀媛. 西北农林科技大学. 2002
[4]. 鸡肾型传染性支气管炎病毒陕西分离株N、M和S1基因的分子遗传变异研究[D]. 王晶钰. 西北农林科技大学. 2006
[5]. 新城疫—禽流感H9二联灭活疫苗的研究[D]. 杜元钊. 南京农业大学. 2003
[6]. 鸡传染性支气管炎病毒国内分离株CK/CH/LDL/97 Ⅰ的分子特性[D]. 刘昕. 新疆农业大学. 2006
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